光电开关Site-Selective RNA分离顺序合并的偶氮苯和吖啶DNA低聚物残留

文摘

光敏系统site-selective RNA分离已经准备通过结合Lu (III)离子与吖啶/偶氮苯dual-modified DNA。修改后的形式与衬底heteroduplex RNA、DNA和目标磷酸二酯联系前面的吖啶残留陆选择性地激活,(3)离子迅速裂解连杆。介绍了偶氮苯残渣毗邻吖啶残渣作为光敏开关,它触发site-selective切断紫外线照射。一个反式偶氮苯异构体的有效地抑制了分离,而紫外线照射形成的顺式异构体几乎不影响分离。因此,乳沟的1.7 - -2.4倍加速实现通过紫外线辐射3分钟前反应混合物。考虑到光异构化的收益率,内在的活动独联体同分异构体是比的高14.5倍反式同分异构体。

1。介绍

在这几十年,大量的注意力都集中在site-selective RNA分离,因为它是必不可少的为未来的分子生物学和治疗(1- - - - - -3]。发现的重要作用的短RNA在活细胞进一步推广这个4]。我们最近开发了高效的人工系统site-selective RNA分离结合金属离子(镧系离子或一些过渡金属离子)作为分子剪刀和一个acridine-modified DNA序列选择性RNA活化剂(5]。的5′-或3′目标核苷酸的磷酸二酯键的吖啶基,在中性条件下质子化了的形式,site-selectively激活通过一般的酸催化6]。当陆(III)离子作为催化剂,一般的酸催化优先促进3′的乳沟一边联系。此外,构象变化引起的RNA骨干吖啶夹层被认为是激活的另一个重要因素。RNA的其他部分不受金属离子感应水解与DNA形成双添加剂。目标站点可以自由选择的序列,和反应选择性和高效足以实现同步串联分离在附近小10核苷酸(7]。该技术已经应用于新的基因分型方法单核苷酸(SNP)或insertion-deletion (indel)多态性8]。

这个系统的一个重要优点是任意函数可以被添加到它的额外修改acridine-modified DNA。这样的一个例子是增加配体DNA本地化目标站点附近的催化剂(9]。介绍iminodiacetate配体的点在大槽导致超过三倍site-selective乳沟的加速度。光电开关的乳沟是另一个吸引人的功能化系统,自光可以在任何需要的时间触发的反应不改变化学或物理条件(10]。偶氮苯是一种最受欢迎的光敏分子用于此类研究。偶氮苯的异构化反式异构体,刨床和疏水性,笨重和极地独联体同分异构体在紫外线(海里)辐照和回到反式同分异构体在可见光(海里)辐照。

我们报道的第一个光敏系统site-selective利用acridine-modified DNA和RNA分离自由锰(II)离子作为催化剂裂解(11]。那里,一个偶氮苯组之间插入DNA的吖啶环和骨干作为链接器(见X₂在图1)。尽管phototriggered加速site-selective RNA分离系统中的实现,乳沟活动相当边际(选择性解理18 h后的收益率是4%),和加速度的大小紫外线照射后只有40%。因此,更积极的和明确的photocontrol site-selective RNA分离使用免费路(3)离子作为催化剂一直期望的。在这项研究中,新photocontrollable site-selective RNA活化剂已经准备通过引入一个独立的偶氮苯残渣DNA低聚物结合(图一个吖啶残渣1)。这样的偶氮苯残留反式形成堆栈在邻残渣吖啶和有效地抑制site-selective RNA激活。当解决方案与紫外线辐照和偶氮苯异构化独联体异构体,吖啶释放叠加,乳沟反应明显加快。明确photo-control高效site-selective RNA分离已成功完成。

2。材料和方法

2.1。光谱学

¹H NMR光谱得到在500 MHz NMR谱仪(力量Biospin)。电子喷雾电离质谱法(ESI),日立公司的m - 8000 LC / 3使用dqm质谱仪。MALDI-TOF / MS测定力量Daltonics AutoFLEX质谱仪。

2.2。制备寡核苷酸

的phosphoramiditeX₃合成从之间的耦合2-chloro-4-nitrobenzoic酸和4-isopropoxyaniline如[6,12]。phosphoramidite的合成路线X₂在描述11]。的phosphoramidites和根据[合成13]。所有的寡核苷酸合成ABI 3400 DNA合成仪在1μ摩尔的规模。自动化的DNA合成的试剂购买从格伦研究有限公司(美国弗吉尼亚州)。修改DNA的合成,一个扩展耦合时间10分钟的耦合采用偶氮苯,acridine-phosphoramidite单体。的DMTr-off寡核苷酸从支持和裂解deprotected通过治疗methanolic氢氧化钠(1毫升,0.4,甲醇:水= 4:1)在室温16 h。

2.3。纯化和表征的修改后的寡核苷酸

寡核苷酸是由Poly-Pak脱盐II墨盒(格伦研究有限公司),以及由此产生的原油产品提纯20%变性页面。最后进行净化一个反相高效液相色谱法配备一个RP-C18列(Cica-Merck LiChroCART 125 - 4;线性梯度0% - -25%的乙腈与甲酸铵(50毫米)25分钟;流量0.5毫升/分钟)。他们完全以MALDI-TOF /女士在正离子模式(表中1)。确定每个寡核苷酸的原液浓度在260 nm紫外线吸收的DNA和每个核苷的高效液相色谱量化由消化蛇毒磷酸二酯酶和碱性磷酸酶。

2.4。RNA乳沟化验

衬底RNA(18的混合物μ5.5 L,μDNA(11美元)和修改μpH值7.5米)三羟甲基氨基甲烷缓冲液(11毫米)含有氯化钠(220毫米)准备和分成两半。两部分都加热到90°C 1分钟,慢慢冷却到室温。其中一个部分是辐照与UV紫外线点光源(滨松光子学)通过UV-D36C异构化(Asahi Technoglass) 3分钟反式偶氮苯的独联体同分异构体。选择性裂解反应是由增加1μL(水LuCl₃解决方案(1毫米,最终浓度为100μ米)的混合物。孵化后37°C的预先确定的反应时间,反应就熄了1μEDTA的L·2 na解决方案(100毫米)和20%变性分析页面。所有的反应都是在黑色的管子,这样进行的独联体异构体没有异构化反式由环境可见光异构体。

3所示。结果与讨论

3.1。光敏Site-Selective RNA分离的结合Lu (III)离子和Acridine-Azobenzene Dual-Modified DNA

实现有效的photo-control site-selective RNA分离催化鲁(III)离子,新的吖啶/偶氮苯dual-modified DNA合成(2在图1)。这个DNA有吖啶残渣()作为18残渣。吖啶环在9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine。这是最受欢迎的吖啶残留,常常被用来作为一个双稳定剂或荧光标签(14,15]。链接器的一部分是一个灵活的烷基链,立体化学的分支点不是控制。毗邻,一个偶氮苯残渣(),还介绍了19残渣。这共轭D-threoninol和偶氮苯双形成的是一个好的光电开关(13]。当相应的简单acridine-modified DNA3杂化互补衬底RNA吗1独自,目标U-19残渣仍未配对,和5′磷酸键(箭头在图所示1陆)的目标是高效裂解(III)离子吖啶酸催化的援助。3′磷酸键也略微裂解,但它只是导致RNA链的构象变化和吖啶的影响不大。控制,以前dual-modified DNA (4),熊一个偶氮苯作为链接器一半也用于乳沟实验结合未经修改的DNA (5陆)和(3)。

图2是一个典型的20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)模式的裂解反应。当1杂化,2和陆(III)离子被添加到解决方案在黑暗下,3′U-19只是略微裂解的磷酸二酯,和目标5′磷酸二酯几乎完好无损后4 h反应在37°C(下乐队巷4)。卵裂率为1.9%和1.0%,分别。相比之下,11.7%的5′端使用简单acridine-modified DNA乳沟3(巷8),添加反式偶氮苯毗邻吖啶几乎完全抑制了选择性乳沟。当退火混合与紫外线辐照前陆(III)之外,偶氮苯异构化的独联体—构成,另一方面,乳沟的5′磷酸二酯明显恢复(巷5)。乳沟收益率在5′-phosphodieser这里是2.5%(收益率在3′磷酸二酯为2.0%)。类似的乳沟收益率达到两个重复的反应与独立准备反应混合物。两倍以上的加速解理实现选择性的目标链接仅仅3分钟紫外线照射。相比之下,小变化是观察在乳沟前的存在组合(车道6和7)。这种组合优先促进3′端解理与其他acridine-modified DNA,但是比率的3′端乳沟的5′端乳沟既1.8无论紫外线照射。以前的不能够photo-control陆(III)催化RNA水解。正如所料,紫外线照射不影响解理使用3,不承担偶氮苯(车道8和9)。有效photoregulation site-selective RNA分离催化由陆(III)是可以实现的只有与吖啶的现行制度和偶氮苯分别介绍给半个DNA作为单独的残留物。

3.2。收益率的估计在DNA / RNA Heteroduplex光异构化

根据先前的研究,介绍了偶氮苯的光异构化DNA时有些抑制DNA形式与互补的DNA或RNA双工,可能是因为堆积与相邻的碱基对。的产量反式来独联体异构化是据报道只有20% -40% DNA / DNA双工(16]。偶氮苯的异构化2预计也将是不完美的。此外,众所周知,独联体来反式触发反异构化不仅通过可见光照射,但热异构化也出现在显著率(17]。估计这些属性是必要的介绍了吖啶残渣。

每一个异构体的人口可以被监测的变化估计在332 nm紫外线辐照前后吸光度。图3显示,紫外光谱的1/2复杂的紫外辐照前后。紫外辐照后的解决方案,重大减色现象观察332海里。吸光度逐渐恢复之后,反异构化得到的一阶速率常数Abs的时间依赖性_332年0.032 h⁻¹。这个号码对应的半衰期16 h。它是相当足够的反应时间。考虑到和人口的比例反式-来顺式热休克后异构体是94:6(1分钟90°C) (18),紫外线照射后估计比70:30。几乎没有变化是观察260 nm紫外线辐照前后的吸光度(数据没有显示)。因此,异构化的偶氮苯在这么长的寡核苷酸不影响整个双地层条件下使用。

3.3。还是快Photocontrolled乳沟利用吖啶残渣更活跃

吖啶的残渣上述实验中使用商用和熊9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine。在我们先前的研究优化吖啶环的结构和链接器的一部分,更活跃的吖啶残渣(在图4)了12,19]。这熊更酸9-amino-2-isopropoxy-6-nitroacridine通过光学纯链接器基于L-threoninol和4-aminobuthanoic酸和显示RNA激活能力高于近三倍。通过使用,四种dual-modified寡核苷酸是准备。的dual-modified寡核苷酸8是对应的2和熊在的地方在结合3′端。的寡核苷酸9也熊和在中间,但是的5′端插入。之前的研究已经表明,立体效应引起的异构化的偶氮苯强烈依赖于regiochemical构象threoninol骨干(13]。为了比较,的非对映异构体准备,并纳入寡核苷酸6和7。

图5显示了一个使用寡核苷酸轴承9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine site-selective RNA分离的比较(2和3)和9-amino-2-isopropoxy-6-nitroacridine (8和10)。在巷9,寡核苷酸轴承9-amino-2-isopropoxy-6-nitroacridine通过L-threoninol链接器(10)也有效地激活RNA和促进site-selective分离催化由陆(III)。效果几乎是三倍的3。当一个偶氮苯残渣D-threoninol链接器()反式插入表格的3′端吖啶残渣(8巷7),site-selective解理与9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine大大抑制系统中一样(2,莱茵4)。然而,乳沟活动显著恢复紫外线辐照时的反应混合物3分钟前裂解反应的起始(巷8)。site-selective乳沟的收益率在5′磷又是两倍,没有紫外线照射。

评估如何插入的位置和偶氮苯残渣的regiochemical构象影响其光电开关产量、site-selective RNA分离使用6- - - - - -9执行(图6)。注意,在这个实验中反应时间延长到7 h来获得更多的显式差分乳沟收益率。紫外线照射后的反应活性的恢复(= 5′的收益率与紫外线照射/磷酸乳沟没有紫外线辐照)是2.0倍6,2.1倍7,2.4倍8和1.7倍9。这些结果表明,偶氮苯残渣反式形式有效地抑制site-selective RNA激活不管位置的插入和链接器regiochemical构象的一部分,和偶氮苯的残留独联体不形式。在所有的情况下,改变3′端切断紫外线辐照前后很边缘。考虑到一般酸催化质子化了的吖啶几乎与3′端劈理(6,19),目前的增强的5′端乳沟的复苏可能主要是因为一般的酸催化。它已经表明,偶氮苯反式形式是充分刨床和疏水栈时邻近DNA碱基对引入DNA双(20.]。强烈叠加交互在DNA双工也对各种染料轴承相似的偶氮苯环(21]。有效抑制吖啶的功能在本研究可能是由于堆积相互作用反式偶氮苯和吖啶(图7)。这种机制还支持由一个观察到的两个吖啶残留到目标网站强烈降低卵裂率(5]。的反式来独联体异构化引发的紫外线照射释放吖啶的叠加,并让它激活RNA。如果是这样的话,1.7 - -2.4倍复苏的乳沟活动图中观察到6紫外线照射后可以主要归因于增加的人口独联体同分异构体从6%降至30%。的内在活动的比率独联体的同分异构体8到反式同分异构体可以从计算 在哪里的内在活动吗独联体同分异构体,是,的反式同分异构体。因此,100%的活动独联体异构体计算从这些数字是14.5倍高于100%反式的同分异构体8和4.5倍9。

4所示。结论

高效photo-control site-selective RNA分离已经通过免费路(3)离子结合dual-modified寡核苷酸的熊光敏偶氮苯残渣毗邻吖啶残渣。内在的活动独联体同分异构体的dual-modified寡核苷酸估计的14.5倍反式同分异构体。镇压活动的介绍反式偶氮苯与3分钟恢复2-3-fold倍只是紫外线照射。自偶氮苯异构化是可逆的顺式来反式-异构化与可见光,选择性的切断解理与当前的设计也很可行的。目前设计的最重要的优点是易于单独优化吖啶和偶氮苯残留,作为吖啶了残留在这项研究中。不同的偶氮苯衍生物与其他取代基的改进的属性如更高的光异构化收益率或增强热稳定性已经开发和引入DNA日期(22,23]。完美的开关切换的RNA乳沟可能被进一步促进可行的异构化使用这种改进的偶氮苯单体。预计进一步通用工具生物化学的发展。

确认

作者感谢名古屋大学教授Hiroyuki浅沼的有用的建议。本研究部分由专门的补助金支持促进科学研究(18001001)和补助金年轻科学家(B)(20750126)从教育部、科学、体育、文化、技术、日本和全球COE计划的化学创新。

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