选择的DNA寡核苷酸适配子卵巢癌生物标志物CA125使用锅SELEX和高通量测序

文摘

血清中CA125黏液糖蛋白的浓度与女性患卵巢癌的风险,也表明诊断病人对治疗的反应。准确检测的大型的、复杂的患者样本中的蛋白质具有重要的临床意义。我们建议可以启用强大的新的诊断工具的核酸寡核苷酸适配子的发展与CA125的亲和力。在这里,我们报告的使用锅SELEX孤立单链DNA寡核苷酸适配子与亲和力CA125,紧随其后的是高通量测序的选定的寡核苷酸。这丰富的数据的方法,结合生物信息学工具,使整个选拔过程特征。使用探针毛细管电泳荧光各向异性和亲和力,四个适配子的结合亲和力候选人进行评估。两个寡核苷酸适配子,CA125_1和CA125_12没有引物,被发现与临床相关的蛋白质浓度的目标。绑定被Mg的存在不同的影响^{2 +}离子,需要绑定CA125_12 CA125_1和废除绑定的。总之,锅SELEX被发现是一种很有前途的选择方法,产生了DNA寡核苷酸适配子临床上重要蛋白质的目标。

1。介绍

卵巢癌诊断在当地阶段只有15%的情况下;5年生存这一早期诊断平均92%。大多数卵巢癌患者被诊断为更先进的疾病,五年的存活率为46% (1]。鉴于戏剧性改善长期生存率使卵巢癌的早期检测,分析工具的发展援助的筛查和早期诊断是非常重要的2]。

癌抗原125 (CA125)是卵巢癌的临床金本位制生物标志物(3]。卵巢癌患者血清CA125水平定期监控,和CA125的复兴与癌症的复发(强烈相关4- - - - - -6]。随着水平的互补生物标志物HE4,血清CA125水平被认为是卵巢恶性肿瘤的风险算法(罗马),这是fda批准的妇女的盆腔质量分类为高或低风险类别(7,8]。CA125的另一个临床使用是卵巢癌的风险算法(ROCA)。罗卡预测卵巢癌的可能性基于串行测量血清CA125,利用经常观察到的现象,卵巢癌的最初发展导致这些变异点水平在一个女人的独立基线(9,10]。罗卡的使用在卵巢癌筛查评估组织在英国的合作试验卵巢癌筛查(UKCTOCS),一个随机对照试验,> 200000绝经后妇女,跟着他们10年11]。UKCTOCS报告的调查人员在死亡率显著降低多通道筛选人接受ROCA, sonography-relative目前筛选对照组,当女性进入与癌症研究被排除在分析(12]。这些发现强调的重要性,优秀的分析化验CA125作为持续努力的一部分,完善现有的卵巢癌筛查策略。

通过双行列式免疫测定CA125检测到目前。依赖免疫抗体检测是有问题的生物标志物,然而,由于其异质性。CA125包含一个变量的重复域数量不相同,是公认的最广泛使用的类不同区段的抗体(13]。可用的亲和试剂无法识别所有重复域CA125表明现有的临床试验可能的生物标志物水平显著低估(3]。所需的临床结果的早期检测的发展可能会使探测器承认CA125的亲和力的方式不同于现有的抗体,使更多的新的检测方法。

作为第一步化验的卵巢癌的发展并不依赖于抗体,我们选择了单链DNA寡核苷酸适配子与CA125的亲和力。寡核苷酸适配子是功能性寡核苷酸选择通过体外进化过程具有约束力或催化财产利益;适配子筛选过程称为SELEX,缩写系统演化指数富集配体的(14,15]。SELEX通常发生在多个周期,或轮,每个涉及候选人适体分子的孵化与感兴趣的目标;的分区好绑定寡核苷酸的显示较弱的绑定;并通过聚合酶链反应扩增良好的绑定。SELEX的结论,丰富了寡核苷酸池受到某种形式的序列测定,通常通过克隆到一个细菌表达系统Sanger测序紧随其后。

在此,我们报告利用锅SELEX,选择和放大的候选人寡核苷酸发生在一个单一的容器(16),来确定CA125寡核苷酸适配子与亲和力。锅的方法最大限度地减少转移步骤,减轻污染和良好的粘结剂的损失。我们得出结论通过测序DNA适体选择过程每一轮Illumina公司平台。这个数据丰富的方法使整个选拔过程,不仅其端点,特点。我们最近报道了生物信息学管道,使DNA寡核苷酸适配子的识别与亲和力的卵巢癌生物标记HE4 [2]。该管道已被用于我的另一个大型数据集序列信息来确定另一个重要的临床寡核苷酸适配子目标。

2。实验部分

2.1。试剂

Oligonucleotides-including没有DNA库、PCR和测序引物,并为体外标记寡核苷酸适配子从集成测试已经购买了DNA技术(珊瑚镇,IA)。先前报道的序列,通过水槽和同事(17]是正向引物5′-FAM-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3′,反向引物5′-biotin-TTC ACG GTA GCA公司治理文化ATA GG-3′, ssDNA图书馆5′-FAM-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG (N)₂₅有条件现金援助ATG CGT GCT ACC GTG AA-3′。Hand-mixing用于合成DNA库的随机地区缓解微分耦合效率的碱基偏见合成混合使用机器。所有寡核苷酸还原在TE缓冲(三10毫米,0.1毫米EDTA、pH值8.0)到100年μMgCl m . Nuclease-free水,25毫米₂5.0 U /L聚合酶(PCR),蓝色/橙色6 x加载染料(加载凝胶)从Promega购买(麦迪逊,WI)。脱氧核苷酸三磷酸腺苷(核苷酸,10毫米股票)获得试剂盒,Inc .(瓦伦西亚,CA)。NuSieve GTG琼脂糖是购自Cambrex生物科学(大我)。选择和PCR扩增进行0.5毫升薄壁聚丙烯管(纽约埃普多夫北美,Hauppauge)。荧光素钠购买从西格玛奥德里奇(圣路易斯,密苏里州)。从东京Tween-20购买化工(波特兰,或)。CA125从人类腹水(纯度> 95%)购买从菲茨杰拉德产业国际(阿克顿,MA)和提供在PBS缓冲液pH值7.2,包含3%的蔗糖和0.05%的叠氮化钠。癌抗原CA125酶免疫分析法检测组件(酶联免疫试剂盒)从BioCheck购买(CA)福斯特城。

所有缓冲区都准备使用18.2 MΩ-cm水从Milli-Q净水系统(微孔Corp .)、贝德福德,MA)。Preweighed准备Tris-Glycine盐和磷酸缓冲盐来自热科学(罗克福德,IL)。蛋白质孵化缓冲区包含0.01绒毛₃在pH值7.2和0.15 M氯化钠。蛋白质洗涤缓冲由0.1绒毛₃、0.15 M氯化钠和0.05% v / v Tween-20 pH值7.2 (PBT缓冲区)。DNA结合缓冲区由25毫米三、192毫米甘氨酸,KH 5毫米₂阿宝₄MgCl, 1毫米₂(TGKM缓冲区)调整与1 M氢氧化钠溶液pH值8.3。CE分离缓冲区包含25毫米三,甘氨酸192毫米和5毫米KH₂阿宝₄pH值8.3 (TGK)准备从热科学Tris-Glycine粉和KH₂阿宝₄从Mallinckrodt化工厂(圣路易斯,密苏里州)。10倍长串缓冲区由100毫米三、20 M氯化钠,10毫米EDTA (10 x缓冲美圆)pH值7.5。链霉亲和素琼脂糖是购自热科学皮尔斯生物技术有限公司(罗克福德,IL)。BioRad列买来BioRad技术(大力神,CA)。绑定和洗涤(黑与白)缓冲区(10毫米三、2毫米氯化钠和1毫米EDTA在pH值为7.6,2 x浓度)是由氯化钠从VWR购买(布里奇波特,NJ)。所有的缓冲区是透过一个0.45μ米尼龙过滤器之前使用。

2.2。管ELISA

改良ELISA进行确定最佳条件固定CA125在PCR管。一个管(“一夜之间”)与100年孵化μL 8000 U /毫升CA125在一夜之间在4°C。第二个管(“SpeedVac”)包含100μL 8000 U /毫升CA125;溶剂蒸发于120年学者DNA OP SpeedVac集中器(热科学、阿什维尔,NC)为四个小时没有供暖。管是洗4 x 200μL PBT和干,之后推荐协议从CA125酶联免疫试剂盒之后;然而,而不是使用CA125-coated微型板块提供装备,PCR管。随着酶联免疫试剂盒试剂,30岁μL 8000 U /毫升CA125是添加到积极控制管。消极的控制管与PBS隔夜孵化。

2.3。锅SELEX

100年μCA125的L (8000 U /毫升1 x PBS)被添加到五0.5毫升PCR管。三个管用于适配子选择,一个管是用于PCR循环的决心,和一个管作为消极的控制。溶剂蒸发在SpeedVac集中器与没有热量4小时。管被洗4 x 200μL PBT。25 N DNA DNA结合缓冲库是热循环在95°C 3分钟,慢慢地在冰上冷却之前的选择。在最初的SELEX, 50μL (1μM DNA库(稀释使用DNA结合缓冲区)添加到管子,在室温下培养1小时。DNA溶液的体积小于CA125的解决方案来减少非特异性DNA和管表面的相互作用;出于同样的原因被小心地吸量管DNA溶液直接进入管的中心。50μL的DNA结合缓冲区添加到负控制管。DNA被撤管,管洗了200μL PBT。洗的数量在这一步骤中提供了一种手段,增加了选择压力;在四个选择,6,9日,12日和15清洗步骤。真空是用来完全干燥管。在随后的选择,可用ssDNA浓度最高的使用(通常小于1米)。DNA浓度是由吸光度在260 nm NanoDrop 2000紫外可见分光光度计。

2.4。PCR扩增

PCR mastermix (600μ从375年L总量)准备μL nuclease-free水,12μL 10毫米核苷酸9μL 10μM FAM-labeled底漆,9μL 10生物素化的底漆,72μL 25毫米MgCl₂,120年μL 5 x无色PCR缓冲,和3μL 5 U /μL聚合酶。100年μ0.5 L的混合物被整除五毫升PCR管进行了选择;这些管子储存在冰箱里,而优化PCR循环确定数量。49μL的混合物添加PCR分离管1μL 100海里图书馆DNA PCR积极控制。49μL的混合物添加另一个PCR管1μL nuclease-free水作为PCR -控制。周期测定管,锅-控制管,PCR阳性控制管和PCR -控制管被放置在Mastercycler个人(埃普多夫,汉堡,德国)。所有的管子都加热到95°C 10分钟。16岁到24岁的PCR进行周期,每个涉及变性为30秒95°C,引物退火55°C 15秒,在72°C和扩展15秒。样本(10μL)被从thermocycler每一轮后,与凝胶装入染料混合,直到分析和存储在冰。在4%琼脂糖凝胶电泳进行,以确定最优周期放大和检查两个负面的污染控制(FAM底漆启用可视化的乐队不使用溴化乙锭染色)。三个选择管储存在−20°C在周期的决心。这些管子是放大的内容使用最佳的周期数,外加最终在72°C扩展了5分钟。三个选择管子的内容汇集(总量= 300μL)。

2.5。长串和乙醇沉淀

dsDNA产生通过PCR是使用一个链霉亲和素列转换为ssDNA捕捉dsDNA通过生物素化的(不良)链,其次是孵化碱性溶液中变性DNA链。300年μL链霉亲和素琼脂糖被加载到BioRad列和洗4 x 500μL 2 x长串缓冲区。300年μL PCR产品和300年μL 2 x的长串缓冲区被添加到列和孵化30分钟在室温下与偶尔的涡流。列被允许完全耗尽,被4 x 500μL 1 x长串缓冲区,最后用500紧随其后μL nuclease-free水。200年μL ~ 0.1 M氢氧化钠添加到列,列是孵化10分钟37°C。列内容,包含fluorescein-labeled ssDNA,筛选了到0.5毫升埃普多夫管含有醋酸缓冲由116μL 0.27醋酸和35μL 3 M醋酸钠。洗脱过程重复了第二部分的氢氧化钠溶液;产品被收集到第二个埃普多夫管。1000年μL 100%乙醇添加到管,在冰浴孵化或存储在−1小时20°C冰箱ssDNA沉淀。管离心机在14000转4°C,颗粒ssDNA 1小时。除了50μL溶剂从上面是吸气的颗粒,这并不总是可见的。颗粒在70%乙醇和resuspended管离心机15分钟再次在14000 rpm和4°C。这个步骤是重复,DNA被干后在高温下SpeedVac 15分钟。30μL水或DNA结合缓冲区被加入到干管重组DNA进行下一轮的选择或排序。样本储存在−20°C到进一步使用。

2.6。测序和生物信息学

测序和生物信息学的过程之前已经报道过(2]。简单,适体筛选完成后,每一轮放大使用收集的DNA Illumina公司测序引物。存档的DNA每一轮使用超纯水稀释至100海里。每个样本都被分配一个独特的反向引物包含索引用于条码。样品和控制放大通过PCR使用一个优化的周期数。PCR产品成像包含1 3%的琼脂糖凝胶μg / mL溴化乙锭确认产量和污染物的缺失或副产品。样本测序DNA测序的威斯康辛大学生物技术中心设施。

生物筛选使用的DNA测序数据管道基于免费软件,除了富集分析,它使用一个本地Python程序编写的。这个程序(enrichment.py)已经在GitHub上可用https://github.com/rebeccawhelan/PythonEnrichment。初步分析后FastQC文件以确保测序成功,数据读入使用read_fastqc Biopieces管道。序列数据,每一行对应一个适配子的候选人,然后修改的去除(守恒)底漆地区;序列以外的长度被丢弃的,基于丰富的序列统计和排名。接下来,通过浓缩处理过的数据被分析,确定折叠序列在轮选择的浓缩。褶皱浓缩已被证明是一个更可靠指标的亲和力比读计数(18]。总分(compScore)计算 因此compScore log10的产品每一轮的浓缩,双重量最后一轮,选择压力是最严格的。使用CD-HIT-EST [19),前1000名最丰富序列从每一轮集群序列同源性,以确定可能的紧急图案。序列是集群附带他们的引物序列同一性阈值为0.8,最高的身份在所有分配给集群的集群。

2.7。荧光各向异性

荧光各向异性测量使用SpectraMax M5多模板与偏振光学阅读器(分子器件、桑尼维尔CA)。测试DNA寡核苷酸适配子被命令从集成技术,Inc .(珊瑚镇,IA) 5′TEX615德州(红色)荧光团。100海里的DNA适体缓冲(TGKM)加热到97°C 3分钟,在冰上冷却5分钟,然后可以温暖到室温。Heat-cycled DNA在一系列最终的解决方案是结合CA125浓度从0 U / mL - 2000 U /毫升在0.13毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA),防止吸附容器壁。PBS缓冲了达到预期的最终样本体积。孵化后90分钟在黑暗中在室温下,样本加载在重复或一式四份(75μ信用证)成一个96 - 200 Fluotrac黑色免疫学板(美国科学、卡拉、FL)和分析SpectraMax,温度在22°C。的荧光各向异性是585海里,635海里,截止波长为610 nm。原始数据(荧光发射平行和垂直于激发)之前blank-corrected各向异性值计算。数据是符合一个等温线函数: 在哪里是蛋白质浓度(不同),适体浓度(常数),在蛋白质的存在各向异性测量,然后呢的各向异性是缺乏蛋白质的情况下,使用IgorPro (v . 6.12)绘图软件。测试的预测镁离子影响寡核苷酸适配子的亲和力CA125,重复上述试验,但在PBS代替TGKM热回流的步骤;在这些化验样本孵化24小时在4°C。

2.8。亲和力探针毛细管电泳

亲和力探针毛细管电泳亲和力化验使用贝克曼P / ACE进行最小检测量(贝克曼库尔特,富勒顿,CA)配备一个氩离子激光器。一个修改的熔融石英毛细管(Polymicro技术,凤凰城,阿兹;ID = 50μm OD = 360μm,总长度为49.5厘米,长度从入口到探测器使用反向注入和负极性= 10.5厘米)举行25°C。每个样本包含20 nM FAM-labeled适配子(25 mer合成序列没有底漆地区),20纳米荧光素(内部标准)和0.2毫克/毫升BSA。TGKM使用稀释剂的样品制备,用CA125_1_NP的电泳缓冲试验;TGK用作CA125_12_NP电泳缓冲。准备样品,适体的本体溶液或TE TGKM被加热到97°C 3分钟,然后在冰上冷却。荧光素与BSA接着说,解决方案是分布在一个适当的数量的样品管。最后,CA125浓度添加到最后一个从0 U /毫升到2000 U /毫升。蛋白质+缓冲(PBS)的体积是恒定在所有样品(4μL)。样本在黑暗中孕育了90分钟。压力注入(0.3 psi, 5 s)被用来介绍样品在毛细管;0.5 psi压力应用于驱动示例塞过去未冷却的区域(20.]。分离是通过应用程序(在负极性)30 kV和0.3 psi CA125_1_NP压力。分离CA125_12_NP是由20 kV没有施加压力。运行时间是5分钟。在488纳米荧光很兴奋,检测到520海里。峰值高度测定的仪器控制软件(32开)。的变化自由DNA适体峰值的大小,相对于内部标准,用于指示适体和蛋白质之间的复杂的形成。数据是符合一个等温线方程: 在哪里蛋白质浓度(不同的)和吗适体浓度(常数),使用IgorPro (v . 6.12)绘图软件。

3所示。结果与讨论

一个单链DNA库随机区域被用作选择过程的输入序列的多样性,因为它提供了一个良好的平衡,保险,和计算温顺。假设每个基本是同样可能出现在每个位置随机地区有4²⁵(~ 1×10¹⁵)可能在图书馆这样一个序列。在我们的选择,我们使用50 pmol (~ 3×10¹³DNA分子)作为初始输入,给任何个人序列预计大量的0.03(一个图书馆会给一个预计大量的1)。使用较长的随机区域会导致低覆盖率的序列空间,可能导致的损失有用的主题,而一个短的随机区域可能缺乏形式的复杂性相关的二级和三级结构参与目标绑定。

图1显示了一个管的结果ELISA用于评估不同的方法在PCR管吸附CA125。基于颜色变化的定性评估,同时在一夜之间孵化4°C和人力资源的溶剂蒸发SpeedVac导致免疫活性CA125的吸附聚合酶链反应管的城墙。SpeedVac治疗观察造成更大的颜色变化相同的输入的CA125浓度和分析试剂和更少的时间完成,所以这种方法用于锅SELEX。

锅SELEX示意图如图表示2。在锅SELEX,选择和放大发生在相同的PCR管。这种方法区别锅SELEX模式的其他方式分离(硝基过滤、柱层析法、毛细管或芯片电泳)使高亲和性结合适配子的分区候选人的候选人不绑定的目标。孵化后的适配子与CA125候选人吸附管,管冲洗缓冲去除弱束缚和是非绑定的DNA。迭代增加清洗步骤的数量(从6到15的四个选择轮)应用更大的选择性压力,迫使DNA的人口聚集在更高的亲和力绑定。

我们组和其他记录随机PCR扩增的DNA库用于适配子选择受到不良副反应(2,21]。特别地,随着周期的PCR, dsDNA产品感兴趣的最初增加丰富但在副反应消耗产生的副产品,在琼脂糖凝胶电泳迁移更为缓慢。副产物形成的负面影响降到最低,我们优化PCR循环每次SELEX轮后的数量。一个反应管接受PCR,样本从这管定期删除。样品在4%琼脂糖凝胶电泳在一起并在凝胶成像盒与溴化乙锭过滤器。图3显示了一个典型的凝胶图像。在这个实验中,发现了PCR的21个周期给的最高产量所需产品以最小的副产物的形成。图像也显示了积极的和消极的预期成果PCR控制和锅的控制,已经没有dna中CA125是固定在管,但细胞缓冲区添加在孵化的一步。

生物信息学管道完成后使用锅SELEX图表示4。这个管道是一个改进的版本的一个类似的计算过程,我们开发了识别DNA寡核苷酸适配子与亲和力卵巢癌生物标记HE4在一项研究2]。DNA归档每轮选择测序后Illumina公司平台。这种方法能得到更多的读取(max = 10.8×10⁶,最小值= 4.1×10⁶,平均= 6.6×10⁶)比实现clone-and-sequence方法,一般产量10 - 100序列。表1包含的信息生成的序列数据。我们注意到这个表中两个属性。首先,表面random-unselected库包含重复序列。我们之前报道这样的序列重复没有图书馆2)和属性在合成和测序错误。此外,在选择重复序列百分比增加,从没有图书馆的15.24%到85.04%的DNA中选择4。重复增加对CA125-binding DNA序列(指定+表1)和游离DNA(指定)。然而,人口的增长率大于CA125绑定。我们解释这些数据意味着选择性压力已经大大改变了ssDNA人口,这首先发生在人口的影响DNA蛋白质绑定到目标。考虑到每个选择轮的输入绑定,上一轮的DNA,这是合理的重复序列在积极的和消极的选择应该继续观察。

数据显示没有DNA库合成的偏见。理想情况下,“随机”的区域没有库将包含同等比例的四碱基;在我们的图书馆包含随机区域% G;%;% T;% c。虽然这library-prepared hand-mixing-does比率不是坚持理想的基地,这是偏见比其他库中,我们介绍了由混合机(数据没有显示)。因此Hand-mixing是明智的选择适配子库的准备。

四个有前途的适配子序列作为测试体外;这些序列如表所示2。候选人选择在选择过程中大大丰富,属于二级结构的集群,或两者兼而有之。序列CA125_1是最丰富的序列通过最后一轮选择(轮4)。序列CA125_2有很强的综合得分对所有选择轮和一个稳定的增长。我们测试了与其他序列,CA125_2长26基地;我们的生物信息学分析旨在包括所有序列的长度。这26 mer序列是最有可能的一个工件PCR或合成错误,但我们选择描述其CA125的亲和力,因为其高度的浓缩。序列CA125_3代表序列的高纯度选择集群似乎占主导地位的最圆的。最后,代表序列CA125_12最高分的集群。

两个独立的分析methods-fluorescence各向异性(FA)和亲和力探针毛细管电泳(APCE)则用来评估这四个适配子的亲和力CA125的候选人。当(或对于CA125_3)随机区域的适配子候选人化验,them-CA125_1和CA125_12-displayed CA125浓度绑定。图5显示了CA125_1绑定等温线,造成监控FA变化CA125浓度从1提高到2000 U /毫升。在设在绘制各向异性的变化相对于自由适配子在缺乏蛋白质,表明复杂的形成;CA125浓度是独立的变量。很适合的数据绑定等温线方程,收益明显的U /毫升。绑定要求CA125_1热循环在孵化前5毫米镁离子与蛋白质的目标;CA125_1热循环缓冲区贫镁离子没有显示与CA125浓度绑定。FA化验数据支持APCE化验,收益明显80股。±38 U /毫升。适配子候选人CA125_12发现显示浓度绑定CA125,的值U /毫升,U /毫升由FA和APCE分别。与CA125_1相比,所需热量循环中镁离子的存在对绑定,CA125_12绑定到CA125只有当热循环在PBS或TE没有镁离子;热循环中镁离子的存在显著降低了CA125_12的亲和力。的变化值范围内的报道是观察到我们的实验室和其他DNA aptamer-protein对FA和APCE [2,17]。我们选择使用一个简化的形式等温线方程的广义形式与不同的单位需要添加的条款:U /毫升CA125浓度和适体纳米浓度(22]。

我们选择的单位报告values-U / mL-merit讨论。因为CA125的长篇记载了异质性(3),这种蛋白质并没有一个明确的摩尔质量的价值。临床和研究应用,CA125浓度总是报道在U /毫升,一个单位,源于免疫测定的标准临床检测。虽然这个单位不熟悉化学家和生物学家,报告以这种方式CA125卵巢癌研究人员和临床医生的标准实践。当前临床截止CA125是35 U /毫升,和商用研究成绩免疫测定工具通常具有动态范围达到200 U /毫升。我们的DNA寡核苷酸适配子因此临床相关的浓度有明显的关联。

其他两个适配子候选人(CA125_2和CA125_3)不显示绑定CA125检测时随机区域。缺乏积极的原因绑定的这两个在体外实验中还不清楚。我们注意到这两个成功的适配子候选人(CA125_1和CA125_12),分别选择压力和最丰富的代表最高分的集群。其他候选人有不利于浓缩指标,由生物信息学分析。此外,我们注意到,而适体候选人显示目标绑定包含所有的四个碱基,这两个失败的适配子候选人在体外测试不包含G和T的比例高于预期的比例(25%)。表3显示了碱基组成的四个适配子候选人体外我们测试。那些没有显示绑定(CA125_2和CA125_3)含15%和12%,分别的G + C而显示绑定(CA125_1和CA125_12)均包含40% G + C(随机分布预测,每个序列G + C)将包含50%。考虑到更强的分子内的力量与G C碱基对/ t碱基配对,这种差异在nucleobase内容可能显著观察到的绑定蛋白的目标。最后,分析涉及适配子候选人轴承PCR引物结合区域没有显示的证据浓度复杂地层的CA125浓度增加(数据没有显示)。

4所示。结论

在原来的应用程序中,锅SELEX成功地确定了寡核苷酸适配子与亲和力的抗体(16,23]。在这个报告中我们展示了它的使用选择的寡核苷酸适配子识别CA125,黏液蛋白,是黄金标准为卵巢癌生物标记。考虑到广泛的黏蛋白的重要性在许多类型的癌症24,25],这个相对简单和有效的过程可能会使临床上有用的寡核苷酸适配子的选择,尤其是对癌症生物标志物和分子参与癌症扩散、转移和免疫抑制。最近的2′-fluoro-pyrimidine RNA寡核苷酸适配子与亲和力CA125报道(26]。这些修改RNA寡核苷酸适配子选择使用磁珠纯化策略His-tagged CA125,与用于counter-selection His-tagged VEGF。我们未来的工作将包括一个比较DNA寡核苷酸适配子的报道有了这些新的RNA寡核苷酸适配子,和评估其可能的协同使用小说创造的化验检测CA125。多个寡核苷酸适配子的可用性与亲和力的临床重要目标打开开发sandwich-format分析的可能性,以其特异性和扩增的固有优势。

信息披露

内容完全是作者的责任,并不一定代表官方观点的国家癌症研究所和美国国立卫生研究院。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

迪莉娅·j·斯科瓦尔Tae Kyu布莱恩嗯同样起到了推波助澜的作用。

确认

美国国家癌症研究所支持的项目描述(批准号R15CA161970)。金融支持亨利德雷福斯老师学者奖(丽贝卡·j·惠兰)。作者希望感谢瑞秋伊顿和开普勒米尔斯的技术支持和促进讨论。

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