三重态分析识别功能性RNA的未配对区域

摘要

我们开发了一种用于分析RNA序列，视为三重态分析的新方法，并应用了该方法在体外RNA选择实验，其中HIV-1 TAT是靶标。适体是结合所需靶（诱饵）的核酸，迄今为止，已识别出许多适体在体外从足够的浓缩文库中选择许多RNA在选择足够循环后具有明显的共识初级序列。因此，必须通过额外的适体研究来确定是与诱饵相互作用不可或缺的适体的高阶结构特征。相比之下，我们的三联分析使我们能够从最小浓缩的RNA文库中提取有关功能初级和二次结构的重要信息。结果，通过使用我们的方法，容易从部分浓缩的文库中易于预先预测与焦油膨胀的重要的未配对区域，其中常规序列分析没有共有序列。此外，我们的分析方法可用于评估具有所需功能的各种结构基序。

1.介绍

在体外核酸的选择是用于分离新功能分子的强大方法[1-6.］．一般来说,在体外选择涉及许多回收的选择，然后对几个回收的克隆进行测序和分析并确定共有序列。这些共识序列通常是具有保证作为药物和化学剂的高官能分子[7.-9.］．然而，有几个固有的偏见经常影响在体外例如，文库中特定基序的丰度，由于二级结构稳定而导致的逆转录或PCR扩增效率的差异。因此，确认一个特定的共识序列是最优的是困难的，通常需要识别一个自然发生的、功能对应的序列。对于与目标物相互作用的适配体的选择，一致基序可以是一个局部最小的序列，而不是一个绝对最小的能量图，这个能量图代表了所有可能的适配体与诱饵或目标物的相互作用。此外，仅从这些“高度进化”的基序很难确定分子间相互作用的一般规则。为了克服这一问题，应分析在选择的早期阶段库中的序列变化。对从起始文库逐渐集中的序列进行评估，应揭示相互作用的一般规律，即设计新的人工功能分子所必需的信息。

在这里，我们开发了一种方法，指定三重组分析，识别从RNA文库中获得的重要序列特征，这些序列仅经过与目标分子的几轮选择。三联体分析的第一步是从一级序列中提取所有核苷酸三联体(图)1）.例如，一个序列AGCGUCCA将被分离成六个三胞胎:AGC、GCG、CGU、GUC、UCC和CCA。下一步是重建这些三胞胎的父序列。如果这6个三胞胎能够被提取出来，那么就可以很容易地重建其父序列AGCGUCCA。因此，应该从频繁三胞胎的分析中揭示频繁连续序列。我们选择HIV-1 Tat蛋白作为实验诱饵在体外RNA选择是因为已经鉴定了天然存在的结合RNA基序，焦油和人工选择的结合基质[10.那11.］．因此，我们可以将我们的发现与之前识别的绑定基序进行比较，以判断我们的分析方法的有效性。

2。材料和方法

2.1。体外选择RNA适体

利用化学合成的97 bp dna，每个dna以T7启动子序列为模板，制备了一个由78个核苷酸组成的文库，每个包含一个由30个随机核苷酸组成的区域在体外转录。使用AmpliScribect T7转录试剂盒（ePicenter）从每100pmol模板DNA产生大约1nmol的RNA。通过挤压和浸泡萃取和随后的乙醇沉淀，从8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中纯化转录物。使用FMOC-NH-SAL树脂的固体载体（N-α-9-芴基甲氧基 - 羰基 - 羰基 - 超酸不稳定聚苯乙烯树脂，Watanabe Chem。），并且该合成方法在诱饵肽的C末端产生酰胺，如前所述。

将纯化的RNA置于含有2.5 mM Tris·HCl (pH 7.6)、100 mM NaCl、2.0 mM MgCl的结合缓冲液中孵育₂然后通过硝酸纤维素过滤器（HAWP，MILLIPORE）三次以除去具有过滤器结合特性的RNA。将RNA文库（100pmol）的样品与5pmol Tat肽一起温育 μL在25℃下将粘合缓冲液含有60分钟，然后将混合物通过另一种硝酸纤维素过滤器。用1.5ml结合缓冲液洗涤后，通过随后的逆转录，PCR和转录（RNA PCR试剂盒，PE应用生物系统）收集并扩增过滤器上的TAT的RNA。

2.2。点印迹分析

为了分析RNA文库的结合能力，RNA在内部用[α-^32.P] UTP (amsham)在转录过程中在体外．将标记RNA (10 pmol)与Tat肽(2.5 pmol)混合μL的绑定缓冲。孵育60分钟后，混合物通过硝化纤维素过滤器。用结合缓冲液冲洗过滤器，用生物成像分析仪BAS 2000(富士胶片)对过滤器上的放射性rna进行可视化和定量。

2．3.克隆和DNA测序

经过6轮筛选和扩增，双链PCR产物的末端被T4 DNA聚合酶(TAKARA)钝化。将钝化后的dna经乙醇沉淀浓缩，5′端用T4多核苷酸激酶(TOYOBO)磷酸化。得到的dna被连接到Hind.利用T4 DNA连接酶(TAKARA)分离pUC118质粒的II位点。将连接的质粒dna转化为大肠杆菌MV1184，在含氨苄西林、IPTG(异丙基-β-D.-硫代半乳糖)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D.-Galactoside）。在蓝白选择之后，在含有氨苄青霉素的LB培养基中随机选择20个白色菌落。重组质粒DNA从中回收大肠杆菌碱液裂解法克隆。采用bigdye终止法和ABI PRISM 310基因分析仪(PE)测定核苷酸序列。在分析的20个克隆中，17个包含作为插入的库序列。

3.结果与讨论

3．1.简单三连音分析识别重要主结构

从图中所示的库中2（a），结合Tat的rna按前一节所述进行浓缩。通过dot blot分析每一轮文库rna的结合能力，经过6轮筛选后，Tat-binding rna在filter上的积累量增加，如图所示2（b）．将经过6轮筛选后恢复的rna用该方法进行克隆大肠杆菌MV1184 / PUC118系统和测序。17个克隆的主要序列如图所示2（c）．

显然，这些序列之间没有明显的一级序列相似性区域，常规的序列比对方法[12.]没有透露任何共识序列（数据未显示）。提取30核苷酸随机区域的主要序列中的所有三胞胎。在所有64个可能的三胞胎中，23个三态重件有频率（三态的数量除以克隆数量）以上0.5（表1）.换句话说，这23个三元组随机发生在一半的克隆中。值得注意的是，八个三胞胎，UUG，UGC，UGG，CGC，AGU，GCC，GGC和GGG具有超过0.75的频率（表中的粗体值1）.从这些三联体中获得的五个以上核苷酸的连续序列是UUGCC、uugc和uugg。然而，这些五核苷酸序列仅在17个克隆中的1或2个中被发现，尽管8个三胞胎可能是tat结合RNA的重要组成部分。这一发现表明，较长的共识序列并没有集中在6轮选择中，这一过程处于相对早期的选择阶段。

３．２．三联体减法分析识别重要二级结构

进一步的分析称为三重减法，如图所示3.获取详细信息，包括RNA二级结构特征。在该分析中，三元组的盈余定义为取出所有互补三胞胎的数量后的三重态的数量。例如，计算并列出由GCU，CGC和ACG的数量减去的AGC，GCG和CGU的数量。如果共有序列位于完全匹配的茎区域中，则减法后没有剩余的三重态。另一方面，如果共识区域是未配对的（即，在凸起或循环中），则只有在减法后揭示与未配对区域的三套。例如，六个Triplets-GCG，CGU，GUC，UCC，GGG和GGC应由带有GU Bulge，AGC的配对区域揭示顾CCA / UGGGCU，如图所示3.．因此，人们可以容易地预测围绕可能有助于RNA功能的未配对区域的频繁序列。三重态减法分析的结果总结在表中2和图4.．如表所示2，只有两个三胞胎UUG和UGG在减法后的频率超过0.5。这个0.5的值是惊人的高，因为对于一个真正随机的库，所有的三联体频率应该是零。虽然uu和GGG是NUU和GGN (N表示U、C、A或G)三胞胎中出现频率最高的类型，但这两种三胞胎的出现频率均低于UUG和UGG。因此，从这些三胞胎中预测出的最可能的一致序列是UUGG。如表所示2，许多NNU和GNN可能存在于未配对的区域中，并且这些三胞胎的图案广泛传播，而Uug和UGG分别在尼向和NGN序列中脱颖而出。这些发现表明，Uugg的第二个U和/或第三个G将是未配对的基础。与Uug三联网相比，GGN三胞胎的频率是中等的，因此，目前尚不清楚第三G是否未配对。然而，这个G可能是一个未配对的基础，因为CCN三胞胎似乎不关心未配对的地区。此外，AAN和ANN三态度似乎都不会发生在二级结构的未配对区域中。NNC未找到类似的特征。这些调查结果强烈表示，由UA基对在5'末端关闭的未配对区域不会发生在与TAT相结合的图案中，即Uugg的第一个UU应该是未配对的基础。最终，我们可以确定一个序列，Nugg / CN与Unapaped Uug，是一个重要的结构基质，在RNA-TAT互动中应该具有重要作用（图5(一个)(左)。可能有一小部分tat结合rna含有NUUGG/CCN序列，其中UU双峰未配对，如图所示5(一个)， 对。该结论与基于我们的热力学参数（数据未示出的数据）的RNA的二次结构的预测结果没有冲突。

3．3．三重分析的验证

TAR是一种天然的tat结合RNA motif，它有一个嘧啶突起，UCU、UUU或UU，在其3 '端由一个GC碱基对闭合，如图所示5（b）[14.-17.］．TAT叠层中的精氨酸侧残留物与凸起的第一U堆叠，并使氢键与凸起的3'末端旁边的GC碱基对。这些相互作用以及磷酸盐骨架处的静电相互作用对于特定的TAT-焦油相互作用是必不可少的。因此，用U（Y）U凸出的焦油与TAT结合的焦油的基本结构基序是NNU（Y）UG（A）/（U）CNN，其中Y表示嘧啶核苷酸[11.那18.］．在用精氨酸作为靶标的RNA适体中看到类似的结构特征。这些精氨酸适体的一般主题是狼吞虎咽，如图所示5（c）[13.那19.］．我们的UUGG基序与TAR和精氨酸适配体的这些不可或缺的结构特征非常相似;因此，我们能够确认我们的三重分析方法的有效性。UUGG基序在tat结合RNA选择的早期就被发现，因此，UUGG基序可能是其他tat结合RNA的祖先，具有作为结合基序的基本属性。

综上所述，我们开发了三重分析方法来分析一个库。通过对从文库中回收的少量克隆的分析，我们可以确定一个重要的序列基序，而常规分析没有发现一致的序列。此外，使用这种方法可以很容易地预测所选rna中可能在许多功能核酸中发挥重要作用的未配对区域。由此产生的UUGG motif, NUUGG/CN带一个未配对的UUG，类似于tat结合rna的基本特征。该基序可能是Tat和精氨酸结合基序的基本序列，研究人员可能基于此信息构建Tat结合RNA文库，以获得“更高进化”的基序。

致谢

这项工作得到了科学研究的助项资助，“核心研究”项目（2009-2014）和“学术前沿”项目（2004-2009）来自教育部，文化，体育，日本科学技术。

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