纳米表面目标并杀死循环肿瘤细胞而排斥白细胞

文摘

血性的转移,癌细胞迁移的过程主要通过血液到远端位置,通常会导致一个贫穷的病人预后。科汉解释说Selectin蛋白质保持承诺在提供含药人们在血液中循环肿瘤细胞(ctc),由于其快速、force-dependent绑定动力学。然而,挑战提供这样的人们,同时避免有毒影响健康的血细胞,尽可能多的掌握配体与selectins胶着地互动。在此,我们描述纳米表面捕捉流动癌细胞,同时防止人类中性粒细胞粘附。超小型电子管表面固定化埃洛石纳米管(HNTs)和E-selectin功能化脂质体阿霉素(ES-PEG L-DXR)的数量显著增加乳房腺癌MCF7细胞捕获从流,然而也显著降低了中性粒细胞的数量。中性粒细胞坚定地坚持和预计伪足表面涂脂质体,而中性粒细胞粘附HNT-liposome表面保持圆的形态。灌注MCF7细胞和中性粒细胞主要导致癌细胞粘附HNT-liposome表面,并诱导显著癌细胞死亡。这项工作表明,纳米表面由HNTs和ES-PEG L-DXR可以增加CTC招聘化疗交付,同时防止健康细胞粘附和吸收CTC的治疗目的。

1。介绍

血性的转移通常信号患者预后差,超过90%的癌症死亡归因于转移性传播(1]。转移发生,肿瘤细胞脱离原发肿瘤,入侵穿过基底膜,intravasate末梢循环的循环肿瘤细胞(ctc) [2]。CTC表达sialylated碳水化合物配体表面可以黏附地与selectin蛋白质内皮细胞发炎墙上,导致selectin-mediated CTC拘束和连绵起伏的内皮,其次是公司粘附和逮捕[3]。ctc可以溢出来组织一个远端器官形成二次转移,虽然ctc生存这一途径的比例很小(< 0.01%),这种转移的形成仍是癌症相关死亡的主要原因4,5]。

目前使用一些化学疗法治疗癌症,包括阿霉素,在用卡波济氏肉瘤的治疗,急性白血病,转移性乳腺癌和其他淋巴瘤和肉瘤6]。阿霉素是一种阿霉素蒽环霉素抗生素通过DNA夹层可以诱导肿瘤细胞死亡,抑制拓扑异构酶II,和自由基的形成7,8]。然而,阿霉素的非特异性的影响很多,并包括系统性毒性、组织坏死,中性粒细胞减少,心肌病(9,10]。纳米生物导致新药物运载工具的发展提高阿霉素的效率,同时降低其毒性作用,如聚合物、聚合物、脂质体(11]。脂质体阿霉素(特别是L-DXR)已经被证明可以提高整体药物功效通过改变药物动力学,增加循环时间,减少非特异性毒性作用[12- - - - - -14]。聚乙二醇(PEG)结合到脂质体表面提供了空间稳定和增加循环时间的药物也可以帮助肿瘤吸收由于增强渗透性和保留的影响(14,15]。L-DXR的功效已被证明在临床上就是明证Doxil,已被FDA批准用于治疗卡波济氏肉瘤(16]。然而,目前L-DXR配方缺乏针对机制治疗个人ctc在血液中,由于罕见ctc在健康的血液细胞。ctc的浓度在病人的血液白细胞(大约是一百万分之一17)或十亿分之一的健康血液细胞(18]。

细胞粘附分子称为selectins持有承诺在靶向药物运载工具ctc生理剪切流,由于其快速、force-dependent绑定动力学(19,20.]。Sialylated碳水化合物配体表达许多ctc的表面上,它有能力结合selectin蛋白质在发炎内皮转移(21- - - - - -23]。针对ctc的血液通过selectin-mediated粘附能减少转移的概率。然而,健康的循环白细胞也表达sialylated碳水化合物配体表面(24]。因此,策略来减少健康血液细胞粘附是ctc selectin-mediated目标所需的治疗。

发展纳米表面增强化疗交割的ctc的捕捉而防止健康细胞粘附还没有被调查。这里,我们评估了应用纳米表面组成的埃洛石纳米管和纳米L-DXR增加癌细胞招聘时防止白细胞粘附。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

结直肠恶性腺瘤细胞系科罗拉多州205 (ccl写明ATCC # - 222)和乳腺癌MCF7细胞腺癌行(写明ATCC没有。HTB-22)从美国购买类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。科罗拉多州1640年RPMI 205细胞培养介质补充10% (v / v)胎牛血清和1% (v / v) PenStrep,所有从英杰公司购买(美国纽约大岛)。MCF7细胞培养在鹰的最低基本培养基(EMEM)补充0.01毫克/毫升牛胰岛素,10% (v / v)胎牛血清,和1% (v / v) PenStrep,所有从英杰公司购买。所有癌症细胞系在湿润条件下孵化37°C和5%的公司₂融合,不允许超过90%。

2.2。中性粒细胞隔离

中性粒细胞分离(如前所述)(25]。简而言之,人类外周血获得健康献血者知情同意后通过静脉穿刺和使用无菌收集heparin-containing钠管(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。中性粒细胞被离心分离血液在480 g×50分钟23°C,在马拉松8 K离心机(费舍尔科学,宾夕法尼亚州匹兹堡,美国)使用互译多晶型物(准确的化学与科学公司,韦斯特伯里,纽约,美国)。中性粒细胞在Mg提取并清洗^{2 +}和Ca^{2 +}无汉克的平衡盐溶液(hbs),和所有剩余的血红细胞在悬浮细胞溶解hypotonically。中性粒细胞是resuspended浓度为1.0×10⁶细胞/毫升包含0.5% HSA的哈佛商学院,2毫米^{2 +}玫瑰和10毫米(表达载体),缓冲pH值7.4。

2.3。脂质体阿霉素的合成

纳米脂质体合成如前所述[26]。短暂,脂质干一夜之间和患者使用脂质薄膜水化法(27,28与125毫米)硫酸铵(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。脂质接受了10个冻融循环和挤压空脂质体(EL)做准备。盐酸阿霉素(Sigma-Aldrich)封装在非正常使用硫酸铵远程加载方法,doxorubicin-to-lipid比率为0.2:1 (w / w)。过剩DXR被使用与交联葡聚糖凝胶排阻色谱法G-50 (Sigma-Aldrich)。本文用分光光度法测定脂质体阿霉素浓度(λ= 490海里)。阿霉素决心的装载效率> 95%。

2.4。靶向脂质体制备

E-selectin功能化L-DXR (ES-PEG L-DXR)和E-selectin功能化空白脂质体(ES-PEG EL)准备使用柱技术(29日]。重组体人E-selectin / Fc嵌合体(流值/ Fc)(研发系统,明尼阿波利斯,美国)是硫醇盐和共轭,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-maleimide 2000 (DSPE-PEG_2000年马来酰亚胺)(两代情极性脂质、雪花石膏,美国)。将ES-polyethylene乙二醇(ES-PEG)配合到脂质双分子层,ES-PEG孵化了脂质体在50°C为30分钟。脂质体被储存在4°C < 1星期之前使用。

平均粒径和电动电势的脂质体配方被动态光散射测量,使用莫尔文Zetasizer Nano z(莫尔文仪器有限公司,伍斯特,英国)根据制造商的协议。平均粒径和电动电势测量脂质体配方的相似值之前报道(26]。确定成功E-selectin脂质体表面接合,10μL 490年荧光标记脂质体涨跌互现μL MCF7细胞(10⁶细胞/毫升)和暴露在剪切流在锥板粘度计2.0达因/厘米²10分钟。荧光脂质体坚持测量细胞表面使用一个Accuri C6流式细胞分析仪(Accuri血细胞计数器,Inc .,安阿伯市,美国)。评估荧光脂质体MCF7细胞粘附和内化,剪样本孵化为60分钟37°C,然后使用共焦显微成像。

2.5。共焦显微镜

荧光ES-conjugated脂质体被用来验证selectin-mediated粘附肿瘤细胞。荧光脂质合成使用荧光BODIPY-cholesterol(两代情极性脂质)。细胞培养与2μL 10毫克/毫升三水合三盐酸化物(赫斯特33342年)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 15分钟形象细胞核。细胞被放在玻璃盖玻片和可视化蔡司710光谱共焦显微镜系统(Jena,卡尔蔡司缩微成像GmbH德国)在65 x放大FITC和DAPI过滤器。图像处理使用禅宗2009光版软件(卡尔蔡司缩微成像GmbH)。

2.6。MCF7静态分析

MCF7细胞培养在完成媒体1×10的浓度⁵细胞/毫升12-well板块(美国新泽西州,正欲富兰克林湖)。细胞治疗ES-PEG L-DXR、L-DXR或EL 0到5卷μL 18个小时。MCF7细胞治疗Accutase (Sigma-Aldrich) 5分钟在37°C,去除表面附着的细胞。细胞然后用磷酸盐缓冲盐水洗(PBS)在1000 rpm冷冻离心机(爱兰歌娜XX-22R离心机;美国贝克曼库尔特,沥青,CA)和resuspended的新媒体。4天后,细胞生存能力评估在血细胞计数器(美国haus科学,霍舍姆PA)用台盼蓝排斥试验(Lonza Wilkersville,医学博士,美国)。0.5细胞也被接受μL脂质体的解决方案和评估可行性的1 - 4天。细胞形态和阿霉素的吸收成像使用brightfield和荧光显微镜,分别。

2.7。癌症细胞和嗜中性粒细胞准备捕捉实验

与Accutase MCF7科罗拉多州和205个细胞治疗(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)处理前5 - 10分钟。MCF7和科罗拉多州205细胞被洗在PBS和resuspended浓度为1.0×10⁶细胞/毫升,在流缓冲区包含0.5%的哈佛商学院HSA, 2毫米^{2 +},10毫米玫瑰(表达载体),缓冲pH值7.4。嗜中性粒细胞捕获实验,刚分离中性粒细胞在流缓冲resuspended浓度为1.0×10⁶细胞/毫升。结合细胞捕获化验,MCF7或科罗拉多州205细胞与中性粒细胞在流缓冲resuspended 1: 1癌症细胞中性粒细胞比率,在浓度为1.0×10⁶细胞/毫升。

2.8。HNT-Liposome表面功能化

Microrenathane超小型电子管(布伦特里科学,布伦特里,妈,美国)内径300μm是55厘米长,用75%乙醇洗净。准备HNT-coated超小型电子管表面,6.6%的体重HNT解决方案(NaturalNano,罗切斯特,纽约,美国)是通过声波降解法治疗,其次是过滤(26]。超小型电子管是用蒸馏水清洗,其次是孵化与2:8 poly-L-lysine (0.1% w / v,σ)5分钟然后孵化HNT治疗解决方案3分钟。超小型电子管被清洗用蒸馏水彻底去除多余HNTs在一夜之间,解决方案和被孵化沿表面固定化脂质体是通过孵化E-selectin功能化脂质体溶液(ES-PEG L-DXR或ES-PEG EL)为2.5小时内HNT-coated超小型电子管。表面光滑的超小型电子管是由固定化脂质体在HNTs的缺失。所有表面被封锁的非特异性粘附1 h和5%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich) PBS (w / v)。孵化所有步骤之前,紧随其后的是彻底的清洗与PBS。固定化E-selectin蛋白被激活之前细胞捕获实验通过灌注高钙流缓冲区。

2.9。捕获实验

可视化细胞粘附和捕获,功能化超小型电子管的舞台上获得了奥林巴斯IX81机动倒置显微镜(奥林巴斯,中心山谷,PA,美国)。一个电动注射泵(KDS 230;IITC生命科学,森林山、钙、美国)被用来散布细胞悬浮液通过超小型电子管生理相关流速。癌症细胞灌注和细胞结合的解决方案最初通过超小型电子管0.008毫升/分钟的速度(壁面切应力的0.5达因/厘米²)30分钟,然后0.04 mL / min(壁面切应力的2.5达因/厘米²),另一个30分钟。孤立的中性粒细胞在0.04 mL / min灌注60分钟。超小型电子管与高钙洗PBS 1.0达因/厘米²删除所有不依从细胞。Accutase温柔地灌注到超小型电子管,允许为10分钟分离附着细胞孵化,紧随其后的是灌注介质的细胞集合。结合细胞化验,中性粒细胞被离心分离癌细胞使用互译细胞收集后多晶型物。细胞培养在6-well板块完成媒体和分析细胞生存能力在第四天通过台盼蓝排斥。

2.10。数据采集

细胞的视频捕获实验记录使用microscope-linked日立CCD相机KP-M1AN(日立、日本)和索尼(Sony) DVD录像机dvo - 1000 md(索尼电子Inc .)、圣地亚哥、钙、美国)。利用视频帧确定被捕获细胞的数量每100000人μ米²。结合细胞实验中,癌症细胞和嗜中性粒细胞捕捉测量基于细胞直径的差异决定的。

2.11。形状因子分析

Brightfield中性粒细胞捕获的图像在平滑和HNT-coated管进行了分析使用形状因子分析形态学变化。轮廓的中性粒细胞从阈值创建brightfield使用边缘检测函数图像在Metamorph软件(通用成像Corp .)、西切斯特,PA,美国)。中性粒细胞形态变化在Metamorph使用形状系数测定项目,形状因子是由: 在哪里P周长,一个的面积是对象(中性粒细胞)。形状系数接近于1的值对应于一个圆,而值接近0代表细长的或树突的形状。

2.12。统计分析

数据集进行了策划和分析使用Prism 5.0 b为Mac OS X (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。所有结果被报道的意思平均数标准误差。小动物——一张长有配对t以及用于比较两组。P值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果与讨论

3.1。ES-PEG L-DXR目标和在乳腺癌MCF7细胞诱导细胞死亡

评估的功能E-selectin共轭的脂质体表面,荧光标记的ES-PEG L-DXR与人乳腺癌MCF7细胞孵化和剪切锥板粘度计10分钟2.0达因/厘米²。MCF7细胞已被证明在ES-coated表面,这一过程是由CD24表达MCF7细胞表面(30.]。MCF7细胞剪切与荧光ES-PEG L-DXR增加荧光> 99.9%,相比MCF7细胞剪切与荧光脂质体缺乏E-selectin(图1(a))。共焦显微镜显示ES-PEG L-DXR不仅与肿瘤细胞表面结合,而且随着时间的推移在细胞内(图内在化1(b)),使这个目标的内化机制适合ES-PEG L-DXR内癌细胞。静态分析验证细胞吸收和细胞毒性的ES-PEG L-DXR水平与L-DXR(数字1(c)和1(d))。MCF7细胞要么L-DXR(图处理1(g))或ES-PEG L-DXR(图1(h))可见膜起泡,non-adherent MCF7细胞死亡的特征。MCF7细胞治疗EL(图1(f))附着并显示形态类似于健康、治疗MCF7细胞(图1(e))。荧光显微镜证实比较阿霉素MCF7细胞吸收处理L-DXR(图1(k))和ES-PEG L-DXR(图1(左)),而控制样品在阿霉素(数据的缺失1(我),1(j))。显然从这些图片E-selectin粘附细胞表面不妨碍内化L-DXR于MCF7细胞和细胞毒性的影响,使这种定位机制适合MCF7待遇生理流。

3.2。纳米表面增强MCF7和科罗拉多州205细胞粘附ES-PEG L-DXR

我们实验室曾表明,selectin蛋白质和selectin-coated纳米粒子可以固定在超小型电子管的内部表面的捕获循环细胞(31日),以及用作在体外微脉管系统的模型检查白细胞粘附[滚32和肿瘤细胞33]。在这项研究中,平滑的超小型电子管被涂上一层只有ES-PEG L-DXR。HNT-liposome-coated超小型电子管被涂上一层HNTs,其次是ES-PEG L-DXR固定。MCF7灌注或科罗拉多州205细胞通过超小型电子管在剪切应力(0.5 - -2.5达因/厘米²)中观察到的微脉管系统在活的有机体内(34]。细胞系都选为模型ctc因为他们表达sialylated碳水化合物配体和展览滚动固定化E-selectin表面粘附性能30.,35]。MCF7细胞捕获从流在两个光滑的(图2(一))和HNT-liposome-coated超小型电子管(图2(b))。然而,MCF7细胞数量的增加捕捉到HNT-liposome表面,而光滑的表面。一个重要的MCF7三倍增加(图2(c) 205年科罗拉多州)和两个褶皱增加细胞捕获(图2(d)) / 100000μ米²观察HNT-liposome-coated表面,而光滑的表面涂有ES-PEG L-DXR。HNT-coated超小型电子管之前显示增加selectin蛋白质的吸附(36相比,吸附selectins在超小型电子管HNTs的缺失。很可能HNT涂料还可以提高沉积ES-PEG L-DXR,这可能会增加流动癌细胞的招聘。

3.3。纳米表面减少中性粒细胞粘附ES-PEG L-DXR

虽然HNT-coated表面可以提高化疗的交付通过selectin-mediated附着力ctc,同样重要的是,要检查这些表面相互作用的影响健康的血细胞。白细胞表达sialylated碳水化合物配体,在数量上超过ctc的大约一百万病人,平均(37]。因此,白细胞可以吸收大多数,如果不是所有的封装化疗。然而,捕捉化验表明,中性粒细胞的数量坚持HNT-liposome-coated表面(图3(b))在很大程度上减少而光滑的表面(图3(一)),相反的趋势中观察到癌细胞捕获的研究。类似的趋势也在隔离的ctc暂停单核细胞(38]。显著减少> 94%的中性粒细胞/ 100000μ米²确认在HNT-liposome-coated超小型电子管,而光滑的超小型电子管涂ES-PEG L-DXR(图3(c))。

细胞骨架预测称为伪足持续观察中性粒细胞坚持光滑的表面,坚定地坚持和激活中性粒细胞(图的特征3(一))24]。中性粒细胞HNT-liposome-coated表面显示圆形态,较弱的休息中性粒细胞的粘附(图的特征3(b))。形状因子分析曾被用来评估(中性粒细胞形态的变化26)并进行研究,以确定粘附的影响HNT-liposome-coated表面形态的变化。在0(细长形状)到1(循环),形状因子分析验证一个形状系数明显高于中性粒细胞坚持HNT-liposome-coated表面(图3(d)),而那些坚持光滑的表面,增加了进一步支持中性粒细胞显示弱HNT-liposome-coated表面附着力。

检查如果减少中性粒细胞粘附是由于预防ES-PEG L-DXR吸附于表面,ES-PEG L-DXR荧光标记,并固定在光滑和HNT-coated超小型电子管。然而,荧光显微镜证实,ES-PEG L-DXR固定在光滑(图4 (b))和HNT-coated超小型电子管(图4 (c)),而控制超小型电子管在缺乏荧光ES-PEG L-DXR(图4(一))。因此,减少中性粒细胞粘附造成无法预防ES-PEG L-DXR吸附。

3.4。HNT-Liposome表面捕获肿瘤细胞和排斥中性粒细胞从细胞的混合物

使用HNT-liposome-coated CTC捕获从一个表面结合细胞悬液是评估通过灌注的1:1肿瘤细胞和中性粒细胞/ liposome-coated表面。中性粒细胞和MCF7细胞被确定基于大小;细胞15μ米直径或更少被确认为中性粒细胞,而细胞大于15μ被确认为MCF7或科罗拉多州205细胞。灌注后中性粒细胞和MCF7细胞,中性粒细胞的数量被减少HNT-liposome-coated表面(图5(b))而光滑的表面(图5(a))。同时,增加MCF7细胞捕捉观察HNT-liposome-coated表面(图5(b)),而光滑的表面(图5(a))。两个MCF7(图的数量5科罗拉多州(c))和205(图5(d))细胞捕获HNT-liposome-coated表面显著增加,与中性粒细胞显著减少捕获(图5(e))。

3.5。HNT-Liposome表面诱导肿瘤细胞死亡在癌症细胞和中性粒细胞的混合物

能够成功地将阿霉素癌细胞内结合细胞悬液被捕获细胞的清除和收集评估从表面,从中性粒细胞分离癌细胞,并放置到文化生存能力测试。中性粒细胞,寿命较短在活的有机体内通常接受细胞死亡在体外隔离后18-28小时内(39],显示,生存能力微不足道的差异是否捕获在超小型电子管或直接放置到文化在隔离(没有显示)。为期四天的潜伏期后,brightfield显微镜证实,尽管MCF7细胞捕获在光滑的表面附着并显示健康的形态(图6(a))。然而,MCF7细胞捕获HNT-liposome-coated表面non-adherent并显示重要膜起泡细胞凋亡(图的特征6(b))。MCF7细胞捕捉到光滑的表面表现出最小的阿霉素吸收基于荧光图像(图6(c)),而MCF7细胞捕获HNT-liposome-coated表面增加阿霉素吸收(图显示6(d))。细胞生存能力化验证实doxorubicin-induced细胞死亡,显著降低MCF7(图6(e))和科罗拉多州205细胞生存能力(图6(f))当捕捉到光滑管涂ES-PEG L-DXR,控制相比,光滑的表面涂上了ES-PEG EL。然而,可行MCF7和科罗拉多州的数量205个细胞捕获HNT-liposome-coated表面显著降低,而可行的细胞捕获的数量在光滑的表面上。类似的趋势观察之前205年KG-1a和科罗拉多州细胞捕获从溶液组成的癌细胞(26]。这些结果说明联合HNTs表面和ES-PEG L-DXR可以起到双重作用:(1)交付化疗ctc和(2)减少与化疗白细胞粘附和交互,从而减少有毒副作用在健康的血细胞。

4所示。结论

这里,我们已经展示了一种技术利用细胞粘附分子提供治疗ctc而积极预防血液细胞粘附。ES-PEG L-DXR被证明胶着地与乳腺癌MCF7细胞并诱导细胞死亡。生理流速下,HNT-liposome-coated表面显著增加MCF7捕获和科罗拉多州205年癌症细胞的数量,而光滑的表面涂有ES-PEG L-DXR。相反的趋势发生在健康的血液细胞,中性粒细胞的灌注HNT-liposome涂层表面显著降低捕获细胞的数量。结合解决癌症细胞和中性粒细胞,HNT-liposome-coated表面同时捕获MCF7和科罗拉多州205细胞的数量增加,同时大大降低中性粒细胞捕捉到最低的水平。脂质体阿霉素成功送到细胞MCF7和科罗拉多州205流分析与解决癌症细胞和中性粒细胞。HNT-liposome表面可以增强化疗的应用程序交付ctc和减少转移的概率。此外,这种表面的独特的能力来防止正常血细胞的相互作用可以减少有毒的非特异性作用和显著降低化疗剂量CTC所需的治疗。

确认

这项工作是由美国国家卫生研究院,批准号CA143876。作者承认杰夫Mattison与血液样本收集和捐赠的招聘工作。

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