一个ssDNA适配子块Anti-FLAG M2抗体的功能

文摘

使用SELEX(由指数富集配体)系统的进化,我们偶然发现了一个ssDNA适体结合选择性anti-FLAG M2抗体。适体由两个主题(CCTTA和TGTCTWCC)隔开2 - 3基地,和消除一个或另一个主题废除绑定。DNA适体和标志肽争夺绑定antigen-binding口袋的M2抗体。此外,适配子筛选了FLAG-tagged蛋白质的抗体,表明蛋白质纯化的商业应用。这些发现证明使用SELEX开发的可行性ssDNA寡核苷酸适配子块特定抗体的功能,功能,可能导致小说的发展为系统性红斑狼疮患者的治疗模式,风湿性关节炎,和其他自身免疫性疾病。

1。介绍

抗核抗体是系统性红斑狼疮的诊断标记,类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病(1]。在这些B淋巴细胞疾病,多种自身抗体是针对核自体抗原,包括核糖核蛋白,核小体,染色质,分布(ssDNA, RNA和dsDNA)。其中,anti-DNA抗体一直是最广泛的研究(2]。Anti-DNA抗体结合的高亲和性单或双链DNA和许多倾向于与嘧啶基地(3,4]。一些报告也描述了与自体抗原肽抗核抗体交叉反应和沉积在大脑中,肾脏,和皮肤(5- - - - - -9]。调查人员提出的几种,这inflammation-mediated组织损伤的沉积可能是一个原因,尤其是在肾炎肾脏发病率的主要来源(1,2]。在系统性红斑狼疮小鼠模型,试图阻止这些交叉反应的抗体的功能使用肽寡核苷酸适配子,要么来自他们的同族自体抗原或从噬菌体展示肽库(10,11]。在某些情况下,肽适体竞争力与反核相关自身抗体,从而防止抗体介入组织损伤(10,11]。因此,直接抗体抑制可能是一个有效的治疗自身免疫性疾病患者由抗核抗体的存在。另一种可行的方法来阻止抗核抗体可能利用DNA寡核苷酸适配子,鉴于这些抗体进行DNA的高亲和性和特异性核苷酸的证据基础。但这种方法显然已被开发,可能由于缺少开发DNA寡核苷酸适配子块的可行性报告特定抗体的功能。

采用一种自适应技术定义的序列特异性DNA / rna结合蛋白是SELEX(系统演化指数富集配体的)。SELEX,感兴趣的蛋白质作为选择矩阵从池中获取的高亲和性的DNA结合位点随机DNA分子的12,13]。这个游泳池是一个包含随机寡核苷酸组成的核心(35基地大小)两侧PCR启动序列。随机的核心是由化学合成中使用的混合四核苷phosphoramidites随机的在每个位置。捕获后,选中的DNA分子reamplified PCR,然后进一步丰富通过一轮轮的选择。4 - 6轮后,选中的DNA分子克隆和DNA测序确定任何常见的图案被感兴趣的蛋白质。SELEX可以应用于选择ssDNA, dsDNA甚至RNA分子(12,13]。这是一个强大的工具,被用来优化核酸配体为大量的蛋白质,甚至一些不正常与DNA或RNA进行交互。作为一个例子,SELEX是开发利用RNA寡核苷酸适配子结合凝血因子,包括凝血酶(14)、血管性血友病因子(15],和因素IXa [16]。在所有三个案例中,选中的RNA寡核苷酸适配子选择性地与目标和相应的蛋白质相互作用,在这个过程中,抑制血液凝固的活动。第二代的寡核苷酸适配子了,其中,一些已进入临床试验患者的凝血障碍(15]。

使用SELEX,我们偶然发现了一个ssDNA序列结合选择性M2抗体,常用试剂,识别标记抗原决定基(DYKDDDDK)。DNA适体和标志肽争夺绑定到M2抗体,从而允许适配子洗提Flag-tagged蛋白质固定化M2抗体,普遍采用在蛋白质纯化过程。除了这个直接应用在蛋白质纯化,鉴定这个DNA适体演示了使用SELEX开发的可行性寡核苷酸适配子块特定抗体。将这种方法应用于抗核抗体可能导致小说发展的系统性红斑狼疮患者的治疗策略,风湿性关节炎,和其他自身免疫性疾病。

2。材料和方法

2.1。材料

寡核苷酸是由埃普利合成的核心设施(奥马哈,内布拉斯加州大学医学中心的东北)。质粒pTetFLAGhTRF2^{45 - 501}是一份礼物从Titia德兰格博士(洛克菲勒大学,纽约,纽约)17]。多核苷酸激酶和铂可以和Taq DNA聚合酶从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德。所有其他酶来源于Fermentas(汉诺威,MD),新英格兰生物学实验室(贝弗利,MA), Promega(麦迪逊,WI),或表达载体(CA)卡尔斯巴德。TnT快速耦合转录/翻译系统从Promega购买(麦迪逊,WI)。的γ- - - - - - (³²P] atp (4500 Ci /更易)从议员购买生物制剂(梭伦,哦),和L - (³⁵S]蛋氨酸(1000 Ci /更易)是获得PerkinElmer(波士顿)。m - 450磁珠涂上一只羊anti-mouse IgG抗体收到Dynal生物技术,Inc .(纽约成功湖)。3 xflag肽和其他化学物质来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。Mini-PROTEAN 4% -20% sds - page凝胶从Bio-Rad购买(大力神,CA)。

2.2。抗体

鼠单克隆抗体标记标签(免疫球蛋白₁克隆M2) ? / OBFC1(免疫球蛋白_{2 ak党}克隆3 g12-1b7)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。正常小鼠免疫球蛋白(猫。# sc - 2025)和anti-vimentin鼠单克隆抗体(免疫球蛋白₁克隆得到了sc - 6260)从圣克鲁斯(圣克鲁斯,CA),就像兔多克隆抗体对TRF2(猫。# h - 300)。还购买了鼠标PTOP单克隆抗体(免疫球蛋白₁克隆1 d8-1b6;罗福斯生物制剂,利特尔顿有限公司)和TIN2(免疫球蛋白₁克隆59 b388, AbCam, Cambridge, MA)。

2.3。表达载体

的质粒pcDNA3.1-Flag-Stn1是由人类Stn1序列插入质粒pcDNA3.1-Flag。Stn1放大从质粒的编码序列pOTB7-Stn1(基因库# BC017400;美式文化收藏、马纳萨斯,弗吉尼亚州)使用铂可以DNA聚合酶和引物5′-GACTGACAATTGGGTGGTATGCAGCCTGGATCCAG-CC-3′, 5′-GACTGAAGATCTTCAGAACGCTGTGTAGTAGTG-3′。PCR产品然后削减MfeI / BglII和插入到EcoRI / BamHI pcDNA3.1-Flag网站,在坐标系的国旗标签。pcDNA3.1-Flag是pcDNA3.1(−)向量编码标记抗原决定基位于下游的T7启动子和立即EcoRI站点紧随其后。质粒pcDNA3.1-Flag-TRF2^ΔB是由其pCMV1等价物的转移TRF2盒对向量pcDNA3.1(−)(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。pCMV1-Flag-TRF2^ΔB是反过来由转移到pCMV1 SacII / BamHI片段的质粒pTetFLAGhTRF2吗^{45 - 501}(礼物Titia德兰格,洛克菲勒大学,纽约)(17]。

2.4。蛋白表达

Flag-Stn1和(³⁵S] -Flag-TRF2^ΔB蛋白质是由在体外转录/翻译在兔网织红细胞溶解产物。在最后一卷50μL一微克pcDNA3.1-Flag-Stn1转录/翻译使用TnT快速耦合系统,根据制造商的说明(Promega,麦迪逊,WI)。一个water-programmed溶解产物(模拟)作为并行产生负控制。翻译后,整除的两种反应进行了分析使用Stn1 / OBFC1抗体和免疫印迹anti-Flag M2抗体。单一种类的45 kDa检测的两种抗体Stn1-programmed溶解产物而不是模拟溶解产物(参见图S1在网上补充材料doi: 10.4061 / 2011/720798)。(³⁵S]标记Flag-TRF2^ΔB蛋白质产生同样除了无标号蛋氨酸是替换为2μL L - (³⁵S]蛋氨酸(1000 Ci /更易,10μCi /μL)。

2.5。准备的珠子涂上Anti-Flag M2抗体

由混合200平方米antibody-coated珠子μL m - 450磁珠涂上一只羊anti-mouse IgG抗体(Dynal生物科技有限公司,成功湖,纽约)15μ克anti-Flag抗体(M2鼠标单克隆,Stratagene,拉霍亚,CA)在5毫升的PBS包含每个NP-40和BSA的0.1%。在4°C一夜之间旋转后,M2-coated珠子在PBS洗3次含有0.1% NP-40和BSA,珠被停职并存储在200年之后μL相同的缓冲区。在使用之前,珠子洗3次,冰冷的缓冲区包含0.1% BSA 1 x绑定。控制珠涂以正常小鼠免疫球蛋白(猫。# sc - 2025, Santa Cruz)准备后,相同的协议。

2.6。SELEX

一个包含一个随机寡核苷酸的核心35核苷酸在PCR启动序列是:5′-GCGTCGACAAGCTTTCTAGA (N)₃₅GAATTCGGATCCCTCGAGCG-3′。在第一轮的选择,5μ克这个随机益生元(215 pmoles, 130万亿个分子)与12.5孵化μL(兔网织红细胞溶解产物(编程与水或Flag-Stn1)和5μ克用变性大肠杆菌基因组DNA在50μL反应包含1 x绑定缓冲MgCl(4%的甘油,1毫米₂氯化钠,德勤1毫米,50毫米,10毫米Tris-HCl pH值7.5)。30分钟后在室温下,10μL M2-coated珠子被添加和样本的旋转在室温1小时。磁珠与冰冷的洗3次1 x绑定包含0.1% BSA的缓冲区,选中的寡核苷酸被筛选了10分钟后在室温下存在过多的3 xflag肽(34μ米1 x绑定缓冲)。接下来,筛选了DNA被PCR reamplified使用铂Taq DNA聚合酶和引物5′-GCGTCGACAAGCTTTCTAGA-3′(向前)和5′-CGCTCGAGGGATCCGAATTC-3′(反向)。整除了10、15、20、25 PCR循环是解决3%的琼脂糖凝胶。最最佳放大整除(没有涂片,没有supershift,指数范围内)被选中,降低,凝胶纯化使用GENECLEAN III工具包(MP生物制剂,梭伦,哦)。接下来,gel-purified产品受到不对称PCR再生第二轮SELEX所需ssDNA分子。16个周期的不对称PCR进行使用铂Taq DNA聚合酶和底漆,后PCR产品提取苯酚:氯仿(1:1),氯仿,然后乙醇沉淀。ssDNA颗粒溶解在水中,准备下一轮SELEX使用。另一轮SELEX都是相同的,除了随机益生元是取代之前选择和reamplified ssDNA。

第六回合后选择,对称放大PCR产品凝胶纯化,然后准备TA-cloning成向量pCR2.1-Topo(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。化学改变了全球大肠杆菌细胞被传播到盘子含卡那霉素(25μg / mL)。总共有50白色菌落挑选和送去测序。得到了30多个序列的两个SELEX程序(模拟与Flag-Stn1)执行。

2.7。放射性标记的DNA探针

在20μL MgCl正向反应缓冲区(10毫米₂、德勤5毫米和70毫米Tris-HCl, pH值7.6),30 pmoles标记的寡核苷酸探针15分钟与75年在37°CμCi的γ- - - - - - (³²P] atp (4500 Ci / mmole)和10个单位的T4多核苷酸激酶(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。接下来,探测器被解决在8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶纯化。最后,筛选了探针在脱盐G50纺列(通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西)。

2.8。电泳迁移率改变分析(EMSA)

在25μL 1 x绑定的缓冲区,反应包含1μ80000 g表示抗体和cpm的指定³²P]标记的寡核苷酸。反应在室温下孵化了30分钟,然后被加载到本地4%聚丙烯酰胺凝胶含有此种缓冲(Tris-borate 45毫米,2毫米EDTA, pH值8.3)。凝胶在4°C运行1小时在180伏特。凝胶被转移到DE81阴离子交换层析纸(绘画纸国际,梅德斯通,英国),干,暴露于PhosphorImager屏幕(分子动力学,桑尼维尔CA)。在竞争实验,表明竞争对手增加了5分钟前添加(³²P]标记ABA调查。使用的竞争对手包括3 xflag肽浓度增加(2、5、10、20、50、100、200、或500海里)或过度的ABA或CTR益生元(500海里)。

2.9。绑定等温线ABA的调查

实验研究与³²P]标记ABA如上所述,除了M2抗体以越来越集中添加(0,100,200,350,500,750,1000,2000,和4000 ng)。暴露后的凝胶PhosphorImager屏幕,免费的数量(³²[P] aba和数量³²P] aba绑定到M2抗体被体积量化集成使用ImageQuant程序(分子动力学,桑尼维尔CA)。的数量(³²P]阿坝,表示为总数的一小部分,是策划的函数M2抗体的总量。由此产生的曲线拟合非线性回归到“一个站点”饱和度绑定曲线()。配件,使用SigmaPlot执行11.0版本,允许明显的离解常数的计算()。

2.10。释放的捕获³²P] aba 3 xflag肽的低聚糖

(³²P]标记ABA益生元第一次被固定到M2-coated珠子。简单地说,150年μL M2-coated珠子被添加到375μL 1 x绑定缓冲区包含600000 cpm (³²P] aba益生元。捕获的低聚糖被允许继续一个小时在室温下,这珠子后与500年洗3次μL冰冷的1 x绑定缓冲(包含0.1% BSA)。450年被resuspended放射性珠子μL相同的缓冲区。评估的能力3 xflag肽洗提捕获的低聚糖,越来越3 xflag肽的浓度(0、2、5、10、20、50、100、200、500、1000、2000和5000海里)被添加到30μL的珠子带(³²P] aba益生元。20分钟后在室温下,珠被推倒了,大量的放射性剩下的珠子和上层清液被闪烁数,表示为总额的一小部分。

2.11。抑制的捕获³⁵S]标记Flag-TRF2^ΔB

这些实验之前,珠被封锁在4°C 30分钟5%牛奶1 x绑定缓冲,以减少非特异性结合。在1 x绑定缓冲区,M2-coated珠子刚孵化的竞争对手(30表示μ每个3 M xflag 3 xaba 3 xctr)或没有竞争对手(无Comp)。10分钟后在室温下,2 - 10μL (³⁵S]标记FLAG-TRF2^ΔB是补充道。1小时后在室温下旋转,每个反应是与500年洗3次μL冰冷的1 x绑定缓冲(包含0.1% BSA),之后的数量³⁵S] -Flag-TRF2^ΔB捕获的是量化的。在一个实验中,量化了sds - page电泳捕获和接触PhosphorImager屏幕。在第二个实验中做一式三份,(³⁵S] -Flag-TRF2^ΔB俘虏被闪烁计数量化。在两个实验中,珠子涂层与正常小鼠免疫球蛋白的负控制包括捕获(免疫球蛋白)。

2.12。释放Precaptured [³⁵S]标记Flag-TRF2^ΔB

(³⁵S]标记Flag-TRF2^ΔB蛋白质首先固定到M2-coated珠子。简单地说,80年μL M2-coated珠子被添加到800μ包含32 L 1 x绑定缓冲μL (³⁵S] -Flag-TRF2^ΔB。捕获的蛋白质被允许继续一个小时在室温下,这珠子后与500年洗3次μL冰冷的1 x绑定缓冲(包含0.1% BSA)。80年被resuspended放射性珠子μL相同的缓冲区。评估的能力3 xaba益生元洗提捕获蛋白,5毫升的这些珠子和45μL 1 x绑定包含表示竞争对手(30的缓冲区μ每个3 M xflag、3 xaba或3 xctr)或没有竞争对手(无Comp)。20分钟后在室温下,珠被推倒的,浮在表面的放射性是量化通过sds - page电泳和接触PhosphorImager屏幕。在一个实验做一式三份,(³⁵S] -Flag-TRF2^ΔB也是量化发布闪烁计数。在两个实验中,珠子煮释放所有的捕获³⁵S]标记的蛋白质包括积极控制洗脱(总)。

3所示。结果

3.1。SELEX由于Anti-Flag M2抗体

SELEX被用来描述人类的dna结合蛋白特异性Flag-tagged Stn1蛋白(18,19),在这种情况下产生的在体外翻译在兔网织红细胞无细胞系统。的在体外翻译Flag-Stn1混合池的随机ssDNA分子然后anti-Flag M2抗体用于免疫沉淀反应Flag-Stn1 / DNA复合物的高亲和性的目标选择。经过连续6轮的选择,所选ssDNA分子克隆和测序。分析相关没有随机池G-rich序列显示略有偏差,但没有证据表明任何复发的主题(20.]。相比之下,Flag-Stn1选定的寡核苷酸的分析揭示了双方的共识主题由两个不同的元素:CCTTA和TGTCTWCC (W = a / T;图1(一))。这些元素是由2 - 3差守恒的序列的碱基。然而,同样的主题由两部分构成的共识也是SELEX时产生了相同的抗体但使用mock-programmed网织红细胞溶解产物作为控制来源的蛋白质(图1 (b))。基于这些结果,我们得出的结论是,双方的共识已经选定,不是Flag-Stn1蛋白质,而是由M2抗体本身或蛋白质的溶解产物抗体交叉反应。

3.2。M2抗体结合共识ssDNA图案

测试的可能性之间的直接交互双方的共识和M2抗体,EMSA。一系列的平等的长度(³²P]标记ssDNA探测器包含或缺乏共识的每个元素(图2(一个))。探针AB、BA和ABA CCTTA和TGTCTWCC图案,而探针2 xb和4 xa由一个或多个副本的其他元素。不相关的CTR探针作为消极的控制。图2 (b)表明M2抗体可以形成一个稳定的复杂与ABA探针和(在较小程度上,AB探针。没有其他的探测与M2抗体。也值得注意,英航调查缺乏CCTTA元素和AA调查缺乏TGTCTWCC元素与抗体,从而表明这两个元素是必不可少的绑定。图2 (b)还表明,在7个不同的抗体,M2抗体只与探针ABA交流。这些结果表明,探测器ABA结合非常有选择地M2抗体,从而表明这些交互是涉及抗体的可变区、轻链的一部分,是否重链,或两者兼而有之。

测量探头ABA的M2抗体的亲和力,明显的离解常数()的复杂的决心。绑定生成等温线EMSA使用固定数量的(³²P] aba孵化与M2抗体浓度增加(图2 (c))。策划的ABA绑定的函数的总浓度抗体生成的具有约束力的等温线。拟合的等温线曲线”一个网站“饱和绑定允许的计算。在这种情况下,明显决心有价值吗纳米(图2 (d))。价值相当明显其他之前报道的DNA适体/抗体复合物[21]。这个结果表明,M2与高亲和力抗体结合其偏爱的DNA配体,阿坝调查。

3.3。国旗肽与ABA的约束力低聚糖M2抗体

M2抗体结合标志肽(DYKDDDDK)和ABA探测器,我们试图确定是否两个配体可以相互竞争。在第一系列的实验,我们问一个超过3 xflag肽(MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK)可能会阻止的绑定³²P]标记ABA M2抗体。EMSA如图3(一个),越来越集中的3 xflag肽与M2抗体孵化之前添加的³²P] aba。在50 nM和更高的浓度,3 xflag肽可以完全阻止ABA M2抗体的绑定。类似的抑制是包含过多的无标号ABA后低聚糖,但不是加法后CTR益生元。这些结果表明,3 xflag肽与探针ABA M2抗体的绑定。

在第二个系列的实验中,我们问一个超过3 xflag肽可以洗提(³²P] aba益生元已经绑定到M2抗体。为此,(³²P] aba首次捕捉到磁珠涂以M2抗体,之后越来越集中的3 xflag肽是补充道。在图3 (b)、ABA绑定到珠子的数量和释放量的珠子是策划的函数3 xflag肽的浓度。数据表明ABA益生元非常有效地增加发布的3 xflag肽。低聚糖的一小部分,代表36%,无法取代,但其他部分几乎完全公布的2000海里3 xflag肽。拟合数据的“一个站点”竞争曲线允许集成电路的计算₅₀。同意的值,集成电路₅₀确定是96海里(95%置信区间:72 - 127海里)。这些结果表明,3 xflag肽可以洗提ABA益生元当绑定到M2抗体。

3.4。3 xaba益生元块Flag-Tagged协会与M2抗体蛋白

如果ABA低聚糖和标志肽争夺绑定到M2抗体,那么过多的ABA益生元有可能允许洗脱Flag-tagged M2-coated珠蛋白,蛋白纯化常用程序。应对这种可能性,我们首先确定是否过度的ABA益生元可以阻止绑定[S³⁵]标记Flag-TRF2^ΔBM2-coated珠子。在这些实验中,M2-coated珠子刚孵化的竞争对手(30μ米3 xflag肽3 xaba或3 xctr寡核苷酸)或没有竞争对手(没有Comp)。然后,[S³⁵]标记Flag-TRF2^ΔB添加和[S³⁵被珠子是用sds - page电泳(图4(一))或闪烁计数(图4 (b))。作为数据4(一)- - - - - -4 (b)显示,3 xflag肽废除了捕获的年代³⁵]标记蛋白质而3 xctr益生元没有效果。虽然不如3 xflag活性肽,3 xaba低聚糖抑制Flag-TRF2的捕捉^ΔB了62%。较短的ABA适配子也测试,但发现不活跃(图S2),与ABA阻止捕获仅45%。

接下来,我们问一个超过3 xaba益生元可以洗提一个[S³⁵]标记Flag-TRF2^ΔB蛋白质已经绑定到M2-coated珠子。在这些实验中,[S³⁵]标记的蛋白质首先被M2-coated珠子。接下来,放射性珠子暴露在竞争对手(30μ米3 xflag肽3 xaba或3 xctr寡核苷酸)或没有竞争对手(没有排版),和(S³⁵发布是量化通过sds - page电泳(图4 (c))或闪烁计数(图4 (d))。作为4 (c) 4 (d)的数据显示,3 xflag肽的释放引起54%的捕获蛋白质而3 xctr益生元没有活动。3 xaba益生元是一样有效的3 xflag肽,导致释放36%的蛋白质。

4所示。讨论

本研究的最初目的是使用SELEX描述ssDNA-binding特异性Flag-tagged Stn1, CST复杂的亚基(18,19]。相反,SELEX过程浓缩ssDNA分子高亲和力结合的anti-Flag M2抗体。这个选择的抗体可能怎么样?首先,它可能是在体外翻译Flag-Stn1蛋白质并不具备所需的最低dna结合活性。折叠不当可能会导致缺乏活动。或者,这可能是因为OB-fold域(寡核苷酸/低聚糖绑定)Stn1参与调停蛋白质-蛋白质之间的关系而不是dna结合蛋白(18,19]。第二,标记抗原决定基(DYKDDDDYK)是高度带负电荷,使一个优化DNA分子模拟肽的静电签名。第三,ssDNA比dsDNA灵活得多,在这方面,可以更容易适应的带正电的表面antigen-binding口袋的M2抗体(22]。换句话说,我们建议选择抗体介导的不可能如果国旗抗原决定基中性或带正电,如果SELEX使用dsDNA执行,或者如果Flag-tagged Stn1 ssDNA蛋白质表现出了更高的亲和力。事实上,我们已经成功地使用SELEX在类似条件下定义ssDNA绑定特异性POT1,承认端粒DNA的蛋白质。SELEX,使用M2抗体也表现,几乎只选择端粒序列由两部分构成的图案发现没有证据(崔k h . Ouellette), M . M。在准备,手稿)。选择的SELEX脱靶寡核苷酸适配子并不少见,尤其是在选择单链核酸(23]。不相干的寡核苷酸适配子绑定到选择矩阵(如抗生物素蛋白,M2抗体),正如我们所观察到的,他人也被报道(23]。因此,谨慎和实验控制是必要的,尤其是当选择ssDNA分子绑定到一个未知功能的蛋白质。在这种情况下,一个重要的控制来执行,因为我们已经在那里了,是一个模拟选择确认选择的分子确实感兴趣的蛋白质。

我们的研究结果表明,确定双方的共识与高亲和力结合选择性和M2抗体。一个重要的发现是特异性的相互作用。例如,共识没有绑定到任何其他的抗体测试,其中很多属于相同的同形像M2抗体(鼠标免疫球蛋白₁)。这个专一性暗示的交互涉及到变量区域的抗体,这些传感器组合在一起形成antigen-binding口袋里。证实了这个假设竞争实验的结果。如图4所示,ssDNA共识可以非常有效地取代国旗肽antigen-binding口袋的M2抗体。相反,国旗肽可以同样取代DNA适体的抗体(见图3)。这国旗肽和DNA适体之间的竞争意味着两人被重叠的表面的抗体约束力的决定因素。国旗肽和ABA适体的共同特点是他们的负静电电荷。表面的抗体,这些负电荷的两个配体可能与一些同样的约束力的决定因素。绑定的M2抗体似乎具体只有前4信号肽的氨基酸,即DYKD [22]。带正电的残留的两个集群(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)出现在绑定的口袋里,每一个能够协调DYKD图案中的天冬氨酸。相同的两个集群可能与磷酸基在ABA益生元的支柱。绑定两个酪氨酸残基也很重要,每一个能够形成叠加DYKD的酪氨酸的交互。当绑定到阿坝益生元,酪氨酸可以提供一些核苷酸碱基堆积相互作用。然而,这些有限的交互并不足以解释观察到的序列特异性。选中的共识是由两个单独的图案(CCTTA和TGTCTWCC)和变异的一种或另一种足以取消绑定。允许识别这个大双方的共识,其他残留物必须涉及接触几个核苷酸的基地。因此,它必须标记肽与只有一个子集的残留与ABA的绑定。如果是这样,那么标记肽怎么可能那么有效地取代了ABA的M2抗体呢? It is possible that the binding determinants that the two ligands share are especially critical for the binding of ABA. A second possibility would be that the binding of the Flag peptide causes changes in the conformation of the antibody, and that these allosteric alterations are incompatible with the binding of ABA. How the ABA aptamer is able to mimic the structure of the Flag peptide remains to be determined, but this form of mimicry between peptide and DNA has previously been reported to play an important role in autoimmune diseases and may also have important applications in drug design [5- - - - - -9]。阿坝益生元标记肽提供了一个理想的系统来研究分子的模仿这种形式的结构基础。

人们普遍使用过程的蛋白质纯化的捕获Flag-tagged M2蛋白的抗体及其后续版本通过孵化一个超过3 xflag肽(24]。这个程序允许nondenaturing条件下纯化蛋白的洗脱。然而,过程让过量的蛋白质在溶液中筛选了3 xflag肽,可以构成一个问题如果国旗标签需要保持功能。DNA适体能够洗脱Flag-tagged蛋白质,如3 xaba,可以缓解这些潜在的缺点。一旦蛋白质筛选了,反义DNA适体方便可以灭活的益生元使用微量的DNAse或取消。另外,如果适体生物素化的,其去除使用streptavidin-coated珠子可以完成。最后,DNA适体也会提供利用寡核苷酸突变的可能性负微分洗脱的控制或捕获蛋白质。

这里描述这些结果也可能影响治疗自身免疫性疾病的抗核抗体。以前曾试图阻止这些自身抗体的功能已经由肽模拟,从噬菌体展示库分离或来源于自体抗原肽与这些抗核抗体(交叉反应10,11]。这些结果描述其中表明SELEX可以用来识别DNA寡核苷酸适配子块特定抗体的功能。这种方法可以用于开发寡核苷酸适配子块抗核抗体的功能吗?在某些自身免疫性疾病,阻止抗核抗体的功能已被证明限制组织损伤(10,11]。反核的序列特异性自身抗体尚未系统研究[3,4]。SELEX将是一个理想的方法描述反核的序列特异性自身抗体。SELEX数据可以作为设计的出发点可能是有用的第二代寡核苷酸适配子阻止这些自身抗体的功能。的发展这些DNA寡核苷酸适配子可以代表另一种方法治疗的病人患有系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、和其他自身免疫性疾病。

5。结论

总之,SELEX发现DNA适体结合直接antigen-binding anti-Flag M2抗体的口袋里。DNA适体和标志肽争夺绑定M2抗体和适配子筛选了Flag-tagged蛋白质固定化M2抗体。这个新试剂因此提供了一种替代方法的洗脱Flag-tagged蛋白质绑定到M2抗体,普遍采用在蛋白质纯化过程。除了这个直接应用在蛋白质纯化,鉴定这双方的共识演示了使用SELEX开发的可行性DNA寡核苷酸适配子块特定抗体。将这种方法应用于自身抗体,尤其是抗核抗体,可能导致小说发展的系统性红斑狼疮患者的治疗策略,风湿性关节炎,和其他自身免疫性疾病。

确认

作者要感谢Titia德兰格(洛克菲勒大学,纽约,纽约)pTetFLAGhTRF2^{45 - 501}质粒。欣赏是扩展到Asserewou欧诺瑞Etekpo质量的技术援助。他们也希望承认UNMC埃普利癌症中心分子生物学核心和UNMC DNA测序核心设施。本文支持由国家卫生研究所(P50CA127297 P30CA036727)和GAANN奖学金从美国教育部(P200A090064) a . s . Lakamp。

补充材料

引用

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