的二维结构t . bruceiPreedited RPS12 mRNA并不影响大分子拥挤

文摘

线粒体转录RNA编辑将在非洲锥虫成熟需要sequence-deficient pre-mRNAs可翻译mrna。不同pre-mRNAs已被证明采用高稳定的2 d折叠;然而,目前尚不清楚这些结构类似于体内折叠考虑到线粒体内的极端“拥挤”条件。在这里,我们分析了影响线粒体的结构的大分子拥挤RPS12 pre-mRNA。我们使用高分子量聚乙二醇大分子cosolute和监控全球核糖核酸和核苷酸的结构解析。我们证明拥挤对2 d褶皱没有影响,我们得出这样的结论:MFE结构在稀释溶剂条件下代表一个好的代理的折叠pre-mRNA线粒体溶剂的上下文。

1。介绍

RNA分子的折叠紧凑,本机结构的各个部分结构由一组第一原则物理化学部队(1]。其中一个是电荷补偿克服静电排斥的带负电荷的磷酸二酯骨架2- - - - - -4]。Mono -和二价金属离子在低到高毫克分子浓度有助于这项任务(5)和金属离子半径和电荷密度的影响作了详细研究[6- - - - - -8]。金属离子,代谢物、多胺和osmolytes已被证明调节RNA结构(9- - - - - -13以及高浓度的大分子,可以占到总量的30%细胞室。这产生所谓的“拥挤”溶剂条件(14- - - - - -16),一般稳定RNA 2 d和3 d结构通过排除体积效应和熵微扰的折叠景观5,17,18]。

RNA编辑描述的线粒体pre-mRNAs转录后的改性反应的特点是专门的特定站点插入和删除U-nucleotides(审查,看19])。反应发生的单个线粒体内锥体虫,代表最拥挤的真核细胞的细胞内环境。Intramitochondrial大分子浓度达到560 g / L (20.,21]。编辑由大分子蛋白质络合物催化,20年代editosome [19),与18线粒体pre-mRNAs基质的处理反应。不同的转录本编码单元的线粒体电子传递和氧化磷酸化连锁店和已经被几个不寻常的特性特征:首先,大多数pre-mRNAs缺乏实质性的序列信息(平均45%);因此他们需要转化为可译的信使RNA RNA编辑。第二,不同pre-mRNAs典型的异常高G内容(34%),而在三分之二的情况下都聚集在大片的G-nucleotides (2 G≤≤8)。第三,体外化学调查研究表明,不同pre-mRNAs采用非常稳定的2 d -结构接近结构稳定性的rna (22,23]。规范的碱基配对,它们包含基因并在许多情况下多个G-quadruplex折叠(《GQ》)。然而,目前尚不清楚这些2 d的结构类似于体内折叠锥体虫线粒体中的极端拥挤条件。这尤其重要,因为RNA编辑在体外对拥挤的溶剂已被证明是敏感属性(24]。

在这里,我们分析大分子拥挤的效果(s)在线粒体的结构RPS12 pre-mRNA作为一个典型的例子在非洲锥虫线粒体转录。我们使用高分子量聚乙二醇(PEG)作为一个中性高分子cosolute模仿intramitochondrial溶剂条件和我们监控RPS12成绩单的结构随温度而变的UV-spectroscopy和选择性2′羟基酰化分析引物延伸(形状)。

2。材料和方法

2.1。dna选殖和RNA合成

线粒体基因编码核糖体蛋白S12 (RPS12)扩增从菌进行基因t . brucei李斯特427基因组DNA(见[25)使用以下DNA-oligonucleotide引物(KpnI和尚驰限制性内切核酸酶识别/乳沟网站强调):RPS12_forw。GGGGTACCCTAATACAC-TTTTGATAACAAACTAAAG;RPS12_rev。CCGAGCTCCCTACCAAACATAAATGAACCTG。PCR-amplicon克隆到KpnI,尚驰核酸内切酶限制性位点的phagemid pBSSKII⁻(表达载体)和成绩单是由运行在体外转录从线性化质粒模板使用T7-RNA聚合酶。rna被尺寸排阻色谱法纯化从国家结核控制规划nonincorporated EtOH降水紧随其后。RNA丸被再溶解在10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值7.5,1毫米EDTA (TE)。

2.2。UV-Melting曲线

RPS12成绩单是溶解在0.5 x TE pH值7.5 (50μL),加热到95°C(2分钟),和snap-cooled冰前的集中折叠缓冲收益率最终体积0.5毫升。最后的缓冲浓度如下:5毫米Na-cacodylate, pH值6.8,70毫米氯化钠,MgCl±2毫米₂。体积条件生成的补充与挂钩折叠缓冲区_4000年最终浓度为6% (w / w)。这超过了聚合物交叉浓度()的挂钩_4000年1.5倍,因此代表了一个非常拥挤的溶剂体系。RNA浓度进行调整= 0.5。变性和复性资料测量在260 nm之间20°C和95°C的加热/冷却速率1°C /分钟(数据采集:0.3数据点/°C)。融化温度()获得最大的第一个衍生品()的熔化曲线。

2.3。形状修改

改性试剂1-methyl-7-nitroisatoic酐合成(1级)(描述26]。RPS12 pre-mRNA (0.1μ米)被加热到95°C变性(2分钟)其次是提前在冰上冷却。RNA折叠是通过平衡在20毫米玫瑰,pH值7.5,30毫米氯化钾,MgCl±10毫米₂30分钟27°C,代表insect-stage锥体虫的最佳生长温度。拥挤条件下诱导通过6% (w / w)挂钩_4000年();12% (w / w)挂钩_4000年();或9% (w / w)挂钩_2000年()。RNA样本分割和治疗1 3.5毫米M7在DMSO或相同的整洁DMSO溶液的体积。改性反应是淬火后70秒的同等体积的水。rna被EtOH降水和脱盐恢复尺寸排阻色谱法。不同的拥挤条件导致了几乎相同的修改结果(参见图S1在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/6067345与培生())和斯皮尔曼的()相关系数≥0.87和平均标准偏差为±0.11(形状单元)。

2.4。逆转录和数据处理

克分子数相等的数量的荧光标记DNA-oligonucleotide底漆T3反向,6-FAM /乔/ TAMRA-AATTAACCCTCACTAAA-GGGAAC,退火1 M7-modified或1 M7-unmodified RNA样品在0.25 x TE pH值7.5通过加热到95°C(2分钟),冷却至50°C(10分钟),在冰和快速冷却。反转录是在50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值8.3,MgCl 75毫米氯化钠,3毫米₂每个核苷酸,德勤2.5毫米,0.25毫米,和0.75 U /µL RiboLock核糖核酸酶抑制剂(表达载体)。反应是由预热样品1.5分钟前5 U /µL上标三世逆转录酶(表达载体)。RPS12 pre-mRNA reverse-transcribed 20分钟在40°C。测序反应是使用修改的RNA,进行荧光标记DNA-oligonucleotide底漆和ddCTP ddGTP最终浓度为0.125毫米。逆转录停止了快速冷却和增加0.1的4 M氢氧化钠后加热到95°C(5分钟)。样品池,EtOH沉淀,再溶解Hi-Di®甲酰胺为毛细管电泳(ABI和生活技术)。分析了原始电泳痕迹使用SHAPEfinder [27)使用箱线图的方法来确定的数量统计离群值。规范化形状反应是平均的结果至少三个独立的实验。

2.5。SHAPE-Directed RNA折叠

归一化形状反应被用作pseudo-Gibbs自由能()值来指导的折叠RPS12 pre-mRNA。最小自由能(MFE)的二维结构RPS12记录生成使用ShapeKnots常规(见[285.6)包含在RNA结构(见[29日)使用默认参数= 1.8千卡/摩尔;= 0.6千卡每摩尔= 0.35千卡/摩尔;= 0.65千卡每摩尔。结构比较进行使用CircleCompare [29日]。MFE结构比较的“敏感性”(sens)和阳性预测值(ppv): sens =分数参考结构也出现在英国石油公司的nonreference结构;bp的ppv =分数nonreference结构也发生在参考结构。RPS12 pre-mRNA探测在稀释缓冲生理10毫米毫克^{2 +}离子浓度作为参考国家如果不显示。

3所示。结果与讨论

研究大分子拥挤的影响线粒体pre-mRNAs的结构锥虫属brucei,我们使用的主要记录RPS12代表模型RNA。pre-mRNA分子长325元。pan-edited成绩单,它是主要编辑它的整个序列132 U-nt插入和28 U的删除。RNA有G-nt-content 27%和嘌呤或嘧啶(1.3的比例)。其实验确定最小自由能(MFE) 2 d结构计算吉布斯自由能()−152千卡每摩尔的碱基配对与单链核苷酸比(0.62)。此外,RNA包含基因(22]。自在细胞结构探测实验已经成功地执行只有丰富,胞质rna(见[5,30.- - - - - -33]),我们决定模仿拥挤,intramitochondrial用惰性溶剂环境,合成cosolute如聚乙二醇(PEG) (34,35]。我们使用两种不同的高分子质量挂钩的平均分子质量4000克/摩尔(挂钩_4000年)和2000克/摩尔(挂钩_2000年)以上浓度聚合物交叉浓度(),这标志着从一个semidilute过渡到一个拥挤的溶剂体系36- - - - - -38)(详情,请参阅材料和方法)。

作为第一个比较,我们测量UV-melting概要文件的RPS12 pre-mRNA在溶剂稀释和拥挤的条件下。代表规范化融化概要及其衍生品(1)如图1(a)。在稀释缓冲条件(70毫米Na的存在⁺和2毫米毫克^{2 +}),pre-mRNA显示一个复杂融化剖面5不同螺旋/线圈转换:两个主导过渡融化中点(值)46°C和78°C和三个小过渡30°C, 53°C, 62°C。几乎相同的跟踪记录,拥挤的溶剂条件(图1(a))。在熔化曲线在图的区别1(b),这两个配置文件添加完美的温度≤40°C和偏离仅略高于40°C。在这个温度下,“拥挤”形象转变温度较高值,然而只有轻微最大限度4°C(图1(c))。这表明一个非常小的结构稳定的成绩单的体积溶剂条件。自从毫克^{2 +}阳离子已知驱动rna的结构稳定,我们想知道是否有更大的影响拥挤代理被蒙面Mg的存在^{2 +}阳离子。因此,我们再分析融化的RPS12-RNA没有毫克^{2 +}。代表规范化UV-melting曲线及其衍生品(1)如图1(一个)。正如所料,在稀释溶剂条件下,融化的配置文件改变大大:主要的过渡转变了9.5°C从44.1°C到34.6°C和以前高温过渡在78°C消失了。然而,像以前一样,PEG-induced稳定是非常小的3.4°C的主要过渡(图1(a)和表1(a))。这表明crowding-driven稳定RPS12 RNA是弱于二价阳离子的稳定,对整体结构的影响的成绩单是分钟。

后续的实验中,我们分析了影响大分子拥挤的探测RPS12 RNA的核苷酸的结构解析。使用选择性2′羟基酰化分析引物延伸(形状)39]。形状监控当地核苷酸构象上的核苷酸的灵活性。在托托282核苷酸被审问使用四种不同溶剂政权描绘在图2。核苷酸的灵活性以归一化单位(SU)和形状,正如所料,RPS12成绩单显示一个复杂的反应模式包括高活性苏(> 0.8)和苏几乎没有响应(< 0.35)序列区域在稀释溶剂的条件下22]。序列延伸与温和(0.35苏≤≤0.8)高灵活性大多是集群和相间不起化学反应的延伸(图序列2(a))。大约一半的核苷酸位置灵活,大约10%是高度灵活的苏(> 0.8)。相同的探测实验在拥挤的条件下执行和SHAPE-reactivity差异两个溶剂体系策划的差异((图)形状概要文件2(b),上面板)。这两个数据集的特点是皮尔森()和斯皮尔曼的()相关系数≥0.92(表就是S1C / D)表明RPS12 RNA的结构几乎是相同的在这两个溶剂政权。

正如预期的那样,比较形状的概要文件没有毫克^{2 +}离子导致了不同的画面。二价阳离子的缺失,都有形状概要主要改变在整个序列(图2(b),中心和底部面板)。大约20%的核苷酸显示反应性变化>苏,显示超过一个额外的33%苏的区别。结果,只有与相关系数的数据集()(crowded-Mg^{2 +}与稀释)和()(dilute-Mg^{2 +}和稀释)(表就是S1C / D和图S2)。这种行为可以转换到2分子结构水平时,归一化反应作为形状pseudo-free-energy约束指导结构预测。图3显示了基因的二维结构RPS12成绩单在溶剂稀释和拥挤的条件下。分子拥挤成绩单如果Mg没有影响^{2 +}离子存在。然而,由于平均和平均核苷酸灵活性略有减少拥挤的溶剂条件,这导致吉布斯自由能的减少()−3.9千卡/摩尔(表1(b)和1(c))。相比之下,在缺乏毫克^{2 +}离子,这两个结构的特点是高约15%和基因的缺失。百分之六十的核苷酸保留他们的结构上下文条件研究(图S3和表S1)。

这些结果的公布的数据符合索托et al ., 2007年,和Tyrrell et al ., 2015(见[3,40])。正如所料,毫克^{2 +}离子产生稳定作用对全球褶皱的RNA分子,这是反映在一个15°C和a−36千卡每摩尔。的贡献PEG-induced大分子拥挤RNA稳定不太明显。拥挤造成增加的主要条件≤2°C和吉布的自由能最大限度地减少4千卡每摩尔。类似的趋势已经被Katari et al ., 2013年,Kilburn et al ., 2013, (18,24]。结果得到的形状,UV-thermal融化实验没有毫克^{2 +}离子乍一看是矛盾的。的挂钩_4000年导致增加了约2°C,但没有影响。平均拥挤条件甚至增加了当地的核苷酸的灵活性和不稳定的影响一些以前稳定的结构元素(表1和图3)。这可以解释为排除体积效应对构象自由度降低抽样最终捕获错误折叠的RNA州(18,40]。或者,可能是主要的过渡代表一个特别稳定的茎结构RPS12 pre-mRNA进一步稳定的挂钩。然而,这个地方并不体现在基于形状数据的差异,全球计算。当毫克^{2 +}存在、电荷补偿由ion-sphere和/或螯合毫克^{2 +}离子导致静电RNA的崩溃,从而产生一个高度紧凑的折叠状态,进一步稳定的排斥体积效应(3,4,17,41- - - - - -45]。的存在和缺乏毫克^{2 +}离子,crowding-induced稳定RPS12 pre-mRNA在整个温度范围内最有可能的结果从一个摄动折叠景观由于减少构象上自由(18]。根据数据,我们得出这样的结论:没有区别的二维结构RPS12 pre-mRNA稀释和溶剂条件拥挤生理毫克^{2 +}离子浓度。这是根据最近的一项研究Tyrrell et al ., 201540]。作者使用的折叠形状比较适配子域的腺嘌呤riboswitch稀释,拥挤,和体内环境的自由和配体的状态。他们证明的二维结构ligand-free适配子是正确完成体外条件尽管不明显3 d交互。此外,配体除了导致更紧凑的构象的形成涉及几个高阶不变的3 d交互绘制稀释溶剂条件拥挤和细胞内。根据我们的数据,我们没有证据crowding-induced扰动的RNA二维结构的三级结构的报道Nakano et al ., 2009年,和Strulson et al ., 201446,47]。然而,虽然形状数据排除任何2分子结构不稳定,我们不能排除一些效果的三维结构RNA,无法检测到的形状(如螺旋包装涉及螺旋/螺旋相互作用)。

RPS12成绩单显示不变当地核苷酸灵活性以及相同的概要融化,稀释和拥挤的条件下考虑到毫克^{2 +}是礼物。这表明一个高度稳定,结构紧凑,显然是不受体积排斥作用。因此,我们得出结论,在体外实验中正确再现体内情况,至少在RNA二级结构的水平。此外,我们得出这样的结论:描述敏感性体外trypanosomal RNA编辑系统(24]不能归因于preedited衬底信使rna的结构,这表明editosome可能的催化机械敏感体积排除条件。MDa Editosomes高分子量(0.8),protein-only复合物和分子拥挤的影响对蛋白质和蛋白质复合物详细描述(了48])。

4所示。结论

线粒体转录成熟在非洲锥虫和其他kinetoplastid生物需要RNA编辑为了生成功能mrna。反应发生的单个线粒体内锥体虫,代表在真核细胞最拥挤的环境。RNA编辑反应的底物是sequence-deficient preedited mrna。序列信息的缺乏,他们的特点是采用非常的不同寻常的特性在稀释溶剂条件下稳定的二级结构。在这里,我们分析了大分子拥挤的效果(s)在线粒体的结构RPS12 pre-mRNA锥体虫线粒体转录的作为一个典型的例子。我们证明大分子拥挤没有影响的2 d褶皱RPS12成绩单,我们得出这样的结论:最小自由能(MFE)结构中确定稀释溶剂条件代表一个好的代理的折叠pre-mRNA拥挤的线粒体溶剂的上下文。我们假设数据可以外推到其他所有在非洲锥虫线粒体转录。

信息披露

手稿是W的博士论文的一部分。马提亚Leeder (http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/5591/)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的德国研究基金会(DFG-SFB902)和博士维生的基础分子化学拥抱。

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