文摘
背景。评估改善砷trioxide-loaded PLGA纳米颗粒(如2O3-PLGA-NPs)人类血管平滑肌细胞(HUVSMCs)体外。方法。作为2O3-PLGA-NPs合成和透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)和能量色散谱(EDS)和累积释放率2O3-PLGA-NPs测定体外;HUVSMCs被处理2O3-PLGA-NPs体外。MTT实验,流式细胞术(FCM)进行的实验研究的抑制作用2O3-PLGA-NPs HUVSMCs和与之相比2O3溶液在不同浓度。光学显微镜用于观察HUVSMCs接受的形态变化2O3-PLGA-NPs。bcl - 2的表达,伯灵顿,MMP-9 HUVSMCs检测通过rt - pcr和免疫印迹(WB)。结果。EDS证实准备纳米颗粒中含有砷的元素。的洗脱支架的表面涂层2O3与我们的self-prepared -PLGA-NPs具有相同的特征2O3-PLGA-NPs,而且它还有一个药物缓释特征。与对照组相比,细胞增殖和迁移细胞显著抑制浓度( ,分别)。与此同时,在浓度2O3-PLGA-NPs抑郁mRNA bcl - 2蛋白的表达和MMP-9伯灵顿的mRNA和蛋白表达增加。结论。作为2O3-PLGA-NPs对HUVSMCs有抑制作用的扩散和迁移,它可以通过调节伯灵顿,bcl - 2,和MMP-9表达式在体外。
1。介绍
虽然经皮冠状动脉介入治疗(PCI)中扮演一个重要的角色在冠状动脉疾病的治疗,仍有支架再狭窄的风险(1]。血管平滑肌细胞(VSMCs)是一个关键部分内膜的增厚的支架内再狭窄(ISR) (2,3]。砷的化合物是天然物质,可以有效地抑制急性早幼粒细胞白血病(APL) [4]。相关研究表明,三氧化二砷(2O3)对其他类型的恶性肿瘤治疗效果(5- - - - - -7]。作为2O3可以有效地抑制细胞增殖,已广泛应用于临床实践。的剂型2O3提出了(8,9]。药物封装在纳米材料可以有效地提高药物稳定性、耐用性和生物安全释放,减少药物降解。Polylactic-co-glycolic酸(PLGA)是一种合成的共聚物聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PLGA)。大量的实验研究证明,PLGA生物医用高分子材料是一种重要的具有良好的生物降解性和生物相容性。它不会引起明显的炎症反应,免疫反应和细胞毒性反应10]。PLGA已通过美国食品和药物管理局(FDA)的物质注射药物、纳米粒子、植入物,和其他准备工作,广泛用于药物传递系统的研究。因此,我们选择PLGA作为药物载体。在这项研究中,我们准备了三氧化二砷(2O3-)加载PLGA纳米颗粒(如2O3-PLGA-NPs),他们的一般属性和调查2O3生物活性和评估的影响2O3-PLGA-NPs在人类血管平滑肌细胞的增殖和迁移(HUVSMCs)。澄清HUVSMCs细胞凋亡诱导的分子机制trioxide-loaded PLGA纳米粒,伯灵顿的表达、bcl - 2,和MMP-9检查。
2。材料和方法
2.1。材料
作为2O3,Triblue DEPC HRP-labeled山羊anti-mouse二级抗体,免疫球蛋白和5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromide (MTT)由σ公司(美国)。HUVSMCs,从Sciencell购买公司(美国),保持在平滑肌细胞培养基(SMCM也由Sciencell公司提供)。lamv逆转录酶核苷酸,益生元(dT) 18日Taq DNA聚合酶,RNasin,核糖核酸酶DNase我自由,和100 bp的DNA分子量标记从豆类购买生物技术公司(日本)。GENMED-Bradford蛋白质浓度定量工具购买从制药技术公司(上海,中国)。相对抗体是由ZSGB-BIO工程总公司(中国,北京)。
2.2。的准备,2O3-PLGA-NPs及其特点
参照我们之前的研究,我们准备好了2O3-PLGA-NPs [11,12]。经过10μl悬挂吸气,用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM),能量色散谱(EDS)和计算机色彩魔力图像分析系统观察特征。
2.3。测定药物加载和封装的比例2O3
适量的2O3在4°C -PLGA-NPs胶态悬浮体的加入。在15000 R / min离心后30分钟,沉淀与去离子水清洗三次,和上层清液混合。沉淀是冻结在真空中获取冻干粉,然后,一定量的去离子水被用来解决体积。的数量是2O3在沉淀(W1)和自由2O3在合并后的上清液(W2)氢化物发生原子荧光光谱法测定,和2O3在 ,的总量 。纳米颗粒的药物加载和截留效率是按照下列公式计算(WPLGA是数量的PLGA添加):
2.4。体外释放试验
5毫克的2O3-PLGA-NPs准确称重和分散在最后一卷5毫升生理盐水,然后,在预防透析袋密封。袋子是沉浸在一个锥形瓶包含30毫升生理盐水与恒速搅拌(50 r / min) 。样品被同时点1日,2日,3日,4日,5日,6日,7日,8日,9日,10日,11日,12日,13日,14日和15天,分别。同时,相同数量的(1毫升)版本中添加的内容来确定2O3在发布解决方案,和时间的曲线和累积释放浓度了。
2.5。细胞培养
HUVSMCs SMCM中维护和培养在37°C的5% ( )有限公司2的气氛。HUVSMCs在对数生长阶段被实验。
2.6。MTT试验
HUVSMCs被播种在96孔板每口井的5000个细胞,24小时孵化后,被不同的方法治疗1 - 5 d如下:(1)负对照组(SMCM), (2) 1μmol / L,2O3(3)1μmol / L,2O3-PLGA-NPs, (4) 3μmol / L,2O3(5)3μmol / L,2O3-PLGA-NPs, (6) 6μmol / L,2O3和(7)6μmol / L,2O3-PLGA-NPs;然后,20μl MTT(5毫克/毫升)添加和继续培养4 h (37°C, 5%的公司2)。最后,150年μl添加DMSO和震动了10分钟。吸光度是使用分光光度计测量492海里。使用下列公式计算细胞生存能力的百分比(副总裁)13]:
2.7。流式细胞术分析
细胞治疗24小时四个不同的组织如下:(1)负对照组(SMCM), (2) 1μmol / L,2O3-PLGA-NPs, (3) 3μmol / L,2O3-PLGA-NPs, (4) 6μmol / L,2O3-PLGA-NPs;24小时后,细胞被收集和清洗在寒冷的PBS (pH值0.1米,7.2 - -7.4)三次,resuspended和固定在70%乙醇在4°C在黑暗中10分钟。根据协议设备的测量细胞凋亡,细胞凋亡率每组由流式细胞仪检测。
2.8。抑制作用的2O3-PLGA-NPs HUVSMCs迁移是由Transwell室实验
对数HUVSMCs选择,2O3-PLGA-NPs与不同浓度(不含血清)被添加到实验小组,达到最终的浓度为1μmol / L, 3μmol / L, 6μmol / L,培养基添加到空白对照组。200年μl细胞悬液接种于Transwell插入(孔隙大小是8μ米),然后,参议院是放入文化孔;细胞培养12小时;平滑肌细胞迁移到subventricular过滤膜表面在显微镜下拍摄和计算。5细胞在大功率领域被从每个样本。
2.9。检测bcl - 2、Bax和MMP-9 RT-qPCR表达式
NP加入HUVSMCs浓度达到最终的管理3μmol / L和6μmol / L;SMCM被添加到组中。经过72小时的文化,总RNA提取试剂盒。伯灵顿的引物序列,bcl - 2, MMP-9 RT-qPCR反应和参考GAPDH基因被列在表中1,设计和合成了Sangon生物科技(上海)有限公司,有限公司IQ5TM检测和分析的数据表达的实时PCR检测系统和2- - - - - -ΔΔCt。
2.10。检测bcl - 2、Bax和MMP-9表达式通过免疫印迹(WB)
NP加入HUVSMCs浓度达到最终的管理3μmol / L和6μmol / L;SMCM被添加到组中。经过72小时的文化,HUVSMCs每组的细胞溶解和每组的总蛋白提取。实际的总蛋白浓度从每组中提取的决心;总蛋白为每个样本(50μg)是由10% sds - page凝胶电泳和免疫印迹,扫描通过凝胶成像系统,图像被Gel-pro32保存和分析;结果表达的OD值。
2.11。统计分析
显示的数据 ,与对照组的差异的重要性是服从泊松分布和方差分析方差分析; 意味着不同的是统计学意义,统计过程完成后由SAS8.1和SPSS17.0统计软件。
3所示。结果与讨论
3.1。NP的一般特征
准备的NP是乳白色胶体。没有分层沉积在4°C 12 h。NP有轻微的分层24小时后,可以悬浮稳定超声处理后1分钟。
3.2。电子显微镜观察
超声分散后,准备NP是由透射电子显微镜观察(图1(一))和扫描电子显微镜(图1 (b));这是近圆,有一定的电子密度,分散的球体。的平均粒径NP准备在这个实验中计算 通过使用CMIAS98A图像分析系统。
(一)
(b)
(c)
3.3。EDS检测
扫描电子显微镜下几个视觉领域选择,和NP的组件被能量分散能谱法(图分析1 (c));可以看出,它包含的组件,C,和O;重量百分比含量为3.25% (wt %)和原子百分比含量(%)为0.72%。因此,它可以证实,NP已经成功地准备。
3.4。动态的测定结果2O3释放PLGA NPs
NP的体外动态发布调查与盐水介质;药物的累积释放率达到72.37%和96.82%的第四天,逐步进入第15天平台阶段(图2)。
3.5。MTT结果
的增长率2O3与不同浓度和NP (NP) HUVSMCs被列在表中2。在实验中发现,既是2O3和NP可以抑制HUVSMCs的生长并产生一定的细胞毒性和显示一个明显的时间和浓度的关系( )。MTT结果表明,后6μM NP治疗3天,在HUVSMCs的增殖有抑制作用,而其毒性是最少的。相关数据表所示2。
3.6。流式细胞分析仪检测结果
流式细胞分析仪的检测结果显示,细胞凋亡率的NP干预组显著增加( ),和细胞凋亡率随着药物浓度的增加逐渐增加。在图所示的数据3。
3.7。Transwell细胞迁移试验的结果
Transwell结果显示NP干预组的入侵细胞数量明显减少( ,图4),NP抑制HUVSMCs迁移以浓度依赖方式。
3.8。检测相关的由RT-qPCR mRNA的表达
与对照组相比,bcl - 2和NP MMP-9基因干预组显著降低,而伯灵顿基因显著增加( ,图5),显示出显著的浓度效应关系。
3.9。由世行检测相关的蛋白表达
与对照组相比,bcl - 2和MMP-9蛋白NP干预组显著降低,而伯灵顿蛋白显著增加( ,图6),显示出显著的浓度效应关系。
3.10。讨论
在这个实验中,引用我们的先前的研究,乳化蒸发技术被用来准备NP,乳液的机械搅拌或乳化溶剂制备的两个非混相阶段。内部相溶剂被蒸发,球形材料沉淀和凝固成微球。内部分散相溶剂必须有一定的外部连续相的溶解性和波动性。在缓慢搅拌条件下,内部分散相溶剂扩散到外部阶段,传输到液面,挥发到空气中。extraction-volatilization-extraction过程是重复的,所以内部分散的载体材料相沉淀形成胶囊,和微球药物被包裹在其中,直到完全治愈。在这个实验中,有机相PLGA /二氯甲烷的解决方案2O3,水相一定浓度的PVA水溶液;后两个阶段喜忧参半,乳液是由磁搅拌;与二氯甲烷的逐步撤消通过蒸发,球形纳米材料沉淀,冻干nanomicrospheres形式。
目前,认识到ISR形成的机制是一个关键部分的损伤引起的过度增殖和迁移VSMCs内膜除了弹性收缩和血管舒张后血栓形成的血管壁。因此,寻找药物抑制VSMC的增殖和迁移的研究已成为一个热点话题ISR (14]。在这个实验中,NP和的影响2O3不同浓度的HUVSMCs进行了研究。在倒置显微镜下,HUVSMCs处理后3μmol / L,2O324 h,细胞开始起皱,和细胞数量显著减少。NP和MTT测定结果2O3HUVSMCs显示不同浓度的NP是一个持续的释放系统具有良好的生物相容性和也有抗潜力。作为2O3和NP对经济增长的抑制作用的HUVSMCs——浓度。MTT检测结果显示效果的2O3HUVSMCs进入平台舞台上第三天,但抑制作用2O3相同浓度的细胞在进入平台期几乎是一样的NP在4天累计药物释放率为72.37%。这可能是与纳米颗粒的物理和化学性质有关。纳米尺度的材料加工时,由于量子尺寸效应,小尺寸效应,表面效应,纳米粒子将显示特殊的物理、化学和生物学性质,这使得纳米粒子有一些新的特点和功能(15,16]。进一步研究NP的机制抑制HUVSMCs的增殖和迁移,相关蛋白检测。
bcl - 2基因家族是最重要的相关基因。bcl - 2基因能够抵抗化疗药物诱导细胞凋亡。伯灵顿是一种同源蛋白bcl - 2的,它不仅可以生产均聚物也产生异质二聚体与bcl - 2,从而消除antiapoptosis bcl - 2基因的影响;在这方面,它可以促进细胞凋亡;另一方面,它也可能削弱upregulation bcl - 2(端粒酶活性的17- - - - - -19]。在这项研究中,结果显示bcl - 2、Bax表达在HUVSMCs NP干预后明显改变,表现出显著的浓度效应关系。推断,NP诱导细胞凋亡可能与bcl - 2、Bax密切相关。
矩阵metalloprotease(基质金属蛋白酶)介导基底膜和细胞外基质降解和细胞迁移20.,21]。此外,MMP-9是基质金属蛋白酶的重要成员,是一个关键的部分降解的胶原蛋白VI和其他基质蛋白在基底膜22]。在这个研究结果显示MMP-9 NP干预后被显著地抑制基因和蛋白质,这可能与NP HUSAMCs迁移的抑制效应。
4所示。结论
总之,NP是理想的缓释制剂,可延长的有效作用时间2O3在血管平滑肌细胞和抑制细胞生长和诱导细胞凋亡在体外。也讨论了NP抑制增殖和迁移的分子机制HUVSMCs可能意识到通过调节bcl - 2的表达,伯灵顿,MMP-9。这个新剂型有望成为药物涂层表面的药物洗脱支架在未来,它提供了新的理念和方法在支架再狭窄的临床预防和治疗。
数据可用性
图和表的数据用于支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究支持了江苏卫生委员会的综合医学研究项目(M2020062)和管理员项目江苏省中医医院(Y17010)。