文摘
如今,RNA合成已成为必不可少的工具不仅在分子生物学和医学领域,而且在分子诊断和材料科学等领域。除了合成为反义rna,适体、核糖酶和核技术,oligoribonucleotides携带特定场域修改结构和功能的研究是必要的。这常常需要标签的RNA和合适的光谱记者群。在此,我们描述了合成的功能化单体构件在RNA在公司允许选择性反应与特定的记者或功能的实体。特别是,我们报告的合成5′-O-dimethoxytrityl-2′-O- - - - - -叔-butyldimethylsilyl 3′-保护O-phosphoramidites携带氨基基团的不同长度的核苷和灵活性在杂环基,他们的公司在不同的rna, postsynthetic共轭荧光染料和硝基氧旋转标签。进一步,我们显示的合成核黄素mononucleotide-N-hydroxy-succinimidyl酯和氨基功能化RNA的接合。
1。介绍
在过去的二十年里,RNA合成已成为一个非常活跃的领域。合成rna是大量的应用程序所必需的。反义寡核苷酸,核糖酶、寡核苷酸适配子和siRNAs所需的医疗诊断和治疗以及各种各样的生物化学和分子生物学的研究1,2]。此外,寡核苷酸适配子和记者核糖酶的设计和应用环境诊断(3]。许多其他学科利用合成oligoribonucleotides,例如,材料科学领域,新材料的纳米寡核苷酸轭合物生成(4]。同时,RNA合成已经发展到一定程度,使RNA寡核苷酸的合成任意序列从微克multigram规模。除了2′-O-TBDMS化学,这可能被认为是RNA制备的标准过程,小说策略主要集中在不同的2′-O2′-等保护组O汤姆,2′-O王牌或2′-Otc可用于实验室使用应用特定的单体构件,或已经商业化定义RNA合成(5,6]。
我们实验室致力于研究RNA的化学和生物化学的强烈关注RNA寡核苷酸适配子和核酶。因此,我们合成自然和修改所需的RNA链的设计功能的RNA,我们想调查。此外,我们还会准备RNA分子携带特定站点修改如荧光染料或其他记者组织用于研究RNA结构。大量的单体改性的合成RNA的构建块是商用。了5′-例如,氨基连接基团和/或3′末端标记可以准备用RNA组装(图1)。此外,5′-O-DMT-2′-O-TBDMS 3′-保护O-phosphoramidites 2′-aminouridine (3)和4-thiouridine (4)(图1)是可用的和在RNA结合后可用于特定附件所需的分子实体。
然而,单体构件嘌呤核苷的功能适合postsynthetic接合是完全失踪,和嘧啶系列、尿苷的一些现有的衍生品不提供多品种。因此,目前非常活跃的一部分,我们的研究集中于5′-的合成O-DMT-2′-O-TBDMS 3′-保护O-phosphoramidites携带功能化基团的不同长度的核苷和灵活性在杂环基地,特别是在嘧啶以及C5 C8和C2的嘌呤(图2)。此外,我们目前在修改核苷的合成工作,因为他们出现在tRNA以及同位素浓缩核苷及其公司在特定的RNA序列(其他地方)报道。
在这里,我们专注于氨基改性单体的合成,并入RNA, postsynthetic用荧光染料标记。此外,我们报告的策略准备专门为电子顺磁共振研究中,自旋标记rna和准备flavinmononucleotide (FMN)导数postsynthetically连着一个氨基改性发夹核糖酶导数。所述修改RNA与光谱学家合作用于结构分析功能的RNA, RNA温度计等(7)和RNA四通连接(8]或riboswitches [9),或者在RNA等工程项目的设计FMN-dependent aptazyme [10]。
2。材料和方法
2.1。一般信息
所有的反应都是在干燥的溶剂在氩气氛下进行。溶剂和试剂都从商业来源和购买用作提供,除非另有说明。Pd耦合反应中使用的溶剂释放氧气。所有产品可视化在TLC板(铝表涂上硅胶60 F 254、0.2 nm厚)在254 nm紫外线。链接器分子L1、L2和L3(图3)根据文献合成:alkinyl链接器L1合成根据•克鲁克香克和斯托克(11)和烯基基团合成所描述的总督和谢泼德(12和退稿信等。13]。所有修改phosphoramidites RNA合成中使用之前刚做好的。进步是由薄层色谱监测反应(己烷/乙酸乙酯1:1包含1%的净3)。Phosphoramidites coevaporated几次用干DCM和真空/ P2O5一夜之间在一个干燥器。一个0.1米的解决方案的修改phosphoramidite anhydous acetonitril是刚做好的在固相RNA合成之前使用。
2.2。MALDI-TOF分析
核苷衍生品:1 - 2毫克样品于100年解散L甲醇或水。1.5μ-3.0和1.5 L的示例解决方案μL矩阵的解决方案(30 - 40毫克3-hydroxypicolinic酸(3-HPA)在500年μL MeCN /小时2O 1: 1,大力混合30 s)涨跌互现,和1 - 2μMALDI-plate L的混合物被加载,晒干,并允许结晶。力量上的样本分析microflex质谱仪。该项目被设置为40 - 50芽/测量反射积极模式。激光强度调整这样的强度约为1000所需的信号。
RNA, RNA样本脱盐在交联葡聚糖凝胶过滤G25罚款(通用电气医疗集团)。海水淡化后,样品被溶解在热压处理过的微孔水的浓度大约100 - 500 pmol /μl . 1μ与1 - 2 L的RNA的解决方案是混合μL矩阵解决方案(30 - 40毫克3-hydroxypicolinic酸(3-HPA)在500年μL MeCN /小时2O 1: 1、大力混合30年代)和阳离子交换处理珠子(Dowex 50 WX8,—构成,100 - 200目,ServaFeinbiochemica)。因此,4 - 7μL暂停热压处理过的水微孔的珠子是用移液器吸取250年μL管,水被移除,紧随其后的是除了样本矩阵的解决方案。混合物在rt剩下10分钟然后装到MALDI-plate和干空气。样品测定使用线性负(正)模式与40 - 50 /计量。除了主峰(M−1)−(负模式)或(M + 1)+(积极的模式),偶尔相对应的信号(M−2) / 2观察。
2.3。合成氨基改性单体的构建块
氨基linker-modified尿苷衍生物合成[描述14]。详细linker-modified腺苷衍生物的合成与关注的问题双键异构化报告将在别处(h .阮、b . Appel和穆勒,手稿准备)。
2.4。(8)- 3-Trifluoroacetamidoprop-1-ynyl鸟苷16
8-Bromoguanosine-hydrate15(98%)(1448.4毫克。4.0更易)溶解在干燥DMF(32毫升)。溶液中溶解氧的痕迹被迭代周期的减压和传入氩(3次)。然后,Pd (Ph3P)4(464毫克,0.4更易,0.1 eq。)是补充道。解决方案再次真空,然后用氩饱和。DIPEA (816μ4.8 L,更易与1.2情商。,freshly distilled over CaH2)通过添加了一个注射器,紧随其后的是新增的N-propynyltrifluoroacetamide L3(1208毫克,8.0更易,2.0 eq。)和崔(152毫克,0.8更易,0.2 eq。)。混合搅拌在40°C为20小时。溶剂然后删除给布朗粘性油在DCM /甲醇溶解1:1 (v / v)和过滤去除沉淀。固体残渣被硅胶柱层析法纯化(DCM /甲醇90:10 - 84:16 (v / v))为淡黄色固体。产量:2765.4毫克(6.4更易,80%)。Rf(SiO2;DCM /甲醇60:40 (v / v)): 0.80。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 3.50 (1 H, m, H-5′), 3.64 (1 H, m, H-5′′), 3.84 (1 H, m, H-4′), 4.12 (1 H, m, H-3′), 4.36 (5.4 2 H d J, CH2),4.88 (2 H, m, 2′和哦),5.04 (1 H, d J 4.8,哦),5.40 (1 H, d J 6.0,哦),5.76 (H - 1 H, d, 6.3 J′), 6.57 (2 H, br, NH2),10.20 (1 H, t J 5.4, NH), 10.90 (1 H, br, NH)。13C NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 29.40, 62.06, 70.47, 70.85, 72.75, 85.77, 88.38, 89.12, 110.03, 113.84, 117.65和121.47,q, 288.02 J, CF3),117.24,129.04,150.90,154.12,155.54,156.03,156.51和157.00,q, 36.76 J, CF (C = O)3),156.24。MALDI-TOF: C15H15F3N6O6432.82,432.10,计算发现[M + H]+。
2.5。N17 (2-isobutyryl-8) - 3-trifluoroacetamidoprop-1-ynyl鸟苷
(8)- 3-Trifluoroacetamido-prop-1-ynyl鸟苷160.50(216.5毫克,更易)与无水吡啶coevaporated(3×4毫升),然后溶解在无水吡啶(2毫升)。最终的解决方案是防止水分(干燥管),清除与氩和放置在冰。冰冷的解决方案,TMS-Cl(0.55毫升,更易与4.1,8.2 eq。)添加一滴一滴地通过注射器。冰浴然后删除,混合搅拌2小时。解决方案是在冰上冷却和异丁酸酐(0.13毫升,更易与1.1,2.2 eq。)添加一滴一滴地通过注射器和冰浴了。在室温下搅拌2小时后,再次反应被冰和冰冷水(20毫升)慢慢地补充说,15分钟后在浓氨溶液(1.5毫升)最后2.5氨的浓度。混合物在冰上保持30分钟,然后蒸发干燥。残留是coevaporated与甲苯(3×5毫升)去除水的痕迹,resuspended在甲醇和过滤去除沉淀。滤液集中,在少量的甲醇溶解,吸收硅胶和柱层析法纯化(DCM /甲醇95:5 - 91:9 (v / v))N(2-isobutyryl-8) - 3 trifluoroacetamidoprop-1-ynyl鸟苷作为一个黄色固体。产量:183.3毫克(0.37更易;73%)。Rf(SiO2;DCM /甲醇80:20 (v / v)): 0.63,1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 1.13 (6.9 6 H d J, CH (CH3)2),2.79 (1 H, 9月,6.9 J, CH (CH3)2),3.53 (1 H, m, H-5′), 3.68 (1 H, m, H-5′′), 3.84 (1 H, m, H-4′), 4.17 (1 H, br, H-3′), 4.40 (2 H, s, CH2),4.81 (1 H, br, 2′), 4.91 (1 H, br,哦),5.09 (1 H, br,哦),5.50 (1 H, br,哦),5.86 (H - 1 H, d, 6.0 J′), 10.21 (1 H, br, NH), 11.62 (1 H, br, NH), 12.16 (1 H, br, NH)。MALDI-TOF: C19H21F3N6O7502.84,502.14,计算发现[M + H]+。
2.6。5′-O(4,4′-Dimethoxytrityl)N(6-isobutyryl-8) - 3-trifluoroacetamidoprop-1-ynyl鸟苷18
N(2-isobutyryl-8) - 3-trifluoroacetamidoprop-1-ynyl鸟苷172.4(1174.4毫克,更易)与无水吡啶coevaporated(3×3毫升)和溶解在无水吡啶(10.0毫升)。DMT-Cl(1219.8毫克,更易与3.6,1.5 eq。)是溶解在无水吡啶(3.0毫升),一滴一滴地添加到冰冷的解决核苷/ 2.5小时。6小时后冰冷的温度,薄层色谱分析(DCM /甲醇95:5 (v / v))表明,起始物料完全消耗。甲醇(1.0毫升)被添加到淬火未反应的DMT-Cl, 10分钟后,解决方案集中干燥在真空内。残留是溶解在DCM(100毫升),用5%的水溶液NaHCO洗3(2×20毫升)和水(2×20毫升)。有机层是干/ Na2所以4和集中给一个黄色胶由柱层析法纯化(DCM /甲醇97:3 - 95:5 1% (v / v)含三乙胺)给一个淡黄色泡沫。产量:1671.6毫克(2.08更易,87%)。Rf(DCM /甲醇90:10 (v / v)): 0.44。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 1.11 (6 H, 2×d J 6.9和6.6,CH (CH3)2),2.72 (1 H, 9月,6.9 J, CH (CH3)2),3.11和3.45 (2 H, m, H-5′和H-5′′), 3.69和3.71 (6 H, 2×s, 2×哟3),4.04 (1 H, m, H-4′), 4.31 (3 H, br, H-3′和CH2),4.91 (1 H, m, 2′), 5.04 (1 H, br,哦),5.61 (1 H, br,哦),5.94 (H - 1 H, d, 4.5 J′), 6.73 (4 H, 2×d J 8.7和9.0,芳香),7.23 (9 H, m,芳香),10.85 (3 H, br, 3×NH)。13C NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 18.71, 18.94, 29.33, 34.80, 54.86, 54.91, 64.72, 70.49, 71.36, 72.06, 84.21, 85.21, 89.91, 90.49, 110.02, 113.82, 117.65和121.47,q, 288.5 J, CF3),112.73,112.82,120.83,126.45,127.47,127.78,129.64,129.80,131.52,135.58,144.87,148.24,154.33,155.55,156.05,156.53和157.03,q, 37.0 J, CF (C = O)3),157.88,157.95,180.09。MALDI-TOF: C40H39F3N6O9805.24,804.27,计算发现[M + H]+。
2.7。5′-O4 - (4′-Dimethoxytrityl) 2′- (叔-butyldimethylsilyl) -N(2-isobutyryl-8) - 3-trifluoroacetamidoprop-1-ynyl鸟苷19
5′-O(4,4′-Dimethoxytrityl)N(2-isobutyryl-8) - 3-trifluoroacetamidoprop-1-ynyl鸟苷18(1623毫克,2.02更易)coevaporated与无水吡啶(2毫升×2),干燥的DCM(2×5毫升),保持在真空下一夜之间,然后溶解在无水四氢呋喃(20毫升)。无水吡啶(606μ7.47 L,更易与3.7 eq。)和AgNO3(505毫克,3.0更易,1.5 eq。)被添加。反应混合物搅拌15分钟是给一个白色乳液,和TBDMS-Cl(528毫克,3.43更易,1.7 eq。)是补充道。的反应是防止水分和在室温下搅拌直到TLC (SiO2己烷/乙酸乙酯1:1 (v / v))显示没有起始物料(8.5小时)。乙酸乙酯的反应混合物稀释(50毫升),过滤去除沉淀和洗NaHCO的饱和溶液3(2×20毫升)。有机层是干/ Na2所以4和集中在减压下给白胶,然后采用硅胶柱层析法纯化(己烷/乙酸乙酯85:15 - 40:60 (v / v))给一个淡黄色泡沫。产量:482.3毫克(0.53更易,26%)。Rf(SiO2;己烷/乙酸乙酯1:1 (v / v)含4%甲醇):0.41。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) =−−0.14和0.02 (6 H, 2×s, Si (CH3)2),0.76 (9 H, s, SiC (CH3)3),1.09 (6 H, 2×d J 6.6和6.9,CH (CH3)2),2.70 (1 H, 9月,6.6和6.9,CH (CH3)2),3.19 (1 H, m, H-5′), 3.51 (1 H, m, H-5′′), 3.67和3.69 (6 H, 2×s, 2×哟3),4.09 (1 H, m, H-4′), 4.20 (1 H, m br, H-3′), 4.38 (5.1 2 H, br d J, CH2),4.79 (1 H, m, 2′), 5.95 (H - 1 H, d, 4.8 J′), 6.75 (4 H, 2×d J 8.7,芳香),7.27 (9 H, m,芳香),10.16 (1 H、t、5.1和5.4,NH), 11.38 (1 H, br, NH), 12.14 (1 H, br, NH)。13 c NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) =−5.40−4.91, 17.81, 18.63, 18.88, 25.47, 29.24, 34.77, 54.89, 54.93, 64.49, 70.16, 71.95, 73.74, 84.26, 85.30, 90.66, 109.97, 113.79, 117.61和121.43,q, 288.40 J, CF3),112.82,112.87,126.51,127.55,127.76,129.70,129.78,135.50,135.58,144.86,148.52,154.10,155.54,156.03,156.52和157.01,q, 37.0 J, CF (C = O)3),157.93,157.98,180.07。MALDI-TOF: C46H53F3N6O9如果,918.36计算,发现919.19 [M + H]+。
2.8。5′-O4 - (4′-Dimethoxytrityl) 2′- (叔-butyldimethylsilyl) -N(2-isobutyryl-8) - 3-trifluoroacetamidoprop-1-ynyl guanosinephosphoramidite 14
5′-O4 - (4′-Dimethoxytrityl) 2′- (叔-butyldimethylsilyl) -N(2-isobutyryl-8) - 3-trifluoroacet-amidoprop-1-ynyl鸟苷190.11(67.96毫克,更易)coevaporated与无水吡啶(2×5毫升),干燥的DCM(2×5毫升),保持在真空下一夜之间,然后溶解在无水DCM(2毫升)。最终解决方案,DIPEA (75μ0.44 L,更易与4 eq。)补充说,2-cyanoethyl——紧随其后N, N-diisopropylchlorophosphoramidite (37μL,更易与0.16,1.5 eq)。解决方案是在室温下搅拌。反应是紧随其后的是薄层色谱(层:己烷1:1含有1%茶)。2.5小时后,反应是停了下来,洗NaHCO的饱和溶液3(10毫升)。有机层是干/ Na2所以4和过滤,减压下的溶剂被删除了。残留物被硅胶柱层析法纯化。列挤满了DCM /茶(98:2),残留是溶解在1 - 2毫升DCM /茶(98:2),和列加载。经过30毫升的DCM /茶(98:2),溶剂改为DCM /茶/ MeCN(49: 1: 50, 50毫升)。收集包含所需产品的分数,溶剂被减压。该产品是在一夜之间冻干。31日DMSO-d P-NMR (300 MHz6),两个非对映体:δ(ppm) = 148.98、149.71。
2.9。RNA合成
Oligoribonucleotides phosphoramidite方法合成了淀粉微球基因汇编+ 1μ摩尔比例所描述的其他地方(15]。标准PAC-phosphoramidites以及CPG从ChemGenes或链接技术也获得了支持。BMT (emp生物技术)被用作催化剂16]。修改后的核苷phosphoramidites coevaporated三次与二氯甲烷干燥,保持在真空下2小时,去除溶剂的痕迹,存储在真空/ P2O5一夜之间,和用于低聚糖合成乙腈0.1 - -0.15 M的解决方案。BMT phosphoramidites的解决方案,MeCN保持在0.3纳米分子筛。所有的自然和修改构件的耦合时间是5分钟。所有的合成进行了“trityl-off”。RNA是裂解获得的支持和使用NH deprotected3(30%)和ethanolic甲胺1:1所述混合物和TEAx3HF [17),通过使用10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶纯化。洗脱进行了使用0.5 LiOAc EtOH降水紧随其后。寡核苷酸分析页面并MALDI女士。
2.10。Postsynthetic标签与Alexa488 Oligoribonucleotides Cy5 ATTO647N
5到10 nmol氨基改性RNA被溶解在15 - 25μL 0.1硼砂缓冲,在pH值为9.4 Alexa488耦合反应,在pH值为8.7 Cy5和ATTO647N耦合反应。100年的混合物被添加到解决方案μg染料在5μL二甲基甲酰胺(DMF的染料的解决方案是刚做好的前使用)。一夜之间的耦合反应在室温下进行了在黑暗中。通过凝胶过滤多余的染料被(交联葡聚糖G25好,通用电气医疗集团)。Alexa488和Cy5标记rna被变性纯化页面。样品在90°C变性3分钟,立即受到到15%聚丙烯酰胺凝胶(200×150×1.5毫米),和电泳运行在400 V 5.5小时在黑暗中。乐队对应标记RNA是裂解;RNA是筛选了0.5醋酸锂和乙醇沉淀−20°C (Alexa488产量15 - 37%,26 - 54% Cy5)。ATTO647N标记RNA被反相高效液相色谱纯化。RNA是解决1毫升水和过滤0.45μL滤波器之前让到列。列EC 250/4 Nucleodur 100 - 5 C18 EC (Macherey-Nagel),流量0.5 mL / min,缓冲0.1 M TEAAc pH值(7),5% MeCN,缓冲B 0.1 M TEAAc pH值(7),70% MeCN梯度0% B为5分钟,10 - 55% B在76分钟,55 - 100% B在19分钟(收益率40 - 50%)。
2.11。杂交结构的单链RNA研究RNA温度计
一个条件
的无标号单链寡核苷酸杂交,D1L3 (300 pmol)和A1L3 (300 pmol)在50 mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液溶解,pH值7.4的10毫米MgCl2在100年的总量μl .然后解决方案是混合,在78°C的环境3分钟,离心收集埃普多夫管帽上的蒸汽,在铝膜包装,慢慢冷却到室温。分析了混合15%聚丙烯酰胺凝胶。
条件B
Alexa萤石488 -标记D1L3 (25 pmol)和Cy5-labeled A1L3 (25 pmol), KH溶解在20毫米2阿宝4- k2HPO4缓冲区,pH值6.5的10毫米MgCl250和100毫米氯化钾的总量μl .组件被混合、离心机和孵化在78°C 3分钟。混合物在慢慢冷却到室温的铝膜。杂交是检查15%聚丙烯酰胺凝胶。
2.12。5′-O4 - (4′-Dimethoxytrityl)核黄素21
暂停核黄素20.(1.5 g, 4更易)在干燥的吡啶茶(2毫升,14.4更易),深度贴图(24毫克,更易与0.2),4,4′-dimethoxytritylchloride(1.7克,5.2更易)被添加在氩。4小时后在黑暗中在室温下搅拌,反应就熄了用干甲醇(5毫升)。溶剂蒸发减少压力。残留是溶解在DCM(100毫升)和过滤。清晰的黄色滤液与Na干2所以4和溶剂移除。原油产品的净化柱层析法与DCM /甲醇(98:2)给tritylated产品21作为一个橙色的固体。产量:1.4克(2.1更易,53%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 2.39 (3 H, CH3),2.41 (3 H, CH3),3.20 - -3.17 (m, 2 H), 3.72和3.73 (2×s, 2×3 H, 2×哟3),3.92 (br年代,1 H), 4.23 (br年代,1 H), 4.62 (m 1 H), 4.98 (m, 1 H), 6.85 (m, 4 H, DMT), 7.46 - -7.16 (m, 9 H, DMT), 7.83(年代,1 H), 7.90(年代,1 H), 11.34 (1 H, NH)。质:C38H38N4O8677.26,678.27,计算发现[M−H]- - - - - -。
2.13。2′,3′,4′tri -O-acetyl-5′-O4 - (4′-dimethoxytrityl)核黄素22
5′-O4 - (4′-Dimethoxytrityl)核黄素21(1.4克,2.06更易)在干燥的吡啶(200毫升)在氩气氛下冰浴冷却。后一滴一滴地加入乙酸酐(7.6毫升,80更易),解决方案是在室温下搅拌在黑暗中过夜。然后,添加甲醇(5毫升),溶剂蒸发。柱层析法与DCM /甲醇(98:2)给了标题化合物22橙色的泡沫。产量:1.5克(1.86更易,90%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 1.49(年代,3 H, acetyl-CH3),2.02 (s, 3 H, acetyl-CH3),2.27 (s, 3 H, acetyl-CH3),2.39 (3 H, CH3),2.46 (3 H, CH3),3.12 - -3.05 (m, 1 H), 3.29 - -3.22 (m, 1 H), 3.73 (2×s, 2×3 H, 2×哟3),5.16 - -4.79 (m br, 2 H), 5.24 (m, 1 H), 5.54 (m, 2 H), 6.88 (m, 4 H, DMT), 6.37 - -7.20 (m, 9 H, DMT), 7.64(年代,1 H), 7.89(年代,1 H), 11.40 (1 H, NH)质:C44H44N4O11803.29,804.30,计算发现[M−H]- - - - - -。
2.14。2′,3′,4′tri -O-acetylriboflavin 23
2′,3′,4′tri -O-acetyl-5′-O4 - (4′-dimethoxytrityl)核黄素22(500毫克,0.6更易)溶解在20毫升硝基甲烷。无水ZnBr这个解决方案2(1.25克,5.6更易)补充道。2分钟后,添加醋酸铵的反应就熄了在水(50毫升,1米)。DCM(50毫升)补充说,有机层分离,用盐水洗净(2×20毫升),紧随其后的是蒸发减少压力。原油产品是提取的几次与冰冷的乙醚去除残余DMT。通过这种方式,化合物23(250毫克,0.5更易)获得了一个黄色的固体。产品是用于下一个反应没有进一步净化。MALDI-TOF: C23H26N4O9503.23,502.17,计算发现[M + H]+。
2.15。3 -(四甘醇)丙酸叔丁酯25
四甘醇24(38.8克,200更易)溶解在干燥的四氢呋喃(80毫升)。在氩气氛下,钠(0.2克,8.7更易)补充道。所有的钠溶解后,叔,摘要(7.7 g, 60更易)增加,混合物在室温下搅拌了23个小时。略黄的解决方案是1 M盐酸中和和溶剂蒸发减少压力。残渣再溶解在盐水(80毫升),用乙酸乙酯提取(3×50毫升)。合并后的有机层与硫酸钠是用水洗和晒干。溶剂蒸发后,石油受到在硅胶柱层析法(DCM /甲醇98:2)25为无色油。产量:6.65克(20.6更易,34%)。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 1.45(年代,9 H,叔丁),2.50 (t, 2 H, CH2首席运营官,叔,Bu), 3.74 - -3.60 (m, 18 H,哟2CH2O)。MALDI-TOF: C15H30.O7345.16,322.20,计算发现[M + Na]+。
2.16。3 -(四甘醇)丙酸叔丁酯Phosphoramidite 26
3 -(四甘醇)丙酸叔丁酯253.1 (1 g,更易)coevaporated三次与二氯甲烷,然后溶解在25毫升DCM在氩。这个解决方案,新鲜蒸馏DIPEA(2.5毫升),2-cyanoethyl -N,N-diisopropropylchloro-phosphoramidite(0.85毫升,3.6更易)补充道。1.5小时后,加入1毫升甲醇反应停止。乙酸乙酯的混合物被稀释(20毫升)和茶(1.5毫升),洗NaHCO的饱和溶液3(25毫升)和盐水(25毫升)。有机层与Na干2所以4和减压下的溶剂被移除。原油产品是coevaporated三次用干DCM和存储在一个疏散与氯化钙干燥剂。根据薄层色谱分析,phosphoramidite足够纯粹用于下一个反应没有进一步净化。31日P NMR (300 MHz, CDCl3),两个非对映体:δ(ppm) = 148.45、149.37。
2.17。5′-O-(3 -(四甘醇)丙酸叔丁酯-β-cyanoethylphosphoryl) 2′, 3′, 4′tri -O-Acetylriboflavin 27
所有原料都coevaporated分别用干扩张型心肌病。核黄素导数23(100毫克,0.2更易)溶解在干MeCN(15毫升)。这个解决方案,phosphoramidite26(136毫克,0.26更易)2毫升干燥MeCN BMT(192毫克,1更易)3毫升MeCN补充道。反应混合物在室温下搅拌1小时。0.2碘的溶液的混合四氢呋喃/吡啶/ H2O(2: 1: 1)补充道。十分钟后,亚硫酸氢钠在水中(5%)添加到棕色已经消失了。混合物与DCM(40毫升)稀释。有机层与碳酸氢钠和盐水洗,最后干/硫酸钠。溶剂蒸发减少压力。残留物被反相高效液相色谱纯化。列VP125 Nucleosil 120 - 10 C18 ec (Macherey-Nagel),流量0.5 mL / min,洗脱液10%的甲醇,甲醇洗脱液B 70%,梯度在5 0 - 70% B简历,B在3 CV 70 - 100%, 100% B 3简历。产量:59.5毫克(63 nmol, 32%)。1H NMR (300 MHz, CDCl3),两个非对映体:δ(ppm) = 1.44(年代,9 H,叔丁),1.79(年代,3 H), 2.21 (2×s 3 H), 2.35和2.33 (2×s 3 H), 2.44(年代,3 H), 2.50 (t, 2 H, CH2首席运营官,叔布鲁里溃疡),2.57(年代,3 H), 2.81 (m, 2 H, CH2- cn), 3.74 - -3.60 (m, 18 H,哟2CH2O), 4.40 - -4.21 (m, 6 H, P-O-CH2),5.33 - -4.89 (br, 2 H), 5.41 (m, 1 H), 5.50 (m, 1 H), 5.65 (m, 1 H), 7.60和7.59 (2×s 1 H), 8.02(年代,1 H), 8.80和8.76 (2×s 1 H, NH)。MALDI-TOF: C41H58N5O18939.35 P,计算,发现962.62 [M + Na]+。
2.18。5′-O-(3 -(四甘醇)丙酸-β-cyanoethylphosphoryl) 2′, 3′, 4′tri -O-Acetylriboflavin 28
完全耦合复合保护27(25毫克,26.6 nmol)治疗1毫升DCM /组织(1:1)在室温下1小时。随后,溶剂蒸发压力减少,残留是反相高效液相色谱法测定纯化给自由酸作为一个橙色的固体。列VP125 Nucleosil 120 - 10 C18 ec (Macherey-Nagel),流量0.5 mL / min,洗脱液10%的甲醇,甲醇洗脱液B 70%,梯度在5 0 - 70% B简历,B在3 CV 70 - 100%, 100% B 3简历。收益率18.8毫克(21.3 nmol, 80%)。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6),两个非对映体:δ(ppm) = 1.61(年代,3 H), 2.20(年代,3 H), 2.25(年代,3 H), 2.41(年代,3 H), 2.43 (t, 2 H, CH2羧基),2.51(年代,3 H), 2.93 (m, 2 H, CH2- cn), 3.63 - -3.48 (m, 18 H,哟2CH2O), 4.41 - -4.10 (m, 6 H, P-O-CH2),4.83 (d, 1 H), 5.18 - -5.00 (br, 1 H), 5.32 (m, 1 H), 5.48 (m, 2 H), 7.73(年代,1 H), 7.90(年代,1 H), 11.40 (1 H, NH)。MALDI-TOF: C37H50N5O18883.29 P,计算,发现906.43 [M + Na]+。
2.19。5′-O-(3 -(四甘醇)丙酸磷酰基)核黄素29
在4毫升的甲醇,30%的氨溶液核黄素导数28(15毫克,17 nmol)溶解并在室温下搅拌。30分钟后,谱分析显示完整的转换产品。溶剂的蒸发,坚实了1毫升去离子水和遭受到短DOWEX列(H+形式,4×1.5厘米)。产品与水和干筛选了在真空内。产量:11毫克(15.6 nmol, 92%)。1H NMR:(600 MHz, DMSO-d6):δ(ppm) = 2.40(年代,3 H), 2.43 (t, 2 H, CH2羧基),2.49(年代,3 H), 3.61 - -3.47 (m, 16 H,哟2CH2O), 3.64 (m, 1 H), 3.86 (m, 1 H), 3.90 (m, 1 H), 4.00 (m, 2 H), 4.11 (m, 1 H), 4.24 (m, 1 H), 4.65 (d, 1 H), 4.89 (m, 1 H), 7.90 (s, 2小时),11.35 (1 H, NH)。MALDI-TOF: C28H41N4O15704.23 P,计算,发现705.32 [M + H]+。
2.20。介绍旋转标签包含4-Thiouridine RNA
修改后的核苷酸4-thiouridine成立在rna预选位置,用于与1-oxyl-2 postsynthetic自旋标记,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-methyl) methane-thiosulfonate或N——(1-oxyl-2、2、5、5-tetramethyl-3-pyrrolidinyl)碘乙酰胺。RNA样本孵化2小时在室温下的200倍超额二硫苏糖醇(DTT)在50岁μL(100毫米磷酸钠河豚(pH值8.0)。的还原剂被软化使用离心过滤器,其次是冻干的RNA。自旋标记被孵化100一夜之间进行μ解决各自的RNA在90毫米钠磷酸盐缓冲剂(90% v / v) (pH值8.0)和DMF (10% v / v)的10倍超额1-oxyl-2, 2, 5, 5-tetramethylpyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate或N——(1-oxyl-2、2、5、5-tetramethyl-3-pyrrolidinyl)碘乙酰胺,分别。飘散的硝基氧试剂被软化和冻干如上所述。自旋标记效率从10%到100%不等。
2.21。介绍旋转标签RNA含有2′-Aminouridine
rna合成2′-aminouridine在预定义的位置,随后自旋标记。
2.21.1。反应(5-tetramethylpyrrolin-3-carboxylat 1-Oxyl-2 2 5日)N-Hydroxysuccinimidyl酯
RNA在80毫米硼砂缓冲溶液(pH值8.5)(90% v / v)、DMF (10% v / v)包含10毫米孕育了氯化钠5小时37°C的500倍超额(5-tetramethylpyrrolin-3-carboxylat 1-oxyl-2 2 5日)N-hydroxysuccinimidyl酯。与300年方产品和未反应的试剂提取μL氯仿在室温下沉淀的标记RNA乙醇紧随其后。颗粒在水解决,解决方案是使用离心过滤器,软化最后,冻干样品。收益率在70%和80%之间。
2.21.2。反应与4-Isocyanato-2 6-tetramethylpiperidyl -N氧化物
RNA在50 mM硼砂缓冲溶液(pH值8.5)(50% v / v)、DMF (20% v / v)和甲酰胺(30% v / v)冷却到−8°C和孵化2小时的15倍超额4-isocyanato-2, 6-tetramethylpiperidyl -N氧化物。与300年方产品和未反应的试剂提取μL氯仿在室温下沉淀的标记RNA乙醇紧随其后。颗粒在水解决,解决方案是使用离心过滤器,软化最后,冻干样品。收益率在75%和100%之间。
3所示。结果与讨论
3.1。自然和修改合成RNA与商用构建块
RNA的耦合反应phosphoramidites不如DNA phosphoramidite积木的肤浅;因此,耦合收益率通常略差。因此,化学合成的RNA寡聚物的长度是有限的。因此,到目前为止,我们优先合成nonmodified超过70基地的RNA分子在体外转录技术描述(17]。短rna nonmodified和修改我们的实验室是由固相合成。我们的程序是基于2′-O- - - - - -叔,butyldimethylsilyl (TBDMS)核苷保护和包括顺序耦合β氰乙基- (N, N′5′-二异丙基)phosphoramiditesO-dimethoxytrityl-2′-O-TBDMS核苷是由描述的方法(17]。oligoribonucleotides的组装,我们主要使用CPG或聚苯乙烯珠第一个核糖核苷衍生物是琥珀酸通过3′-哦组作为一个附加链接。标准的合成是在微摩尔规模,phosphoramidites耦合,我们使用5-benzylmercaptotetrazole激活(16]和耦合时间5分钟。在这种情况下,收益率在联轴器通常在99%左右。我们有各种氨基酸的合成和4-thiouridine-modified rna(表1,2,3)postsynthetically携带荧光染料,旋转标签,或黄素单核苷酸如下所述。
5′和3′氨基修饰符,以及介绍了4-thiouridine在核糖核酸固相合成使用商用构建块(图1)。而对于5′氨基修饰符,使用标准的耦合条件,介绍了4-thiouridine连续两个耦合的5分钟每个使用新鲜amidite解决方案。链组装完成后,乳沟的坚定支持和删除base-protecting组通过NH溶液治疗3(30%)和ethanolic甲胺1:1的混合物在室温下2 h。我们发现这个协议在NH的使用优势3/甲醇,因为我们之前已经应用18]。最后,2′-O-TBDMS组被氟离子治疗。在1米四丁铵氟化物是通常用于此目的,我们更喜欢使用三乙胺trihydrofluoride首先提出了Gasparutto et al。(19]。结合极性非质子溶剂,温度升高,在速度和可靠性(这个试剂提供了优势20.]。因此,我们使用三乙胺trihydrofluoride / DMF (3: 1) 55°C的高效去除2′- 1.5小时O-TBDMS组。去后,寡核苷酸是由降水脱盐n丁醇和纯化对变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱法。寡核苷酸的收益表所示1- - - - - -3在1到400 nmol净化后的范围。
3.2。合成的氨基改性和合并RNA RNA构建块
合作研究项目中,三维架构的结构化的RNA, RNA温度计(例如,7)或RNA四通连接(8),研究了定量荧光共振能量转移(FRET)测量。绝对距离测量的烦恼,探头连接到样品的微环境是非常重要的。然而,构建块内部的商业可用性标记的RNA是罕见的。因此,经常和一个脱氧的糖分子的一部分在内部应用标签的位置结构研究。为了提供一组核苷酸,对公司在RNA可以用于RNA功能化所需的内部网站,我们开始努力合成各种核糖核苷phosphoramidite积木氨基基团的不同长度和灵活性在杂环基地。我们选择一个短(L1)和一个长(L2),而灵活的链接(图3)耦合的碱基见鬼化学(12,13)和一个简短的炔基链接器(L3)(图3Sonogashira耦合引入的)(11]。
第一行的实验,我们已经附加了三个不同的连接器在C5尿苷的钯催化交叉耦合反应描述(14)(见5,6,7在图2)。
此外,与烯基腺苷衍生物连接器L1和L2在C8或C2是准备在类似条件下用于尿苷衍生品5和6。然而,一个显著的区别是双键的形成同分异构体的偶联反应。尽管这种现象是众所周知的钯催化领域的交叉耦合反应,我们惊讶的观察一个强大的影响催化剂的性质形成的异构体。彻底调查的各种催化剂和反应条件允许我们调整反应对一两种同分异构体的催化剂的选择(h .阮、b . Appel和穆勒,手稿准备)。具体的氨基改性腺苷衍生品如图2获得了Na2[PdCl4)(8,9,12与催化剂palladacycle)或(11)[21]。
phosphoramidite构建块7,10,13,14携带propargylamino链接器(图2)是由Pd-catalyzed Sonogashira交叉耦合。由于反应条件温和与赫克化学相比,成功Sonogashira反应可以进行充分保护核苷。保护是不重要的;然而,我们发现引入糖和基地保护团体前交叉耦合反应有利,因为在这种情况下,总收率较高。合成开始引入DMT和TBDMS保护集团通过标准程序(22,23]。然后,propargylamino链接器L3被耦合到nucleobase Sonogashira反应,最后,phosphoramidite准备如上所述的C5-propargylamino尿苷的导数。
腺苷衍生物在C8和C2炔丙基氨基链接器准备沿着相同的路线。然而,作为一个额外的步骤,环外的基地的氨基保护之前介绍的其他保护组和链接单元。
propargylamino链接器也附在C8鸟苷从8-bromoguanosine开始。的环外的氨基保护作为一个酰胺使用异丁酸酐。介绍了DMT和TBDMS组根据标准方法(22,23如上所述,最后,phosphoramidite准备4情商。乙基二异丙基胺和1.5的情商。2-cyanoethyl -N, N-diisopropylchlorophosphoramidite(图4)。
几个准备phosphoramidite积木被成功纳入寡核苷酸使用标准固相化学(表1)[17]。修改后的phosphoramidites与二氯甲烷被重复coevaporating彻底干燥。解决amidite后在干燥的乙腈浓度的0.1到0.15 M,增加了分子筛,解决方案是在室温下保持一小时之前使用。氨基改性phosphoramidites耦合了5分钟,标准的构建块。耦合收益率在99%范围内,与未修改的phosphoramidites可比。在标准条件下合成之后,寡核苷酸deprotected [17),领导也切除组织保护链接器的脂肪族胺组。净化是由凝胶电泳,其次是MALDI-TOF MS分析。表4显示了一些示例大量MALDI-TOF-MS决心对一些合成RNA寡核苷酸。
3.3。Postsynthetic标签
氨基改性rna随后被用于各种染料的附件。由于选择性的反应活性和脂族胺羧酸,完全使用deprotected RNA没有明显的副反应的危险在糖羟基或芳香族氨基酸组的基地。在多数,活化酯Cy5, ATTO647N Alexa488用于postsynthetic标签(图5)。
Cy5和ATTO647NN-hydroxy-succinimidyl (NHS)酯。Alexa488, NHS-ester只能是复杂结晶5 -和6-esters(图的混合物6)。与染料反应后,rna贴上gelelectrophoresis异构体可以被分离。然而,我们发现它更高效使用tetrafluorophenyl Alexa488 (TFP)酯,可作为纯5-isomer(图6)。
对于每个偶联反应,数量5到10 nmol RNA是溶解在硼砂缓冲在pH值为8.7标签和Cy5 ATTO647N和pH值9.4与Alexa488反应。添加了染料溶解在DMF,反应在室温下进行了在黑暗中过夜。后来,多余的染料是通过凝胶过滤。净化dye-labeled rna是由页面,rp - (Cy5 -和Alexa488-labeled链)或(ATTO647N-labeled寡核苷酸)。成功的标签MALDI-TOF MS分析证实了。数据表所示5女士代表的例子分析了染料标记的寡核苷酸。
图7显示了MALDI-TOF-MS光谱的寡核苷酸2-L3-A ATTO647N标签之前和之后,作为一个例子的优质标记寡核苷酸。
(一)
(b)
3.4。杂交单链rna的结构的研究
证明氨基基团的荧光标签不干预的单链寡核苷酸杂交,杂交的Alexa萤石488 -标记D1L3和互补Cy5-labeled A1L3准备(图8)。寡核苷酸及其混合可视化与紫外线光照在254和365海里。从凝胶,可以看到两个dye-labeled单链寡核苷酸完全杂化。
在一个平行实验,Alexa488-labeled D1L3和Cy5-labeled A1L3在KH溶解2阿宝4- k2HPO4缓冲区包含MgCl2根据所需的缓冲和氯化钾,烦恼实验进行的条件。混合物混合,在78°C的环境中3分钟,慢慢冷却到室温。本机的反应分析聚丙烯酰胺凝胶电泳(数据未显示)证实量化杂交。的几个合成rna在杂交其互补链用于荧光测量,特别是在单分子检测(SMD)和时间相关单光子计数(TCSPC)批量实验14]。
3.5。合成一个激活FMN导数Amino-Functionalized Postsynthetic标签的RNA
在以前的工作中,我们设计了FMN响应发夹aptazyme可以开启和关闭在一个可逆的模式(10]。所示,可以从其绑定的口袋FMN异咯嗪环的减少,这是与几何形状的变化和随后失去了约束力。在原系统,FMN外部补充说,需要400倍过度饱和的结合位点aptazyme并获得功能响应。当前的工作重点是工程一个发夹aptazyme FMN是共价连接通过一个合适的连接器。这个小分子装置应该是有利的熵的成本单核苷酸FMN绑定的适体和迭代周期的可逆转换。为了这个目的,一个合适的FMN导数postsynthetic标签的氨基改性RNA合成。最近的实验用不同的单核苷酸FMN衍生品只显示异咯嗪环的系统需要与aptazyme交互,而磷酸核糖单位以及似乎并不扮演了重要的角色(t . Marschall和s·穆勒,未发表的观察)。因此,我们决定把一个包含链接器的核糖链羧基核黄素随后可以postsynthetically amino-functionalized RNA中描述的数据5,9,10。
从核黄素,首先一个完全保护核黄素合成了导数。5′-哦组通过保护chemoselective tritylation主要与DMT-Cl羟基吡啶。其余二羟基与乙酸酐反应给予充分保护的导数22良好的收益率(83 - 90%)。5′-哦的选择性去集团在酸性条件下(2%在DCM DCA)导致的形成副产品具有相同的分子质量为主要产品。这个建议的迁移在DMT去保护条件下乙酰基。之前已被证明在酸性条件下,乙酰基的C4′-哦组可以移动到邻近的C5′-哦组(24]。两个同分异构体的分离在硅胶柱层析法没有成功。因此,我们寻找替代程序。另外,酸,也ZnBr2已经被认为是优越的试剂去除DMT组(25,26]。事实上,使用ZnBr2在干燥的硝基甲烷导致的形成所需的产品23在几分钟内,没有乙酰迁移。然而,在净化detritylated核黄素的导数通过柱层析法,观察乙酰基保护组再次迁移。因此,固体原油产品只是冰冷的乙醚洗几次,产生复合23令人满意的纯度。
的合成羧酸包含链接器组件,四甘醇反应了叔,丙烯酸丁酯(图10)。这个迈克尔加成的产物转化为相应的phosphoramidite 2-cyanoethyl -N,N-diisopropropylchlorophosphoramidite标准程序(27]。核黄素导数之间的偶联反应23和链接器phosphoramidite26实现了在乙腈BMT激活之后,与水溶液中氧化碘给flavinmononucleotide的导数是什么27。完全保护FMN导数是对三氟乙酸二氯甲烷消除酸不稳定叔丁保护组(28)。净化后的游离酸形式FMN导数,rp,乳沟的β氰乙基乙酰基是通过在氨30%甲醇搅拌。氨溶液的蒸发和后续治疗DOWEX (H+—构成)产生所需的产品29日在激活在NHS酯用于postsynthetic RNA功能化。
FMN敏感发夹aptazyme是化学合成的三股或具有系统使用phosphoramidite方法。为了方便单核苷酸FMN导数寡核苷酸的耦合,2′-aminouridine或5-propargylaminouridine(图11)介绍了预定义的RNA链的位置,提供脂肪胺的选择性吸附FMN导数(表3)。职位适合单核苷酸FMN附件已经定义在基础的结构模型的FMN适配子(28PyMOL的帮助下。
(一)
(b)
为了几单核苷酸FMN导数氨基改性的RNA,生成一个NHS-ester原位通过反应不受保护的FMN导数29日1.2情商。TSTU和2情商。DIPEA一小时在室温下在DMF(图12)。活性酯的形成被谱质谱监测。毕竟免费的羧酸转化为其NHS-form,单核苷酸FMN导数是耦合的氨基酸的轴承寡核苷酸。成功的耦合是经聚丙烯酰胺凝胶电泳(图12)。的功能特性导致核糖酶活性测定FMN-RNA结构目前正在进步。
(一)
(b)
3.6。专门Spin-Labeled rna的合成
在一个合作项目的结构分析四环素依赖riboswitch [9上面描述的FMN响应aptazyme]和[10)通过电子顺磁共振(EPR)谱,我们综合准备rna携带合适的标签在一个预定义的自旋。定点spin-labeling最初开发的基本策略和SH的蛋白质和涉及修改群一个适当的半胱氨酸选择性顺硝基氧试剂。将同样的技术应用于RNA,标签最初是通过将一个鸟嘌呤核苷monophosphorothioate 5′端spin-labeling紧随其后的硫(29日]。的策略是延长对特定站点介绍phosphorothioate组RNA骨干位置或修改基地如4-thiouridine和随后的附件的适当激活硝基氧旋转标签(30.- - - - - -32]。最近工作采用脂肪族氨基酸组在2′-安置的附加特定的糖残基或杂环基(33- - - - - -35]。
我们使用两种不同的策略,结合4-thiouridine或2′-aminouridine成RNA紧随其后postsynthetic反应与硝基氧旋转标签。为反应4-thiouridine含有rna (1-oxyl-2、2、5、5-tetramethylpyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate (TPM-MTS)和N- (1-oxyl-2、2、5、5-tetramethyl-3-pyrrolidinyl)碘乙酰胺(TMP-IAA)使用,反应2′-aminouridine含有RNA, (1 oxyl-2, 2、5、5-tetramethylpyrrolin-3-carboxylate) -N-hydroxysuccinimidyl酯(TMC-NHS)或4-isocyanato-2 6-tetramethylpiperidyl -N氧化物(TEMPO-NCO)(图13)。正如上面已经提到的,12修改rna VW1 VW12表所示2内合成四环素敏感核糖核酸适体的结构研究[9]。HPAS11和HPAS16合成和自旋标记的电子顺磁共振研究人工黄素单核苷酸响应riboswitch [10]。
rna通过4-thiouridine标记,反应与TPM-MTS旋转标签是有利的,因为最初的EPR测量显示,TMP-IAA标签性能不佳,大概是因为太移动由于而灵活的CH2-CO-NH-CH2垫片(图13下方)。因此,大多数4-thiouridine含有rna是少的反应与TPM-MTS介绍移动硝基氧旋转标签。表中所示的收益率2在五个标签复制反应为每个单独的RNA。因此,标记效率的变化观察到对个人表明RNA核糖核酸适配子的结构显著影响标签的反应,使自旋标记个体尿苷依赖于特定位置的适配子序列。
第二点,也许可以解释观察到的标记效率低是相当不稳定的二硫键连接旋转标签尿嘧啶残留。因此,作为替代方案,我们还研究了自旋标记条件通过RNA糖磷酸骨架(图14)。为此,rna含有2′-aminouridine在特定位置(HPAS11 HPAS16)合成并使用TEMPO-NCO或TMC-NHS标记。它已经在文献中描述的位阻2′nh2集团阻碍反应与NHS酯(36]。因此,我们已经延长了反应时间从15分钟到4个小时,用500倍的NHS-reagent克服反应低收益率的问题。相反,NHS酯、异氰酸酯被证明几乎定量反应2′氨基糖(33]。然而,不太挑剔,副反应的碱基观察当高过量的异氰酸酯试剂使用(37]。作者有优化的反应条件,这样2′氨基酸组有选择地修改没有并发副反应。,他们观察到增加了修改后的寡核苷酸的收益率降低温度,这大概是镇压异氰酸酯水解(竞争的结果37]。同时行标签在不同条件下的反应,我们还研究了反应条件交付spin-labeled RNA与高产量和高品质。最好的结果与一个只有15倍过量的异氰酸酯试剂在RNA,和反应温度−8°C。在这种情况下,标记效率约80%是可重复获得两个标记试剂与所有RNA样本(表2)。为了避免副反应,我们添加了自旋标记试剂只有一次15倍超额即使它最初描述的重复添加试剂给几乎定量的结果(33]。rna的EPR谱表明,共轭通过旋转标签2′氨基酸组相当(周宏儒无法移动。Steinhoff,奥斯纳布吕克大学口头信息),使通过这个职位最优惠的标签。这有点奇怪,流动的节奏似乎更有限的TPC -标签,因为六元环piperidyl比5构象上更灵活的吡咯啉环。显然,间隔单位的性质(尿素与酰胺键)也拥有强大的影响力。总而言之,RNA序列的特定上下文表所示22′氨基糖标签优于4-thiouridine标记的效率和静止。
4所示。结论
如上所述,RNA的化学合成提供了位点引入修饰核苷的可能性。这是一个重要的优势酶过程,使RNA合成大量的研究必不可少的工具在不同的领域。我们已经成功地合成了一系列单体构件在RNA在公司允许postsynthetic附件光谱记者团体或其他所需的功能。本文介绍的氨基改性单体RNA的化学家的工具盒。由于不同长度和灵活性的连接器,脂肪族氨基酸组postsynthetic功能化,结缘RNA分子实体有不同程度的动态自由。这是荧光光谱研究特别感兴趣,因为系统错误可能由于位阻的荧光染料,或者相反太移动,限制了测量的准确性。因此,使用我们的氨基酸链接器U系列(图的构建块2),一个广泛的链接器长度的影响分析和刚度为测量的准确性进行了(14]。结果将为更复杂的RNA结构动力学的研究。同样,电子顺磁共振光谱分析的RNA会获利新的构建块,自旋转标签附加到感兴趣的RNA,受到相同的条件和限制荧光染料荧光光谱。
最后,我们合成一个FMN-RNA共轭用于FMN响应aptazyme的功能性研究。这个例子表明,有很多复杂的RNA的RNA工程和建筑的空间设备。有机化学提供了大量的可能性准备适当的修饰符,可以激活postsynthetically氨基改性RNA, RNA携带或等其他功能例如硫醇组,或炔烃和叠氮化用于标签,点击化学(38]。因此,结合合成路线适当地激活修饰词的发展,rna可以与各种各样的共轭标记,使核酸不仅可见光谱实验中,还添加新功能演示与所述RNA-FMN共轭。
缩写
| CE: | 氰乙基 |
| DCM: | 二氯甲烷 |
| DIPEA: | 二异丙基乙胺 |
| 直接存储器存取: | 二甲胺 |
| 深度贴图: | Dimethylaminopyridin |
| DMF: | 二甲基甲酰胺 |
| DMT: | Dimethoxytrityl |
| MeCN: | Acetonitril |
| TBDMS: | 叔,butyldimethylsilyl |
| 茶: | 三乙胺 |
| BMT: | (1)- Benzylmercapto 1H四唑 |
| TEMPO-NCO: | 4-isocyanato-2 6-tetramethylpiperidyl -N-oxyl |
| 组织: | 三氟乙酸 |
| TMC-NHS: | (5-tetramethylpyrrolin-3-carboxylat 1-oxyl-2、2、5) -N-hydroxysuccinimidyl酯 |
| TMP-IAA: | N——(1-oxyl-2、2、5、5-tetramethyl-3-pyrrolidinyl)碘乙酰胺 |
| TPM-MTS: | (5-tetramethylpyrroline-3-methyl 1-oxyl-2、2、5) methanethiosulfonate。 |