朊蛋白引起的DNA顺序相依凝结

文摘

不同的研究表明朊蛋白诱发的杂交互补DNA链。细胞培养的研究表明朊蛋白仍然束缚的痒病对碘氧基苯甲醚的染色体。在目前的工作中,我们使用了一个恶唑染料,溜溜球,作为一个记者定量表征朊蛋白的DNA凝聚。我们观察到朊蛋白诱发更大的荧光猝灭的溜溜球插入DNA只包含GC基地相比,DNA包含四个基地而染料的影响必将DNA只包含在基地是边际。DNA-condensing生物多胺效果低于朊蛋白的淬火DNA-bound溜溜球荧光。朊病毒蛋白诱发的边际淬火的荧光染料绑定到寡核苷酸,抗冷凝。电子显微镜的超微结构的研究也验证了生物物理数据。目标DNA的GC基地可能是负责增加冷凝朊蛋白的存在。据我们所知,这是第一次报告的人类细胞蛋白质诱导DNA顺序相依凝结。凝结的增加GC-rich朊蛋白的DNA可能表明朊蛋白的生物学功能和在其发病机制中的作用。

1。介绍

细胞的朊病毒蛋白, ,是一个主要α螺旋可溶性糖蛋白仍然附着在细胞的外膜通过glycol-phosphatidyl肌醇链接(1- - - - - -3]。蛋白质非传染性的。的生物学作用尚不清楚;然而,蛋白质被认为扮演一个角色在各种细胞功能,包括维护细胞铜浓度、信号转导、RNA绑定和DNA代谢(4- - - - - -7]。β褶板丰富的构象异构体 ,被称为 ,一直被认为是致命的传染病的主要成分等神经退行性疾病传染性海绵状脑病(谢霆锋)及其遗传的海绵状脑病(SE) [1- - - - - -3]。这种疾病发生在人类和动物。疾病同种型, ,低聚物和聚合物与淀粉样蛋白存在抗蛋白酶K消化(PK)被认为是一个指标的生成 。不像细菌和病毒s核酸传播感染,朊病毒疾病被认为是传播的转换通过可以通过模板或发生成核机制(2,8]。多个朊病毒株的存在也被归因于的构象变化 。然而,核酸的存在作为感染的辅助因子可以解释压力[多重性9- - - - - -11]。

原纤维形成的在活的有机体内研究淀粉样蛋白或孤立的仓鼠PrP转换得到的纤维细胞仓鼠已经发现非传染性的转基因小鼠中过表达完整的朊蛋白(12]。然而,淀粉样蛋白形成老鼠截断90 - 231片段的重组朊蛋白(23 - 231氨基酸)在实验老鼠发现传染性overexpressing这种蛋白质片段,也显示了朊病毒疾病的应变特征(13,14]。接种的野生型仓鼠体外生成PK-resistant朊蛋白形成的蛋白质错误折叠已经发现传染性(15]。通过部分将PK-resistant淀粉样隔绝痒病感染大脑仓鼠,它已经表明,最大朊病毒传染性与朊病毒粒子有17-27 nm直径(300 - 600 kDa)而大纤维显示低朊病毒传染性(16]。

尽管大量的信息支持传染病产生的蛋白质,参与慢病毒或核酸朊病毒疾病尚未排除(17- - - - - -19]。有几个作品包括我们之前的数据表明可能参与转换正常细胞的朊病毒的核酸蛋白()对其致病性同种型()[20.- - - - - -22]。核酸,在解决方案和DNA和RNA在体外重组和细胞,可以催化转换来(scrapie-like形式)11,23- - - - - -25]。重组之间的交互和核酸产生的混合物低聚物和线性和球形淀粉类似形态的朊病毒朊病毒感染的大脑中发现的淀粉(23,26,27]。朊蛋白的存在在细胞质中也被观察到28,29日]。朊病毒的确切生物学意义protein-nucleic酸相互作用目前尚不清楚。然而,它是可能的,结构性的转变来可以通过细胞质催化核酸能够发挥作用的朊病毒疾病(30.- - - - - -32]。我们之前的研究表明朊蛋白可以弯曲的小oligo-nucleotides [21],这朊蛋白之间的相互作用——(PrP)核酸是由生物抑制多胺(20.]。它也表明,这种结构性变化朊蛋白的核酸是pH值的依赖22]。

自然多胺也凝结DNA (33),顺序相依DNA凝聚是由金属离子34]。生物学意义,转录因子也不同交互和GC - at富集染色质域(35]。朊蛋白也与GC-rich DNA寡聚物在高阶(24,36]。此外,我们早前的研究还表明,疱疹病毒衣壳蛋白VP19C能够浓缩DNA并形成环状DNA结构(37]。

鉴于上述结果朊病毒蛋白质与核酸的相互作用,我们进行的定量研究朊蛋白与合成dna通过监测染料的荧光性质核酸碱基的插入。我们使用人类重组朊病毒蛋白质,αprp,核酸只有GC序列(gcDNA),只有在序列(atDNA),和一个模型DNA (mDNA)包含的克分子数相等的比例和GC碱基对。我们也使用了27-mer寡核苷酸代表逆转录病毒抑制循环重复的主要部分(38]。有各种DNA插入染料已被用于研究配体诱导的DNA结构改变(39]。在这里我们使用荧光染料YOYO-1碘(溜溜球),这是一个二聚体的不对称花青染料恶唑黄色哟。溜溜球已经被用于研究不同的质粒DNA的冷凝DNA-condensing代理和蛋白质NCp7 [40,41]。由于朊蛋白是基本的,我们比较了朊蛋白诱导结构改变引起的DNA与相同的生物多胺(如精胺和亚精胺)已知DNA-condensing代理(42]。直接的超微结构的研究也进行可视化介子蛋白质的DNA凝聚。电子显微镜的图像表明,gcDNA形成一个高阶球状凝聚结构朊蛋白的存在。因此,在当前的研究中,我们调查了朊蛋白的作用在冷凝DNA的特异性GC-contained及其生物学作用和意义。

2。材料和方法

2.1。质粒构建,蛋白(PrP^C)表达和纯化

完整的重组人类朊蛋白(αprp, 23 - 232氨基酸,val 129)减少形式发表后被孤立的过程被雷et al。43]。净化过程利用八肽重复的亲和力的蛋白质的氨基端部分镍和组氨酸标签的使用避免了(43]。事实上,氨基八肽地区具有高度的亲和力对不同过渡金属离子如镍和铜(43,44]。最终蛋白质浓度测定光密度在280 nm使用56795 M的消光系数值⁻¹厘米⁻¹(20.,22]。净化人类αprp迁移在SDS /页面作为一个物种,估计25 KDa的分子质量。没有任何高分子量的乐队表示分子间二硫键的缺失。蛋白质的身份也证实了质谱分析。强烈反应的蛋白质与单克隆抗体2 d6(从法国国家抗体网络)获得特定人类朊蛋白残留94 - 114 (43]。

截断老鼠朊蛋白跨越121 - 231氨基酸(野生型)隔绝Liemann提供的质粒和Glockshuber使用发布过程45]。估计中的蛋白质sds - page实验表明分子量13.5 kDa。21000的消光系数⁻¹厘米⁻¹在280纳米是用来计算蛋白质片段的浓度(20.,22]。

2.2。DNA结合染料,生物物理实验

染料YOYO-1是从分子探针获得的。从Sigma-Aldrich获得的化学物质和缓冲区。合成gcDNA, mDNA, atDNA组成840年,2658年和3523个碱基对,分别22),并从Sigma-Aldrich购买。的27-mer寡核苷酸序列对应于hiv - 1杆循环的很大一部分地区5′-GACTTGTGGAAAATCTCTAGCATGCAT-3′和其互补链3′-CTGAACACCTTTTAGGATCGTACGTA-5′也从Sigma-Aldrich合成38]。DNA工器是由混合互补的寡核苷酸的克分子数相等的金额(1:1)在10毫米Hepes-KOH (pH值7.5),100毫米氯化钠,MgCl 10毫米₂缓冲区,和杂化冷却缓慢从90°C到20°C / 6小时(46]。所有实验都是在100毫米氯化钠和20毫米消息灵通的缓冲区在pH值7.4。荧光测量进行了日立4500荧光谱仪配备stopped-flow乐器。

2.3。电子显微镜

电子显微镜实验中执行0.1醋酸铵,pH值5在室温下如前所述[47]。监控核酸形态、样品被附加的准备αprp (12μDNA(5米)μM DNA-ph,即。~ 1μg / ml DNA浓度)解决方案在小管。1分钟后孵化,一个液滴(10μl)标本的沉积在碳包覆铜网格之后,吸去多余的滤纸的标本。完全干燥之前,网格是洗2滴1.5% w / v铀酰乙酸酯,然后用蒸馏水洗两次(47]。最后,网格乔尔1010电子显微镜观察(装有Gaton数字显微照片)在80千伏暗场模式。

2.4。统计分析

的滴定(PrP对不同的核酸或DNA与丙烯酰胺/ PrP)实验进行平均五个人集和数据绘制相应的核酸浓度。学生的以及(2尾)被用来比较个别集团的意思。一个0.05被认为是具有统计学意义的价值。所有数据和文本中的值被表示为的意思SD。

3所示。结果

3.1。DNA缩合的动力学αprp使用Stopped-Flow测量溜溜球染料的荧光猝灭荧光光谱

前面研究朊病毒protein-DNA复合物的生成基于电镜超微结构表明球状有序结构的形成表明DNA的凝结47]。进行进一步的研究以评估和量化重组DNA发生凝结αprp。追求这些实验我们用溜溜球,不发出荧光(或边缘)的缓冲区或重组PrP(图1)。的核酸,它显示了高荧光强度结果夹层的染料在DNA碱基对(40]。为了建立必要的时间达到平衡朊病毒蛋白质和核酸相互作用的荧光性能的溜溜球(20海里,这个浓度用于实验)在核酸(1间μM DNA-phosphate,染料DNA-phosphate比1:50,所述Krishnamoorthy等。)41]。在这里,我们研究了溜溜球的荧光强度的降低率在505 nm激动人心的解决方案在485海里。溜溜球的荧光猝灭速率的1.2μ米αprp图所示2。的速度和程度的荧光猝灭gcDNA(跟踪(a))大于那些出现在线粒体dna的存在(跟踪(b))。在这两种情况下,染料的荧光值的平衡达到一个恒定值20秒后反应。荧光猝灭是单相的减少。在类似的实验中αprp没有熄灭的荧光溜溜球(或边际)插入atDNA(跟踪(c))。

3.2。顺序相依DNA凝聚所致αprp

的影响αprp溜溜球的荧光光谱在不同的dna插入数据所示3(一个)- - - - - -3 (c)。在这些数据,跟踪标记(1)代表在gcDNA染料的荧光光谱,线粒体dna,和atDNA的染料DNA-phosphate比1:50(8纳米染料和400 nM DNA-phosphate)只在缓冲区(缺乏蛋白质)。可以看出,在平等的染料DNA-phosphate比率,mDNA包含克分子数相等的数量的和GC碱基对诱发两倍以上染料的荧光强度在505纳米(图3 (b)相比,光谱(1)染料光谱gcDNA(图的存在3(一个)谱(1))和atDNA(图3 (c)谱(1))。肩膀也观察到在发射光谱~ 545 nm atDNA的存在相对更加明显。增加0.6μM和1.2μ米αprp的溜溜球插入dna减少染料的荧光强度在不改变染料的发射最大(光谱(2)和(3)数据3(一个)- - - - - -3 (c))。比较表明,重组朊蛋白(1.2μ米)淬灭了荧光强度gcDNA染料间的线粒体dna,和atDNA大约65年,55岁,分别和10%。

3.3。量化DNA-Structural变化引起的αprp

浓度的增加的影响αprp在不同DNA的结构性能监控的比率溜溜球的荧光强度值绑定到DNA缓冲区没有蛋白()荧光强度值(染料的DNA的蛋白质。结果如图所示4线粒体DNA为gcDNA (A)和(B)在相同的DNA的浓度(400海里)使用染料DNA比保持在1:50。非线性滴定曲线与增加淬火溜溜球的荧光αprp的观察和荧光染料浓度往往高原蛋白质DNA-phosphate比> 3 gcDNA和线粒体dna(数字4(一)和4 (b))。在滴定实验,蛋白诱导的荧光猝灭mDNA的染料相比,gcDNA插入。染料荧光略淬火(~ 7%),蛋白质在atDNA加入染料,仍然几乎不变在更高浓度的蛋白质荧光猝灭~ 70%和55%的染料发生在gcDNA和线粒体dna,分别(图4)。

3.4。n端结构域而不是c端领域αDNA缩合prp负责

朊蛋白包含n端非结构化部分(23 - 120氨基酸残基)是非常基本的和c端球状包含三段121 - 231个氨基酸α螺旋和两个短β链。人类和小鼠的球状121 - 231片段朊病毒蛋白质序列同源性~ 95%。为了评估这种结构化的角色参与核酸的构象变化,我们进行了类似的实验,通过添加不同浓度以上moPrP 121 - 231片段mDNA贴上溜溜球(图5)。的朊病毒蛋白的球状c端域(PrP (121 - 231)) DNA无法改变染料的荧光性质(溜溜球)。指出蛋白质的球状片段DNA结构不产生任何变化,也就是说,无法凝结DNA分子(图5)。相比之下,滴定的结果αprp mDNA(图5)也被证明。溜溜球的结果影响插入在gcDNA moPrP 121 - 231片段的存在都是相同的(数据没有显示)。

3.5。凝结状态的双链寡核苷酸

很明显的结果αprp无法产生重大变化的溜溜球荧光闰atDNA拥有3523个碱基对。自寡核苷酸不到300个碱基对不是由核酸浓缩冷凝剂(48),我们研究了溜溜球荧光的特性间短的寡核苷酸。结果在图6显示的荧光溜溜球插入在27个核苷酸长的寡核苷酸减少相对少量(~ 5%)。

3.6。亚精胺和精胺DNA-Condensing代理

生物多胺、亚精胺和精胺(携带3和4正电荷,resp)被称为DNA结构冷凝剂(42]。可以看出两种胺荧光熄灭的溜溜球间线粒体dna和gcDNA(图7),而精素更有效淬火比亚精胺染料荧光。已经发现,精胺和亚精胺,减少染料荧光的程度更大在gcDNA mDNA(痕迹(1)和(2),职责)。

3.7。DNA缩合程度是衡量的溜溜球

离解的溜溜球的可能性DNA在凝结的朊蛋白也被探索。我们认为任何染料与protein-DNA分离复杂将会出现在大部分溶剂将nonfluorescent和添加新鲜发布的解决方案结合到DNA染色,增加染料的荧光。为此我们使用解决方案包含三倍高蛋白质而gcDNA磷酸盐(图4 ),几乎饱和的冷凝的核酸蛋白质发生。在图8(一个)荧光的强度在整个荧光光谱(1)溜溜球(1μM DNA-phosphate 20纳米染料;染料gcDNA磷比为1:50)在缓冲减少3μ米αprp(频谱(2))。发射的荧光强度最大505海里是下降了50%。增加1μM DNA(磷酸的浓度),这个解决方案的荧光强度增加了30%(频谱(3))。

一个相同的实验进行缓冲。加入相同体积的缓冲了蛋白质实验导致频谱(2)(图8 (b)),表明荧光强度的降低在505 nm ~ 10%。接下来,添加1μM DNA(磷酸)增加了溜溜球的荧光强度(频谱(3))~ 2%。从这些结果,我们得出这样的结论:gcDNA的凝结αprp导致释放的一小部分染料的溶剂从凝聚gcDNA绑定到新添加的DNA,从而增加溶液的荧光光谱(从(2)(3)频谱图8(一个))。从校准曲线发现~ 20%的溜溜球是分离的gcDNA凝结在3μ米的浓度αprp。

3.8。测量的可访问性Interchelated溜溜球作为DNA凝结的程度

DNA碱基的物理状态的变化,也就是说,风险敞口的可能性周围的溶剂的存在αprp,调查监测的可访问性溜溜球的中性荧光弄熄的丙烯酰胺dye-DNA复杂和没有蛋白质的存在(40,41]。这个过程需要监控单个染料分子的财产而不是凝结诱导相互作用DNA-bound YOYO-1分子导致的淬火与染料荧光染料作为观察DNA-phosphate (1: 50)。我们发现,通过使用低染料浓度(染料DNA-phosphate比为1:2000),添加朊蛋白没有淬火染料荧光将来自dye-dye交互(图9跟踪(b))。结果如图所示8在增加蛋白质含量没有淬火YOYO-1荧光设置在该实验条件下gcDNA(跟踪(b))。金属离子感应质粒DNA凝聚有相同的染料DNA-phosphate比率也没有熄灭DNA-bound溜溜球荧光(40]。此外,类似的丙烯酰胺淬火实验进行量化大分子相互作用包括朊蛋白(PrP)和核酸(36]。在此基础上,我们使用的溜溜球DNA-phosphate比1:2000年丙烯酰胺荧光猝灭实验后(图描述10)。相比之下,我们还展示了结果更高的浓度(1:50染料DNA-ph比)的染料(图9跟踪(a);结果从图4跟踪(A))。

溜溜球的接触,因此核酸碱基缩合的存在αprp测定值的比值和 ,在哪里代表了染料的荧光强度间在缓冲DNA或蛋白质的存在是染料的荧光值在DNA或protein-DNA复杂的丙烯酰胺(数据吗10 ()和10 (b))。数据分析是由使用Stern-Volmer方程和斜率(sv) 情节与丙烯酰胺浓度是线性gcDNA染料间的斜率为0.11,表明丙烯酰胺染料差访问(图10 ()广场)。然而,在的存在αprp在摩尔比率的蛋白质gcDNA磷酸盐0.6和3,丙烯酰胺淬火显著的荧光染料从斜坡的价值体现,即分别为0.99和2.33(图10 ()三角形,圆形,职责)。结果表明~ 9 - 23倍增加染料浓度以上时可访问性的蛋白质被添加到gcDNA相比,DNA(表1)。相应的值溜溜球的荧光猝灭的夹层的mDNA缓冲和上面的αprp浓度是0.23,0.76,和1.43职责。(图10 (b)如图,符号有相同的意义9a)。结果表明大约3 -线粒体dna和6.5倍增加的可访问性夹层的溜溜球的存在αprp蛋白质mDNA磷酸的摩尔比0.6和3,分别。由于染料是核酸碱基对间,上述结果表明,核酸基地gcDNA变得高度暴露于溶剂相比,mDNA凝结的朊病毒蛋白。在表1,sv值获得从上面的阴谋已被证明。相比之下,类似值精胺诱导gcDNA凝结已经提出了表明,精胺效果低于暴露的朊蛋白间DNA的溜溜球。

3.9。DNA -αPrP超微结构分析

可视化和测量DNA凝结的程度,我们也追求不同的扫描电子显微镜(SEM)分析与朊蛋白DNA分子。从SEM系统的图像表明,DNA分子与GC核苷酸形成高阶的球状结构αprp,而atDNA形成低阶简单浓缩DNA结构(图11)。

4所示。讨论

DNA中的染料YOYO-1当设置显示大量增加其荧光强度(40,41]。染料的发射强度的差异在不同的dna(图3)最有可能反映了不同的微环境在不同的dna染色结合(49]。各种DNA-condensing代理已经发现淬火的荧光强度间DNA的溜溜球(50]。类似的观察得出结论,NCp7 hiv - 1病毒的蛋白质也浓缩DNA (41]。溜溜球的荧光强度的下降源于产生的DNA绑定的冷凝冷凝剂的DNA。机械化的淬火溜溜球荧光强度一直解释源自两种染料的形成二聚体,二聚体之间的荧光共振能量转移和单体的溜溜球在DNA的凝聚状态40,41]。我们相信从这些事项αprp诱发凝结的核酸只包含GC和GC和碱基对。但是一小部分染料的荧光强度也下降的结果分离核酸染料间的凝聚结构朊病毒protein-nucleic酸复杂(图8)。一个类似的染料离解也发生在凝结的质粒DNA精胺(34,51]。

精胺和亚精胺是生物胺已证明能浓缩DNA的各种物理化学方法(34,51]。人们已经发现,精胺包含四个正电荷比亚精胺有效冷凝DNA携带三个正电荷,这是反映在目前的研究中。然而,重要的是要注意,在长时间的孵化这些胺诱导杆和螺旋管结构聚合物的DNA而朊蛋白诱发下令球状聚合的DNA分子(42,47]。目前的结果还表明,αprp整体携带七个正电荷更有效比生物胺在冷凝DNA表明静电相互作用可能在DNA凝聚起着主导作用。

发现朊蛋白凝结的gcDNA高于mDNA正如溜溜球的初始下降后荧光的蛋白质。在动态实验中,百分之五十的时间减少染料荧光由朊蛋白~ 3和5秒gcDNA和信使rna,分别(图2)。减少溜溜球的区段线粒体dna的荧光蛋白质诱导gcDNA和冷凝分别~ 50%和< 30%,。因此朊蛋白诱导凝结的程度比mDNA gcDNA还大。结果还表明,DNA序列只包含在无法凝结在朊蛋白的存在甚至经过一段长时间的平衡(图2)。染料的光谱实现平衡冷凝后也会导致类似的结论(数据3(一个)- - - - - -3 (c))。蛋白质之间的缩合反应是一个过渡核苷酸摩尔比1到3 gc和线粒体dna(图4)。以前的超微结构研究表明,完整的重组α朊病毒蛋白诱导有序的GC和线粒体dna分子聚合浓缩球状结构(47]。我们目前的研究还表明,gcDNA形式高阶压缩的球状结构朊蛋白的存在。

比较的结果呈现在图5表明球状121 - 231朊蛋白的片段,其中包含有序结构(三个α螺旋和两个beta-strands),不凝结核酸。因此,n端非结构化高度基本23 - 120段包含七个赖氨酸,三个精氨酸,6个组氨酸残基负责凝结。虽然全身朊蛋白及其121 - 231片段结合核酸与可比亲和力(未发表的结果),核酸蛋白质片段无法凝结表明冷凝的DNA是独立于蛋白质和核酸之间的结合能。类似的结论已经到达DNA-condensing财产的各种NCp7肽(41]。前面的结果表明,非结构化的氨基端高度基本段而不是结构化的区域(c端)的朊蛋白是参与蛋白质的功能性质(52]。同样重要的是,最近的一项研究证明了非结构化的朊蛋白n端结构域包含一个polycationic集群(KKRPKPG)类似于GPRGKPG主题Gpr126受体激动剂的IV型collagen2 [53]。此外,研究还表明,KKRPKPG-containing衍生肽是足以引起Gpr126-dependent营反应在细胞和小鼠和髓鞘形成改善hypomorphic gpr126斑马鱼突变体(53]。

众所周知,寡核苷酸有不到300个碱基对不服从任何DNA-condensing凝结剂42,48]。这可以解释相对较小的降低(10%,图5)荧光猝灭的溜溜球间的27-mer寡核苷酸的朊蛋白相比,淬火的溜溜球荧光gcDNA和mDNA ~ 65%和55%,分别在相同的蛋白质的核苷酸摩尔比。

基地曝光的程度的丙烯酰胺淬火闰溜溜球的荧光核酸核酸研究表明,基地atDNA暴露在最大程度上在缓冲区而gcDNA至少暴露朊蛋白的缺失。基地的mDNA暴露于一个中间程度。可怜的鸟嘌呤碱在水中的溶解度比其他基地至少可以解释GC碱基对的接触周围的溶剂。尽管这个不利的能量,αprp诱导凝结暴露了GC基地gcDNA超过mDNA的包含和GC基地。基地曝光的程度的atDNA核酸蛋白质最低的三个研究基地曝光的程度与蛋白质浓度的增加并没有改变(摩尔比> 3,表上方1)。这些结果表明,gcDNA不稳定的结构在更大程度上由朊病毒蛋白质相比其他两个dna。

因此,重要的是要问一个问题,如何DNA凝聚紧凑PrP吗?在类似的实验中,浓缩的溜溜球质粒DNA的可访问性的NCp7 hiv - 1对丙烯酰胺淬火实验显示= 0.15米¹;和支化聚胺(PEI)= 0.6米⁻¹(41]。在当前的研究中,我们观察到DNA凝结引起的αprp (sv = 2.32米⁻¹gcDNA)远高于NCp7 hiv - 1。当前的观测表明,荧光强度减少的程度YOYO-1(数字3和4对冷凝)αprp在65%左右(gcDNA)和55% (mDNA),这是减少超过50%和30%,分别观察与精胺(图7)。因此,冷凝或密实度朊蛋白的DNA发生远高于NCp7的生物多胺或1型单纯疱疹病毒蛋白质。

人们已经发现,倪^{2 +}离子凝结gcDNA显著,只有很轻微的冷凝效果atDNA [34]。因此我们的结果朊蛋白冷凝最高效gcDNA atDNA代表的性质,没有任何重大影响的核酸成分和特定的序列。它也被发现,阳离子的存在,凝结的质粒插入B-DNA增强的d (CG)序列(54]。二级结构的dna研究了圆二色性表明,倪^{2 +}离子转换gcDNA Z-form从B构象但显示atDNA边际影响结构(34]。倪^{2 +}离子浓缩gcDNA广泛而atDNA浓缩在一个非常小的程度上表明Z-form的DNA是更容易凝结相比其他结构形式的DNA。生物多胺转化b形式的DNA Z-structured形式取决于不同的实验方法(55- - - - - -57]。精胺和亚精胺被发现凝结核酸通过本研究中使用的方法和诱导的核酸基地内部的分子(表1)。与序列的主要槽Z-DNA (GC)₈和B-DNA特性一个狭窄的小沟和广泛主要槽(58]。我们的结果表明,在这个特定的DNA序列冷凝过程朊蛋白可能与B-DNA的主要槽交互。这个观察也由先前的研究,包括非特异性相互作用朊病毒protein-nucleic酸(36]。

这个顺序相依的起源和重要性由朊蛋白DNA凝聚?为了得到答案,我们需要考虑之间的交互小牛胸腺DNA和SPKK的串联重复序列肽组蛋白H1的主题。的组蛋白之间的相互作用基本八肽SPKKSPKK H1和交替共聚物聚(dA-dT)聚(dA-dT)导致Ψ-type凝结59]。朊蛋白的n端结构域包含polycationic集群(KKRPKPG)和研究表明,KKRPKPG-containing衍生肽是足以引起Gpr126-dependent营反应在细胞53]。可能是甘氨酸分子的高含量的氨基端八肽重复(PHGGGWGQ)朊病毒蛋白质与DNA相互作用不同骨干。甘氨酸残基被称为生物osmolyte和朊病毒蛋白质的氨基端能够互动作为监护人与大分子如蛋白质和DNA (52,60- - - - - -62年]。同样重要的是,要提到PrP能够与核DNA在正常生理或病理条件下(63年,64年]。有可能,朊病毒相关的神经退化,朊病毒蛋白质和核酸相互作用可能导致淀粉样蛋白聚合。对于癌症,p53聚合似乎维持肿瘤的增殖特性(64年在神经退行性疾病),而聚合会导致细胞死亡,虽然蛋白质似乎共享相同的prion-like转换机制。有趣的是,发生聚合,形成包含mutated-p53 hetero-oligomers改变DNA结合活性(64年]。

在组蛋白之间的相互作用和染色质的不同领域,GC-rich和at富集染色质域显示不同染色质组蛋白的构象和的不同的模式修改。先前的研究发现组蛋白脱乙酰酶Rpd3p作为衰减器这些基地composition-dependent染色质状态的差异(35]。结果也表明,GC-rich染色质域往往发生在更积极的构象和Rpd3p活动压制这种倾向在整个基因组(35]。最近的研究也表明,DNA DNA相互作用,at富集DNA工器关联更强烈GC-rich工器(65年]。此外,甲基化的胞核嘧啶之间的吸引力GC-rich at富集之间的DNA的DNA。因此,这表明at富集甲基化dna dna相互作用可能发挥重要作用在组织染色体和基因调控65年]。朊蛋白已被证明存在于细胞质中(29日,30.]。的内化在神经细胞中铜离子的存在表明,蛋白质也出现在细胞核周围的隔间(66年]。它也表明,完整的朊蛋白没有海马体的GPI锚定在细胞核中积累和神经母细胞瘤细胞系暗示交互与染色质的朊蛋白(67年]。绑定染色质可能表明朊蛋白的生物功能的蛋白质。染色体端粒末端的富含GC序列与细胞分裂成为短。较短的端粒被支持端到端融合染色体(68年,69年]。朊蛋白诱导稳定的凝聚结构观察与GC-rich DNA。可能是当前PrP介导DNA凝结形态类似于端粒结构。冷凝端粒可以抑制端到端染色体融合通过抑制DNA碱基配对染色体之间结束。因此,所有这些数据表明朊蛋白可能参与组织染色体和基因调控。

蛋白酶K-resistant发现积累在朊病毒感染细胞的细胞核和独立与染色质的蛋白酶体抑制(70年,71年]。蛋白质集中在常染色质区域对应于一个高度转录染色体的一部分。在基因组中,主要的转录区域包含高浓度的GC序列(72年]。它也观察到染色体重组率高的地区,高GC含量。这是一个问题的猜测是否特定的交互与GC-rich段朊蛋白基因会影响基因表达从而最终导致朊病毒的发病机理。

它假定朊病毒protein-nucleic酸复杂的调节不同的细胞功能的生物物理特性与复杂。先前的研究表明,可能有特定序列之间的交互GC-rich寡核苷酸和朊蛋白(24,36]。一定要提到,朊病毒的序列专一性不明显protein-nucleic酸相互作用。相反,它是假定特定核酸(DNA或RNA)模式,可能与GC组成、寡核苷酸长度和结构,定义了朊蛋白的识别和互动模式。然而,当前研究光在这阴影朊蛋白诱导DNA顺序相依凝结和解释可能的来源,因此,和生物学意义。理解PrP-DNA复合物的结构和细胞观察到的影响可能揭示朊蛋白的神秘病理学相关的恶性肿瘤。提出了工作成果极其相关建筑模型为理解朊蛋白的作用对染色体DNA的密实度和调节基因表达。

信息披露

目前地址Alakesh贝拉是亨利·m·杰克逊军事医学发展基金会(HJF)和解剖学、生理学和遗传学(APG),统一服务大学,琼斯桥路4301号,贝塞斯达,MD 20814,美国。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者表达他们的感谢教授m . Monsigny名誉教授,奥尔良大学奥尔良、法国、有益的讨论和鼓励的工作。这项工作由拨款支持中心Franco-Indien pour la推广de la矫揉造作的Avancee (CEFIPRA Alakesh贝拉)。Sajal博士作者之一(出生)承认金融支持从科技部,台湾(大多数105 - 2218 - e - 131 - 003和106 - 2221 - e - 131 - 027)。

引用

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