一个结构变量从DNA折纸铰链四面体框架

文摘

纳米级多面框对象持有各种潜在的应用既是结构合成nanocontainers支架以及依据。利用DNA等基本构建块结构允许开发自下而上的自组装分子为了实现可编程性通过互补碱基的配对。在这项工作中,我们报告一个空心但刚性四面体框架75纳米杆长度由DNA折纸的方法。柔性铰链的每个四个关节提供对象的结构变化的一种方式。通过沿着struts的差距,可以创建四个变量经凝胶电泳和直接成像技术。内在网站这种技术提供的可寻址能力允许的独特目标附件染料分子和/或链接器在结构表面的任何时候,我们证明通过超限分辨荧光显微镜技术DNA油漆。

1。介绍

DNA链的设计和自组装成纳米尺度上精确定义的对象已经成为一种很有前途的技术领域的纳米技术。源于最初的想法从DNA(生成周期性晶格1),并发开发(i)赠送的短链之间的碱基配对,(ii)树枝霍利迪路口,和(3)双链DNA复合物使固有的螺旋扭曲的组装小,相同的图案构成的重复单元细胞周期二维表或三维晶体结构几乎延伸到毫米尺度(2- - - - - -5]。建立刚性的发展技术,三维的dna结构,然而,一个重要方面未来利用这种方法在纳米制造6- - - - - -11]。虽然许多试图构建简单的三维多面体已经充满了不稳定的问题,不需要的副产品,低收益,或过于复杂的合成策略,最近利用层次化装配方案(12)和DNA折纸技术(13,14)提供了一个朝着统一的人口的相对简单的一代。

DNA折纸技术是基于使用长,通常圆形“脚手架”链,折叠和夹成所需的形状与数以百计的短的“主食”寡核苷酸杂交(13]。与计划早些时候从合成寡核苷酸生成纳米结构,利用病毒脚手架,通常是7 kb循环单链M13mp18噬菌体基因组或者PCR-templated产品(15,16),允许更大结构的建筑经常扩展到几百纳米(17]。底层的异构序列脚手架链形式的独特力量这种方法的基础,由每个主要链有可能作为“处理”的位置辅助分子在结构与纳米精度的任何网站(18,19]。通过标准的净化技术,相对统一的折叠结构所需的构象可以孤立。适合此方法不仅对紧凑、结构刚性物体,而且对那些将单链之间部分严格扩展螺旋束生成对象显示柔性铰链和固有的拉伸应变(20.]。

空心,承载框架代表一个类的结构,拥有广泛的应用纳米科学作为潜在容器系统的相关性。使用编程DNA自组装的建设提供了一个非常合适的替代途径,在最近的一些研究已经证明。两个特别成功地生成高度统一的刚性纳米结构的数量。小四面体结构测量小于10纳米/支撑迅速组装从四个不同的寡核苷酸和显示重要的机械稳定性,承受压缩力超过100 pN展出前屈曲10]。后来证明,一个分级自组装的概念利用简单的重复图案从数量相对较小的寡核苷酸12)或DNA折纸工艺单元(14)可以用于生成更大的多面体合适的容器或功能单元在空间取向的纳米精度。而短的寡核苷酸的策略基于以上杂交产生高收益的正确组装产品,前者是明显size-limited基于一个简单的依赖退火计划,尽管能够选择性连接分子的能力在不同的点多面体由分层意味着遭受由于冗余股或单位内的重复图案。使用子单元由DNA折纸(14)可以通过一个简单的解决这个问题的冗余脚手架链的内部转移;然而,它需要额外的和经常复杂控制正确的三维取向和自组装多个段。因此,封闭的中空框架的制造从单个DNA支架通过折纸方法,正如前面演示了在一个球形结构(21),提供了潜在的直接生成各种各样的完全和独特的可寻址结构。

如图所示在目前的研究中,利用DNA折纸方法构造一个刚性的,封闭的四面体框架,如图1,能够产生结构达到75纳米的大小以及每条边同时保留完整的可寻址能力提供异构的脚手架链序列。单链铰链”在四面体的四个顶点允许结构的变化。通过选择性主要寡核苷酸遗漏,四个独特的二维结构不同长度和宽度75纳米和300纳米之间的生成。尽管完整的三维结构显示机械破裂可能由于electrostatic-mediated表面绑定和剪切流,不过适当的退火可以确认通过凝胶电泳和检查各种开放的框架。此外,绑定在精确确定点的荧光分子结构强调其作为新兴的一个三维的统治者的潜力超限分辨显微镜方法如DNA-PAINT和眨眼(22- - - - - -24]。

2。材料和方法

2.1。DNA结构的制备

反相cartridge-purified修改的主要寡核苷酸从Bioneer运送干公司(美国加利福尼亚州阿拉米达)和resuspended 100的浓度μM H₂o . HPLC-purified染料,biotin-modified寡核苷酸对涂料分析从IBA GmbH(德国哥廷根)购买50浓度μM H₂o ATTO655-labeled寡核苷酸序列和biotin-modified链。长8634 -核苷酸M13mp18-phage-based脚手架链制备和孤立如前所述14]。

一般退火条件下,10 nM的脚手架链和100海里的主要混合在TE缓冲(10毫米Tris-HCl EDTA + 1毫米,pH值8.0 20°C)包含MgCl 14毫米₂,加热到80°C 5分钟,并迅速冷却至60°C / 20分钟,然后慢慢冷却到24°C的步骤0.5°C /大约40个小时。主要适用于染料或生物素附件时,寡核苷酸与对接处理扩展取代unextended主食的解决方案和生物素或dye-modified寡核苷酸在500 nM /主要包括退火。涂料分析,总共六个生物素附件网站每顶点(两个)和三个ATTO655网站(每个支柱一个)被用来修改struts, II, III,如图4(一)如图S1和补充材料。

与琼脂糖凝胶电泳进行浓度的2.0%(带分析)或0.7%(结构净化)。琼脂糖第一次被加热到沸腾温度在45毫米三羟甲基氨基甲烷硼酸液+ 1毫米EDTA (pH值8.2 20°C)然后在冰浴冷却至60°C,此时MgCl₂添加到11毫米的最终浓度,在被冷却到室温胶桶。样品制备,5μL的DNA折纸结构混合3μL 6 x琼脂糖凝胶装入缓冲区(30%甘油weight-to-volume在水、0.025%二甲苯苯胺,0.025%溴酚蓝)和18总量μ在H L₂啊,大约摩尔的结构/胶袋。同样,裸支架与加载缓冲和H股涨跌互现₂O给总额摩尔每样本。不同的凝胶口袋里满是折纸和支架样品1 kb DNA梯和运行大约3小时在恒定70 V / cathode-anode 22厘米的距离。整个装置在冰水浴冷却在运行,以避免不必要的结构变性。后来,这种凝胶在0.5沾一个溴化乙锭的解决方案μ克/毫升和302 nm紫外线激发下成像。电泳后,凝胶的主要乐队是切除和离心机在旋转列5000 g×7分钟(冻结’挤压旋转列,Biorad)隔离结构。纯化折纸样本通常估计含有约1海里的退火结构。

2.2。可视化的结构(TEM、AFM)

透射电镜成像
Formvar-supported碳涂层TEM网格从龙门GmbH(位于德国)购买。网格是第一hydrophilicized Diener电子毫微微等离子清洁。2μL纯化折纸样本添加到网格,和结构被允许绑定为60秒。多余的样品很快从网格中删除了与滤纸吸收。网格很快就用1%醋酸双氧铀在H₂啊,然后用相同的彩色15秒,允许完全干燥。样本然后用jem - 1011透射电子显微镜成像(JEOL)在100千伏。

AFM成像
查看与原子力显微镜,5μL纯化折纸样品放置到一个新鲜的裂解云母表面(龙门GmbH是一家位于德国),通过热熔胶在15毫米金属样品盘(Ted斗篷,Inc .)、整理,加州,美国。结构被允许绑定与30 60秒之前洗两次μL(包含12.5毫米MgCl TE缓冲溶液₂删除的折纸对象和其他碎片。样本成像在开发模式在前面提到的TE /毫克^{+ +}缓冲条件使用毫微秒示波器三世多模AFM从数字仪器(美国德克萨斯州Veeco仪器有限公司·普莱恩维尤)与合成的弹簧常数N / m (Veeco)。

2.3。形状分析DNA的油漆

样品制备
有房间的盖玻片(LabTek, NUNC、Langenselbold、德国)准备全内反射(行动)显微镜以以下方式:首先在玻璃表面的清理了0.1高频30秒和PBS洗。然后他们被钝化的5毫克/毫升牛血清白蛋白(BSA)和1毫克/毫升biotin-conjugated BSA 16小时。与PBS删除第二个洗后的蛋白质,表面是孵化15分钟和0.01毫克/毫升链霉亲和素(IBA GmbH)然后用PBS删除多余,飘散的链霉亲和素。50μ样品溶液的L MgCl包含90%的1米₂缓冲和10%纯化折纸的解决方案(最终结构的浓度大约0.1海里)添加到室和被允许绑定到表面。绑定是通过生物素连接器折纸结构,包括在每一个顶点的飞机由struts, II, III。钱伯斯再次用PBS移除的结构,和一个50 nM解决ATTO655-labeled寡核苷酸(PAINT-DNA) 500毫米氯化钠添加。

显微镜设置
倒置的奥林巴斯ix - 71客观型TIRF配置配备UPlanSApo目标(100 x, NA 1.40,油浸)用于监测。染料都激动的单模激光二极管(XTL, Toptica光子学、Grafelfing、德国)在100 mW的波长λ= 650海里。荧光成像在EMCCD相机(Ixon du - 897,和或技术,贝尔法斯特北爱尔兰)。图像大小为128×128像素,每个像素代表一段约90海里。每个获得序列图像包含大约2000帧的速度拍摄20 Hz。

3所示。结果与讨论

3.1。四面体的设计

四面体的设计是实现使用caDNAno [25)软件包,开发方便的布局和三维平DNA折纸结构。一个圆形支架8634核苷酸链允许最大尺寸,并入其最终配置的总共211短链。每个四面体的六个struts是基于六束平行双螺旋线(14,26],227碱基配对的长度,每个双螺旋结构由一个圆柱体三维示意图(图1(a))。四个铰链的包连接在每个顶点的两个相邻包由四个基本的单链部分圆形支架之间的扩展他们的目的地,如插图所示图1(b),在每一个顶点,相邻双螺旋线在单个six-helix包被选为连结点的两个相邻struts,以减少可能产生的压力sterically诱导伸展约4海里单链连接部分。此外,连接点的两端,一个支柱从同一条双链螺旋延伸部分,最大限度地减少任何可能的不利twist-strain包(内21,27]。我们采用了如图所示的命名法1(一个),每个支柱是标记为1到6。由于圆形脚手架链的连续性和周期性的脚手架相邻螺旋之间的跨界车在单个six-helix bundle, struts 1、5、6点,包含三个支架跨界车是包含在一个沿着双螺旋seven-base部分。突出显示,如图1(c)为支撑,三个支柱内几乎一致的差距是稳定只有主食寡核苷酸杂交支架部分在每个开放的对立。缺乏直接连接从内部支架路径贯穿结构,这些连接,称为1,5和6配合前面的命名,必须被视为缺点容易破裂;然而,他们提供整体四面体的结构变化,将在后面的小节中讨论。完整的示意图脚手架和主要安排在整体结构中可以看到如图S1的补充材料。

特定绑定的四面体表面是通过添加一个18-base序列的3′末端六主食,每个月底终止一捆躺在飞机由struts 1, 2, 3,包含一个生物素分子共轭互补的寡核苷酸3′末端可以杂化。这使得稳定的结构表面涂以附件biotin-binding蛋白质链霉亲和素等。定位的生物素的3′端修改链直接对接结构强加和表面之间的亲密可能绑定对象。以类似的方式,其中一个主要定位在每个struts 1的长度,2和3的3′末端的外表面包被选为处理与ATTO655染料结合互补的寡核苷酸的3′末端DNA链的油漆实验。在这两种情况下,生物素的任意组合或染料网站可能包含在更换正常的短链的结构与延长免费“处理”或对接序列。

3.2。完整的四面体结构属性

结构在一锅法反应退火TE缓冲的MgCl 14毫米₂。退火后琼脂糖凝胶电泳分析,定义良好的乐队观察表明人口均匀退火结构,以及额外的迹象慢迁移聚合产品,可以看到如图S2补充材料。小能带结构的变化观察到不同退火时间从18岁到170小时,虽然延长引起的单链之间的支架部分struts更高的迁移速度和没有太明确定义的能带结构(参见图S2的补充材料)。从分析相对带强度的凝胶,主要退火产品的收益率约为20%。大多数scaffold-containing材料仍在凝胶的口袋,那里可能聚合结构无法有效地输入或通过凝胶迁移矩阵。

退火对象与醋酸双氧铀负染色并通过透射电子显微镜(TEM)分析结构特点。尽管定义结构凝胶乐队,TEM观察了缺乏完整的四面体,很大一部分的结构显示明显的沿一个或多个单独的struts。两个这样的例子在左边面板的图所示2;个人six-helix包struts似乎最顶点内形成良好的和连通性维护;然而,结构显示变形或扁平的配置似乎来自于一小部分破裂沿一个或两条边的长度。测量长度的单个struts变化从70年到90海里,接近75年的估计价值基于0.34 nm相邻碱基之间的轴向间距双螺旋结构。

3.3。分段验证适当的退火

普遍存在的畸形结构在TEM下观察指出了两种可能的原因之一;一个系统误差在退火时由于意想不到的内部压力或动能陷阱,或适当的退火四面体变性由于机械压力经历了净化过程中,固定和染色的对象。任何单一的缺乏明确的优势“破碎”四面体构型在TEM下观察尽管电泳定义良好的能带结构强烈表明,第二个考虑的是更有可能的解释上述的观察。正如前面强调的,这三个地区差距在每个struts 1、5、6的紧密排列形成的支架跨界车沿着包必须被认为是削弱点。仔细检查潜在的主要连接间隙,见图1(c)支柱5表明,杂化部分稳定空白沿着一个螺旋轴在一些情况下尽可能短的两个核苷酸在重叠特定的短链的终止。虽然某种程度的稳定造成堆积相互作用可能发生一些对接螺旋线(28,29日),不过这些点更容易破裂在强剪切或压缩力比其他点的连续部分支柱或顶点。这可以通过一个简单的比较理解的两个不同的债券类型稳定负责搭建的DNA结构:氢键互补碱基配对和共价连接的聚合物骨干组成的主要DNA支架结构。对于前者,它已经证明了部队的50 piconewtons足以诱发shear-oriented杂化DNA链的断裂(30.,31日]。相反,早期的研究表明,共价键通常可以承受力量的nanonewton规模之前经历破裂(32]。有关四面体的整体稳定性提出了工作,相对较弱的杂化纤维寡核苷酸跨越地区的差距在struts 1中,5和6将更容易受到外部压力下破裂比任何其他领域的稳定性除了持续支持的碱基配对,共价键连支架支柱。

标准技术研究dna纳米结构如TEM、AFM依靠强大的静电绑定的带负电荷的结构层,如云母或碳涂层网格用于TEM和染色协议包括洗涤和干燥步骤,快速、高剪切流体的添加和删除。虽然这已经被证明只有名义危害更紧的刚性结构,削弱了struts特别容易破裂,由于electrostatic-driven压缩或变形力包含剪切组件和有可能观察到的候选人开放配置压缩表面上。

及外力作用下的断裂削弱分形成的差距在struts标识为一个可能的候选人观察变形四面体,我们试图调查产生的各种配置目标差距的不同组合。由于其设计和当地装订路径围绕这些连接,这些二维构象可以省略产生的主要组织生成的三个缺口在退火。为了这个目的,一个开放的配置由一个特定组合的省略了斯台普斯的差距被分配的差距或差异大概数量。通过这个术语,配置生成的斯台普斯被称为遗漏的差距n156;,造成的差距以及支撑6n6,等等。虽然有差距主要组的共有七个可能的组合可以被排除在外,结构性裁员意味着总共只有四个可能的平面配置存在。以上大致勾勒出相应的车道在凝胶显示在右面板图2,n6代表结构的三个相同的配置包含一个遗漏。

各种平面结构是退火和分析完整的四面体。我们可以看到在凝胶图2,移民和能带结构的差异变异三个小时后被明显分离在2%琼脂糖70 V / 22厘米。乐队不同的平面二维装配显示一个可以预见的低分辨率比他们完全退火,大概是由于他们的程度的增加构型的灵活性在开放、灵活的关节。两种结构,线性化n156形式和矩形n16乐队有一个重要的人口迁移速度比完整的四面体结构的产品包含所有主食。这可以解释为缺乏结构的刚性三角形子结构在两个坐标系,从而导致一个细长的构象能够有效地通过凝胶reptate毛孔。此外,几何冗余n15和n56以及n6配置都有主要人群,显示较慢的迁移特征明显缺席完全退火的版本。在这两种情况下,这是一个强烈的迹象表明这些优先发生在任何可发觉的数量在退火的四面体和削弱点在凝胶内的struts不破裂。这没有任何变量所引起的主要产品打开配置显示相同的迁移速度满四面体以及窄带封闭的四面体的结构表明,它采用决赛,定义构造的组合产生的独特的struts破裂。近似的产量主要退火产品估计通过比较的相对强度。对于所有打开的变异,这是发现约20 - 25%,在一个相似的范围完全退火四面体,虽然较小程度的乐队清晰会使任何精确测定以这种方式不可靠。最高收益率与更加灵活和细长的被发现n156和n16变异,可能由于更大数量的整体物质能够进入凝胶。相反,最严格的变体开口(表示为只包含一个差距n6在图2显示所有产品的最小收益率,通常在20%以下;然而,最大的清晰附近的能带结构和最高数量的聚合凝胶的口袋。

著名乐队每个夷为平地的构象被切除的凝胶,并通过自旋过滤结构孤立被TEM、AFM成像之前,如图3。在每种情况下,大多数结构被发现在配置模式的建议沿着struts开口。顶点之间形成连接三部分或完整的struts似乎形成良好,和跨越段的长度范围是在理想情况下的预期75海里。在某些情况下,造成部分包故意打开缺口没有清晰可辨,可能由于这些部分的体积小和与其他struts可能重叠。种群包含更少的变形或聚合对象通常是通过AFM观察,可能造成缺乏潜在的恶劣干燥步骤中典型的铀酰乙酸负染法用于TEM观察。

在音乐会,不同的二维框架展示,在个体基础上,为每个顶点和支撑能力,包含空白区域是否连续,正确退火的一个特定的四面体的平坦的变体。这并不能完全消除的可能性意外关闭整个结构产生的内应力会导致某种程度的变形。但是,单一的主要乐队迁移速度不同的所有打开的构象是成功的有力证据退火的四面体。由此,我们可以得出结论,断裂发生在固定和染色过程到碳涂层TEM电网由于强烈表面相互作用表面吸附或横向剪切力发生在洗涤和干燥步骤。

3.4。超限分辨分析通过DNA油漆

单层DNA折纸结构最近被证明函数作为理想基质超限分辨显微技术如DNA漆(24)(分积累在纳米尺度地形成像)或眨眼显微镜(19)由于荧光染料在规定位置的能力与纳米结构的表面精度。荧光分子的本地化超出正常的衍射极限的可见光是建立的原则只有一个分子在检测区域内是活跃的,也就是说,发射荧光,在任何给定的时间22,23]。切换开关状态的荧光分子通常是由化学方法或利用内在的黑暗状态(33]。相比之下,对系统涉及的交互表面束缚dna纳米结构由于hybridization-based dye-oligonucleotide-conjugate探测器之间的绑定和解开链和免费对接链结构,转换发生的自然结果两个因素:(i)自由扩散链在溶液造成最小的背景由于行动感到兴奋只染料表面附近的隐失波和荧光(2)增加了70%达到在杂交由于intrastrand鸟嘌呤淬火显著减少(24]。这导致单之间的杂交事件发生的相对简单的检测单,标签探测器寡核苷酸和免费对接折纸的表面向外延伸链对象。此外,控制利率的绑定/释放事件可以通过改变杂化段的长度和浓度探测器内链周围的解决方案,分别是(24]。

绑定的四面体streptavidin-coated表面是通过包含六个处理网站的免费biotin-oligonucleotide杂交,两个每个结束的扩展struts 1, 2, 3,显示在图4(一)和图S1的补充材料。玻璃表面的钝化和蛋白质层包含BSA和链霉亲和素的额外优势从强烈的静电屏蔽带负电荷的结构绑定这证明破坏他们的三维形态与碳或云母表面前面部分所描述的。此外,一个主要的扩展处理3′末端的序列扩展ATTO655-oligonucleotide对接被纳入每个struts 1、2和3,作为支撑1在图的详细概述4(一)和显示如图S1 struts的补充材料。每个染料的定位网站在其各自的支柱如图4(一),这些传感器组合在一起形成一个三角安排约60纳米尺寸。8的原始对接的长度探测器寡核苷酸被选为足够长的绑定时间准确的定位,和探测器的浓度高50 nM被选为了有足够高的协会(24]。

绑定/释放事件记录在100年代的捕获率20赫兹在行动从单模二极管激光器激发波长为650 nm。记录分析了电影在一个定制的软件包在虚拟仪器编程(34]。点绑定事件发生在每一帧都配备了一个2 d高斯,和每个点的峰值坐标都进入到一个二维直方图的装箱10纳米。根据使用的配色方案,光明点代表更大频率的绑定事件在特定的位置。

在图左边的框架4 (b)11.5显示的一个快照μ米×11.5μm区域监控,右边的两个框架显示两个不同的局部区域的superresolved二维直方图的绑定/释放事件。与原始数据相比,当地景点的superresolved直方图显示三个峰的定位事件发生。三个明显的折纸对象绑定位置显示正确的距离规模和几何布置间距提出了对接网站放置在底部的四面体。通过六组对接网站的分析,我们发现局部直方图峰值之间的平均距离(68±12)海里。比较,近似预计60纳米的距离是表示图像中。我们的数据通常表明DNA的能力油漆解决subdiffraction限制结构在二维等潜在的DNA折纸超限分辨技术的框架。

4所示。结论

建设的框,笼子形结构的纳米大小的努力不仅带来巨大的研究潜力需要机械稳定纳米间距器和脚手架还可能发展的至关重要的容器适用于靶向药物输送。在这项工作中,我们提出了一个DNA折纸工艺最简单的这种架构设计;一个four-faced四面体组成的六个柔性联结struts。通过凝胶电泳分析退火对象强烈表明存在均匀退火四面体组成的大约20%的人口的总数搭建的对象,虽然结构似乎遭受破裂选择削弱点沿着struts可能由于作用力在静电吸附表面和染色过程。有意的,有针对性的开放这些弱“差距”,通过选择struts主食寡核苷酸遗漏导致的形成一组四个不同的开放配置,再次的收益率约20%,由凝胶电泳分析和可视化通过原子力显微镜和透射电子显微镜。我们发现数量时显示预期的开放形态的结构绑定到表面,证明适当的组装的各个顶点和struts,进一步支持完整的三维破裂的建议框架从外部力量。利用染料的nanometer-precise定位四面体,DNA折纸技术提供的一个关键特性,其三角形的基础是用作可视化在二维空间中一个阶段的超限分辨DNA油漆显微镜方法。分析证实了三角形排列的附加染料和类似间距预测的结构示意图。因此,我们期望这种结构是适合3 d超限分辨显微镜的测试对象。

同时观察到破损的四面体削弱点沿着struts提出来自外部压力在固定和染色,这个明显的压力下的结构不稳定性仍然是一个关心未来的实现稳定承载支架或cargo-bearing容器等对象。这可以解决长之间的重叠连接主食跨越单个螺旋或由一个线性脚手架链整合进未来设计减少削弱了地区差距在struts由保持圆形支架连续性的必要性。酶结扎对接3′,5′末端的主食在折纸结构被提出作为一个潜在的手段,提高单层体系结构的整体稳定性35),可以进一步加强三维框架提出了工作。此外,最近开发的技术金属化的DNA纳米结构可以应用作为一个潜在的机械手段稳定和四面体及其二维电用变体(36- - - - - -38]。

确认

这项工作从NIM财务支持的资金,岑,和脱硫(LI1743/2-1 TI329/5-1)。作者想另外博士承认Susanne整洁的援助与透射电子显微镜成像和菲利普·尼克尔斯和拉尔夫Jungmann博士在原子力显微镜的帮助可视化。

补充材料

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