利用设计的肽库筛选特定DNA g -四重序列的结合物

摘要

我们展示了一种筛选特定g -四重蛋白序列结合物的方法，该方法使用易于设计的天然氨基酸组成的短肽，并使用统计方法如层次聚类分析(HCA)挖掘结合数据。尽管在本研究中使用的文库规模较小，但我们确定了特定粘合剂的候选材料。此外，选定的肽段稳定了原癌基因c-启动子区衍生的DNA寡核苷酸的g -四链结构MYC．本研究阐明了肽库的设计方法，并提出了构建g -四重结合物的筛选指南。这种g -四重肽结合物可以通过功能修饰来实现细胞和组织工程的转换、细胞渗透和细胞器靶向。

1.介绍

过去几十年的研究揭示了一些DNA和RNA二级结构调节各种细胞活动。特别是一种二级结构，g -四重体[1]调控细胞事件，如转录、翻译、rna前剪接和端粒酶伸长，所有这些都在各种严重疾病和细胞衰老中发挥作用[2- - - - - -6］．因此，能够控制DNA和RNA g -四重结构的系统将有助于调节各种细胞事件，以产生生物学效应。由于它们的生物学重要性，许多g -四联体靶向配体[7，8]，包括酞菁衍生物[9，卟啉衍生物[10]， 和别的 [11- - - - - -14］．然而，下一代粘合剂应该具有更多的G-Quadreplex序列特异性，结构更高的诱导或折叠能力，以及更大程度的函数，包括结合开关切换，蜂窝穿透和靶向细胞器的能力。

新设计的多肽(非来自结合蛋白结构域的多肽)是下一代g -四重蛋白结合候选蛋白，因为它们提供了以下优点:(i)多肽比抗体或重组蛋白更容易设计和合成;(ii)它们可以模拟蛋白质- g -四重体相互作用;(iii)基于肽库的分析可用于阐明dna的结合特性;(iv)除了天然氨基酸外，各种功能部件(如人工氨基酸)可被用作设计肽的构建块;(v)由于某些肽序列可能表现出跨膜或激素特性，将肽与这些功能序列结合g -四复合体结合肽可以产生在细胞和组织工程中有用的多功能分子系统。

为了增加肽库技术的效用，我们设计了由各种二级结构组成的肽微阵列。设计设计的肽阵列最初施用于蛋白质分析[15- - - - - -21］．在向这些肽阵列中加入各种蛋白质后，含有荧光探针的文库肽根据肽序列显示不同的结合响应。这些响应模式用作“蛋白质指纹”（PFP），可用于建立靶蛋白的身份并将靶蛋白的识别性质与特定肽相关[15，16，21］．此外，通过将分层聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)等统计分析应用到PFPs中，主要基于肽电荷和疏水性数据，研究人员可以得出目标蛋白与生物学功能之间的高置信相关性[19，21］．我们成功地将我们的系统应用于筛选与目标蛋白紧密结合并同时控制与目标蛋白相关的功能的肽配体[20.］．这种方法有几个优点，如易于肽库设计和具有新颖结构的配体选择，以控制信号通路和/或级联。

在这里，我们展示了一个模型筛选的结合物到一个特定的g -四链序列使用容易设计的短肽组成的天然氨基酸。我们还检测了添加g -四重蛋白结合肽段后DNA g -四重蛋白结构的稳定性，并检查了该肽段是否能诱导或破坏g -四重蛋白结构。这项研究说明了肽库是如何设计的，并提出了构建下一代配体的筛选指南，这些配体对特定的g -四配体具有更高的特异性和更高的功能，包括开关和穿透细胞和目标细胞器的能力。

2.实验方法

2.1。一般性言论

所有化学品和溶剂都是试剂或HPLC等级，使用而无需进一步纯化。通过HPLC纯化的寡脱氧核苷酸样品购自北海道系统科学（日本札幌）。使用inertsil ODS-3（10×250mm; GL科学）柱对GL-7400 HPLC系统（GL-7400 HPLC系统（GL-7400 HPLC系统（GL科学，东京，日本）进行，用于用直线乙腈/ 0.1％三氟乙酸（TFA）梯度制备纯化流速为3.0毫升/分钟。使用3,5-二甲氧基-4-羟基氨基酸作为基质，在AutoFlex III（Bruker Daltonics，Billerica，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，Ma，MA，USA）质谱仪上进行分析肽。

2．2.设计的肽迷你库的合成

设计的肽库在Fmoc- nh - sal - peg树脂(Watanabe Chemical Industries, Hiroshima, Japan)上合成，使用Fmoc化学自动合成器(Advanced ChemTech Model 357 FBS) [22]根据据O-(7-氮杂苯三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸盐(HATU, Watanabe Chemical)方法。侧链保护如下:t-丁基(tBu)表示谷氨酸和Tyr，三丁基(Trt)表示Hist- 对丁氧基羰基（BOC）的Lys。通过在TFA（Watanabe Chemical Industries）/ H中孵育2小时，从树脂（Watanabe Chemical Industries）/ H中孵育2小时，从树脂中切割肽和侧链保护。₂O/三异丙基硅烷(Wako Pure Chemical Industries, Tokyo, Japan) (20:1:1, v/v)。加入冷二乙醚沉淀多肽，离心收集。回收的多肽溶解在水中约1mm，并在4°C保存。为了确定库肽库溶液的浓度，在280 nm处的吸光度(色氨酸(ε= 5500)和Tyr (ε= 1490）[23)，用U-1900紫外光谱仪(日立高科技，东京，日本)测定了每种肽的稀释溶液。经3.2筛选，筛选的多肽经反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，MALDI-TOF MS对多肽进行表征，在3.3-3.5中进行进一步实验。将纯化后的多肽溶于水至1 mM左右，在280 nm处测定其浓度，然后在4℃下保存。

2.3。使用凝胶电泳筛选文库肽

在分析之前，将含有0.1mM EDTA的10mM Tris-HCl（pH7.0）缓冲液中的每个样品加热至85℃，然后以1.0℃的速率轻轻冷却至室温⁻¹．使用含有13%聚丙烯酰胺的非变性凝胶进行天然凝胶电泳。加载缓冲区(2μl）与2混合 μl为5 μM DNA样本，含/不含50μM库肽在10 mM Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液包含0.1 mM EDTA。一个4μ将每种样品的等分试样加载到凝胶上并在10.0V cm处电泳⁻¹室温下2小时。用Sybr金核酸凝胶染色（Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA）染色凝胶，并使用FLA-7000成像仪（富士薄膜，日本）成像。使用Malti Gauge软件（V.3.2）为Windows量化带强度。根据以下等式计算结合的DNA百分比：{（无肽的DNA带强度） - （用肽的DNA带强度）} /（无肽的DNA带的强度）×100（％）。

2．4．颜色比例尺的准备

根据先前报告的标准程序进行操纵数据以准备黑色红黄色尺度条[16］．使用了便携式像素地图(.ppm)文件格式。首先根据其RGB颜色编码响应(0,0,0 =全黑，最低结合DNA百分比;255, 0,0 =红色，中等百分比;255, 255, 0 =黄色，百分比最高)，对应511个水平的所有结合DNA百分比。网格的数字被保存为一个逗号分隔的值(.csv)文件，包括三(或四)行。PPM设置在文件的顶部。然后，文件被保存为便携式像素地图格式，只需添加一个“。Ppm”扩展名的文件名。这个文件可以使用图形查看软件打开，调整大小，然后保存为另一种文件格式，如位图(.bmp)。

2.5。分层聚类分析（HCA）

欧氏距离[24，25]是两个向量之间距离的常用度量，用于确定从不同目标dna获得的两张结合彩色图像之间的相似性。确定了结合彩色图像之间的相似性后，进行HCA。采用Ward的聚类算法，利用Excel Macro程序从欧氏距离得到树状图[26］．横轴表示向量之间的距离(左为高相似性，右为低相似性)。

2.6。圆形二色性（CD）光谱

用DNA (1μM)和肽号。010(0或100μM)在20 mM Tris-HCl (pH 7.0)包含0.1 mM KCl和0.1 mM EDTA。使用J-820偏振分光计(JASCO, Hachioji，日本)，带有温度调节器，在25°C下使用路径长度为1厘米的石英电池进行CD测量。在分析之前，每个样品被加热到85°C 5分钟，然后以1.0°C min的速度缓慢冷却到室温⁻¹．

2.7。紫外线熔化G-quadruplex结构

使用配备有温度控制器（Shimadzu，Kyoto，Japan）的Shimadzu 1800分光光度计测量UV吸光度。通过在含有0.1mM KCl（pH7.0）的10mM Tris-HCl（pH7.0）中以0.1mM KCl（pH7.0）以1.0℃min的加热速率测量含有0.1mM KCl（pH7.0）的295nm的UV吸光度来获得熔融曲线⁻¹．熔化温度()值为5μ含/不含肽的M dna。010 (100μM)，如前所述，由UV熔化曲线得到[27，28］．

3。结果与讨论

3．1.肽迷你库的设计与合成

我们使用如图所示的策略构建了一个由32个不同电荷和/或疏水性的多肽组成的微型库1(一)．KWK基序以其与DNA结合的能力而闻名[29］．我们设计了将四个残基添加到Kwk基序的N-末端的肽。在第4个残余物中加入G或P允许改变肽主链的柔韧性。在残留物x中添加H，W，F或Y.₁允许改变肽的芳族特征，同时在残留物z中加入k或e₁和Z.₂允许改变肽电荷。数据1 (b)和1 (c)显示所有图书馆的肽种类。图中的列和行标题1 (c)表示芳族残基（H，W，F或Y在x上₁)和胺的数目(E，或K在Z₁和Z.₂；胺的数目分别为3,4或5)，每个细胞显示合成的肽的数目。因此，该文库由两个设计肽系列(G系列和P系列)组成，每个系列包含16个系统设计的肽。

3.2。筛选设计的肽迷你纤维化和数据挖掘

文库多肽的结合能力从启动子区域或5 '非翻译区域的四个不同的平行g -四重链人类protooncogenes（来自c-的mycMYC,国家管制当局方面国家管制当局方面, WNTwnt 3.， FGF来自FGF 3.［30.- - - - - -32] （桌子1使用电泳))。结合的DNA百分比根据肽序列的不同而不同(图)2)，而绑定百分比从高到低不等。为了更清楚地显示绑定属性，这些结果被转换成如图所示的黑-红-黄图像2 (b)．彩色图像对应于两个肽序列(图1 (c))，每个细胞的颜色表明每个肽对每个DNA的结合反应。RGB色码代表装订程度:黑色(最低百分比)、红色(中等百分比)、黄色(最高百分比)，共分为511个等级。一些肽，如nos. 008和032，与所有被检测的dna结合，而肽no. 008和032与所有被检测的dna结合。例如，011，与测试的dna结合很少。在每个系列的底部部分的细胞被涂成黄色或红色，表明dna优先结合阳离子多肽。此外，MYC的g -四重蛋白倾向于与g -系列肽结合，NRAS的g -四重蛋白倾向于与p -系列肽结合，而FGF和WNT的g -四重蛋白倾向于与两个肽系列结合。这一结果表明，通过在序列中间添加G和P赋予多肽灵活性的变化提供了DNA选择性。

用具有欧氏距离的HCA定量分析了多肽结合dna能力的相似性。如图所示3(一个)，可以将库肽分为五组（组A-E）。组肽对于FGF和Wnt G-四链体表现出相对高的结合百分比，但具有较少的MyC和NRAS G-四边形的结合百分比。分类为B组的肽显示除WNT G-QuadRuplex之外的所有DNA的相对低的结合百分比，它们紧紧地绑定。分类为C组的肽对MyC G-Quadreplex的高结合百分比，但NRAS，FGF和WNT G-四边形的结合百分比较低。D组中的肽显示除Myc之外的所有四翻石中的中间结合百分比，它们没有结合。最后，分类为e的肽，其特征在于5胺，与高结合百分比测试的所有DNA结合。因为具有3或4个胺的肽证明了不同的结合百分比，所以我们得出结论，通过设计和合成具有3或4胺的更宽的肽阵列，可以获得更多的特异性粘合剂。尽管本研究中使用的图书馆尺寸小，但我们能够获得肽特异性结合的肽。例如，我们的结果表明，肽009和010是Myc特异性粘合剂，肽003,007和015是WNT特异性粘合剂。

使用HCA方法定量地分析G-Quadflex结合性质之间的相似性。聚类树形图（图3 (b)）通过欧几里德距离分析产生。水平轴表示库肽的G-QuadrepleS的结合百分比与左侧的距离（左表示高相似性和右表示低相似性）。群集树木图从其他G-Quadrupledes中区分Myc，趋向于群集。我们怀疑一些库肽在除Myc除外的所有G-Quadruplees中存在特定的序列（GGGCGGG）。虽然需要关于文库肽的结合到各种DNA类型的许多数据，但这些结果意味着该研究中使用的统计方法可用于表征各种其他G-四翻来的结合性质。

3.3。确认DNA结合

我们选择了肽no。010作为myc特异性结合剂。(虽然我们也选择和纯化了肽no. 010。009，纯化编号。009肽没有强结合到MYC(数据未显示))。数字4显示了纯化肽no。010与不同的dna结合。肽。010与MYC强结合，而与NRAS和WNT弱结合或与csMYC (MYC的互补序列，5 ' -TCCCCACCCTCCCCACCCT-3 ')和TELO(人类端粒DNA的代表性反平行g -四重链序列，5 ' -AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3 ')结合较少[33])。虽然g -四链FGF和MYC都与多肽高度结合。010，数据清楚地表明肽no。010只与平行的g -四重体序列结合，而不与反平行的g -四重体序列或其他序列结合，包括MYC互补序列。虽然还需要更多的分析和/或详细的确认实验，但这些结果表明，3.2中的电泳是利用肽库筛选dna结合肽的有前途的工具之一。

3．4．含/不含肽的g -四链dna的圆二色谱分析。010

我们进行了CD实验，以研究MYC g -四重体与肽no相互作用后的结构和构象变化。010.MYC g -四倍体产生了具有平行四倍体特征的光谱，最大波长为260 nm，最小波长为240 nm(图)5（a）)，该结果与先前的研究一致[10］．有趣的是，肽的添加。010导致了平行g -四重信号的增加。此外，我们对添加肽no后的其他g -四链dna进行了CD实验。010.FGF g -四重体显示出与MYC相似的结果(图5（b）)，而NRAS和WNT在添加肽no后无明显变化。010(数据5（c）和5（d）．这些结果与3.3中的dna结合结果相关。

3．5.与肽结合的DNA g -四链的热力学稳定性。010

我们研究了肽结合对DNA g -四链的热力学稳定性的影响。表格2显示在MYC和FGF g -四丛存在和不存在100μM肽。010.(有/没有MYC和FGF的熔化曲线。010如图所示6。）令人惊讶的是，Myc g-quadruplex在肽存在的情况下，变化明显，FGF g -四重体升高约8°C在肽存在下改变，仅增加约4℃。

这些结果表明，多肽不能。010以一种特定的结合方式与MYC的g -四重体结合。虽然我们无法筛选出具有高结合选择性的多肽，尽管我们的文库大小有限，但我们发现肽no。010作为一种有前途的g -四重结构的稳定剂和MYC的粘结剂。

4.结论

在本研究中，我们展示了一种设计新颖的肽库方法来筛选特定g -四重体的结合物，并展示了使用统计方法(如HCA)从结合结果中生成的数据挖掘。我们的结果表明，使用设计的肽库可以识别g -四重蛋白序列，因此可以为针对特定g -四重蛋白的肽设计提供有用的信息。尽管在本研究中使用的文库规模较小，但一些特定粘合剂的候选者被确定。通过改进文库多肽的设计和筛选方法，我们的系统可以用于筛选与特定g -四重体结合并改变其热力学性质的多肽。这样就有可能找到具有强特异性的结合物，并添加特定的功能属性，例如为了细胞和组织工程的目的，能够穿透细胞以控制DNA和/或RNA事件。

致谢

这项研究得到了教育、文化、体育、科学技术部(MEXT)的部分资助。臼井康之感谢MEXT的“核心研究”项目(2009-2014年)的科学研究资助。

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