实验诱导的海葵漂白Exaiptasia支持葡萄糖作为与其共生相关的主要代谢物

摘要

我们目前对伙伴间碳交换的理解共生藻-刺胞动物的共生仍然有限，尽管使用碳同位素的研究已经让我们意识到这种交换的代谢复杂性。我们检测了甘油和葡萄糖代谢，以更好地了解光合产物是如何在宿主和共生体之间交换的。这些代谢物的水平比较了共生和漂白Exaiptasia pallida海葵，分析直接参与其代谢的酶。我们测量了漂白动物中葡萄糖水平的显著下降，但甘油和G3P池的显著增加，这表明漂白动物降解脂质以补偿共生体的损失，似乎依赖共生体葡萄糖。在漂白动物中测定的较低的甘油3-磷酸脱氢酶但较高的葡萄糖6-磷酸脱氢酶活性与代谢缺陷一致，这主要是由于从破裂的共生关系中损失了葡萄糖。这些结果证实了以前对海葵碳从共生体向寄主转移的观察Exaiptasia，葡萄糖被认为是主要的易位代谢物。为了更好地理解光合产物的易位及其调控，需要对其他共生刺胞动物进行进一步的研究，特别是那些具有碳酸钙骨架的刺胞动物。

1.介绍

热带共生刺胞动物的特征是与它们的共生甲藻伙伴进行有机碳和营养物质的代谢交换，使它们能够在寡营养水域中繁荣发展[1.,2.］.从共生体转移到寄主体的有机碳的化学特性似乎因生物体的不同而不同。马斯卡廷和海沟[3.,4.]确定甘油是一种代谢物，可能会转移到动物宿主，包括珊瑚、巨蛤、海葵和水螅，尽管这项早期的研究是在新鲜分离的共生体上进行的。许多研究采用了¹⁴c -碳酸氢盐后来证明，它被共生体的光合活性摄取和固定后，在共生体动物组织中鉴定出的两种标记的自由碳水化合物主要是甘油和葡萄糖[5.–13］.总的来说，一些研究表明，从甲藻伙伴转运的碳可能以高周转率的分子池存在[5.,10,11,14]这使得很难确定地识别。

考虑到目前世界范围内珊瑚礁生态系统面临的威胁，珊瑚礁珊瑚共生中的碳转移是一个重要的研究课题。确定共生过程中转移代谢物的化学特性对于理解刺激其形成和转移的机制是至关重要的。被共生生物固定的过量碳不能用于自身的好处(即增加细胞数量)，这主要是由于共生动物的氮和磷的限制[15–19这是由于它们生活的水域缺乏营养。因此，这些多余的碳被转移到动物宿主，主要用于呼吸、钙化和粘液的产生[20.–22].考虑到共生甲藻的光生理学，目前可以推断出共生体葡萄糖和甘油释放/转运机制的相反解释：共生体产生的葡萄糖可能受到光合作用的反馈抑制[23并且不允许葡萄糖代表一个重要的溢出机制。另一方面，从共生体中释放甘油可能是一种更重要的溢出机制，因为甘油被认为具有光保护功能，作为过量碳和还原能力的吸收池[24,25］.

海葵模型Exaiptasia pallida， Burriesci及其合作者[13指出葡萄糖是这种共生关系中主要的转运光合产物。然而，上述揭示的调节葡萄糖易位的潜在机制表明需要进一步的实验证据。为此，我们检测了这种共生动物的甘油和葡萄糖代谢及其对共生物损失的反应。

2.材料和方法

2.1.生物体和实验条件

我们研究的是共生的热带海葵，最近被重新命名了苍白盲[26]。自由生长的海葵是从水族馆的水系统中采集的，并根据格拉贾尔斯和罗德里格斯进行鉴定[26］.在4 L的鱼缸中，用气泡供气维持0.5 cm踏板盘的海葵3个月。海水温度维持在室温(27°C±1°C);每周喂两次刚孵出的动物卤虫sp.无节幼虫,在完全更换新鲜海水后。灯配备荧光灯，提供250（强光）或50 μ摩尔光子米^−2.年代^−1.(弱光)在12小时的光/暗循环。漂白海葵是通过连续几天将动物暴露在4°C的黑暗中4小时获得的[27,28]处理后，在黑暗中将海葵放回水族馆一周，然后收集和处理，如上所述喂养。

2．2.动物匀浆和代谢物的定量

收集的动物在PBS缓冲液中短暂清洗，用滤纸吸干（3） 用玻璃波特均质器将动物组织（2-3个海葵，以获得足够的材料）均质化，在一个体积（相对于组织质量）的提取缓冲液中制备粗蛋白质提取物50 mM KH_2.阿宝_4.；0.01 mM EDTA pH 7.8在冰上加入蛋白酶抑制剂鸡尾酒（完整，西格玛，美国），直到完全分解（少于2分钟）。每个样品分别处理。匀浆在4℃下离心15分钟 最小值为10000 ×g；0.1 取mL等分试样用于Bradford蛋白质测定，根据制造商的要求，采用商业染料分析法（Sigma，USA）进行测量，采用BSA作为标准。颗粒藻细胞用Lugol固定以测定共生体密度。对于总甘油和总葡萄糖的测定，三等份（200 μ五十） 将每种匀浆煮沸10分钟 min，离心15 min，上清液在−70°C，直到处理。根据制造商的协议，我们使用游离甘油试剂和GO葡萄糖分析试剂盒（均来自美国西格玛）。使用SmartSpec分光光度计（BioRad）获得读数，并与相应标准进行比较。将数值标准化为湿质量。

3-磷酸甘油(G3P)和6-磷酸葡萄糖(G6P)根据Bergmeyer和Gra的协议进行定量βl (29］.简单地说，1克动物湿块用研钵和杵在液氮中研磨。将产生的粉末转移到15 mL falcon tubes中，其中包含5 mL 0.6 M high chloric acid，并在3000 ×g离心10 min。将上清转移到干净的管中，用1 mL 0.6 M高氯酸用纳米水按1:2稀释后再提取球团，与之前一样离心。收集上清液，用5 M K调节pH至3.5_2.一氧化碳_3.(指示纸)，加水至最终体积8ml。提取液置于冰上15分钟，上清液转移到一个干净的管中。G3P的反应分析由联氨(189 mM)/甘氨酸(470 mM)/EDTA (2.7 mM)缓冲液pH 9.5、2.3 mM NAD和100μ样本的L [29］.取NAD (339 nm)的吸光度读数直至恒定 ；然后201ku L^−1.加入GPDH溶液，5min后进行二次读数 ．G6P的反应检测由200 mM pH 7.6, 20μM NADP，5 mMgCl2和100 μ样本的L [29].第339页的读数 纳米每隔3分钟服用一次，直至稳定。然后,5我是35岁 库 L^−1.加入G6PDH悬液;这个反应允许进行第二组读数经过10分钟。吸光度的差异用于计算归一化为湿质量的代谢物浓度，并根据样品提取和中和过程中引入的稀释因子进行调整[29］.

2.3.共生体密度

从蛋白质和代谢物提取液中获得的沉淀细胞用20% Lugol溶液(Sigma)固定。将共生体密度归一化为蛋白质质量，直接在纽鲍尔血细胞计室中计数四个等量。必要时进行稀释，相应地调整细胞数量。

2.4.酶分析

甘油3-磷酸脱氢酶(GPDH)的测定遵循改进的程序[24].制备动物匀浆用于代谢物测定，但在TrED缓冲液中（10 mM茶，1 毫米乙二胺四乙酸，1 mM DTT，pH值7.5）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（美国西格玛，Complete）。通过在10000℃下离心澄清粗提取物 ×g，15分钟 在4°C条件下，将上清液用于蛋白质测定和酶测定，在这种情况下，PEG（3500 将MW）添加至15%的最终浓度以稳定酶。在使用微孔离心过滤器（30 在4°C条件下，测定了2个样品的比活度 含160个氨基酸的mL分析 μM NADH和1 mM-二羟基丙酮磷酸盐。对于每个样品，通过添加25或50来启动三份分析 μL动物提取物，并随访5个月 NADH吸光度的最小下降率（339 使用生物分光计（美国埃彭多夫）对空气进行测量，以计算报告为单位的比活性(μ底物的摩尔转化率^−1.) g^−1.蛋白质的质量。

对于G6P脱氢酶(G6PDH)酶活性的测定，我们遵循Bergmeyer和Gra中描述的方法βl (30.］.简单地说，反应分析包含50 mM Tris缓冲液pH 7.5, 380μM NADP, 6.3 mM MgCl_2.， 3.3 mM G6P, 5 mM马来酰亚胺。反应开始于加20μL澄清的动物提取物，在339 nm下对纳米水进行读数。反应呈线性后，每隔1分钟测量5分钟。酶的比活性是以每克蛋白质质量的单位来报告的，一个单位是吸光度的增加，对应于1的转换μ每分钟的基质摩尔数。

2．5．西方墨点法

为了检测甘油激酶(GK)和葡萄糖激酶(GCK)，在12%丙烯酰胺浓度的SDS-PAGE系统中，总蛋白的浓度相近。将分解后的蛋白转移到硝化纤维素膜上，与小鼠中针对人类抗原(GK (H-132)， SC-366975和GCK (H-88)， SC-7908;圣克鲁斯生物技术，美国)。我们检测了几种刺胞动物的两种酶的氨基酸序列中抗体表位的相容性。两种抗体在1:50 00使用，用一种与碱性磷酸酶偶联的抗小鼠二抗(Sigma)检测。结合抗体用蓝色底物试剂盒(BCIP/NBT, Sigma，美国)开发。

2.6。统计分析

所有实验都有三个生物学上独立的重复，至少有两个技术上的重复。数据以平均值±标准差表示。对于代谢物的比较，结果与方差分析进行比较，然后进行事后Tukey HSD测试 的意义。用学生的方法比较了共生动物和漂白动物的酶比活性以及。

3.结果

我们得到漂白海葵平均减少92%的共生体。结果如表所示1.．在相同浓度的两种光照条件下(高光照和低光照)，共生海葵的总甘油水平均被检测到，而低光照条件下共生海葵的G3P水平显著升高(图)1.)．相比之下，漂白的海葵总甘油的浓度明显更高，但其磷酸化形式与弱光下的海葵相似(图)1.)．在两种光照条件下，共生海葵中总葡萄糖的浓度都比甘油高10倍，而在漂白动物中则显著降低(图)2.)．在所有条件下，G6P水平都很低(图)2.)．

测定了弱光条件下共生动物和漂白动物提取物中GPDH和G6PDH的比活性。结果显示，与共生状态下的动物相比，漂白后的动物GPDH酶活性显著降低(表)2.)．另一方面，结果显示，在漂白动物中G6PDH酶的比活性提高了约30%(表2.)．

葡萄糖激酶特异性磷酸化葡萄糖的检测结果不是决定性的。在共生或漂白的动物中未检测到甘油激酶，但仅在动物中检测到共生藻提取物，检测一个明显分子量为55 kDa的多肽(数据未显示)。

4.讨论

4.1.漂白后代谢物和酶活性的变化

即使有证据表明甘油和葡萄糖在刺胞动物中是易位代谢物共生藻共生体可能还不够，我们的结果显示，与漂白的海葵相比，有共生体的海葵的葡萄糖水平高出近50倍。相比之下，漂白海葵的甘油水平增加了约三倍，表明脂质分解代谢，正如文献记载的那样，这是由于营养不足引起的[31,32］.我们测量的磷酸化甘油(G3P)的值符合这一解释，因为这种代谢物在脂质合成时不积累。然而，有趣的是，在低光下，与高光下的共生动物相比，漂白动物的G3P水平更高，更类似，这表明在低光下，海葵从它们的共生动物中获得的碳更少。这种可能性并不反映在葡萄糖水平上，可能是由于二次合成。相应地，漂白海葵中GPDH酶的比活性显著低于共生状态下的海葵。似乎脂质降解正在补偿漂白海葵中葡萄糖的大量减少。Garrett等[33的脂质谱大肠pallida共生和非共生。在他们的发现中，他们确定了非极性脂类，如三(tag)和二酰基甘油(dag)，在共生状态的海葵中更丰富。在我们的实验中，脂质降解可能解释了非共生海葵中甘油水平的升高。此外，GPD在漂白海葵中的比活性过低，强烈表明在这种条件下几乎没有脂质合成发生。GPDH催化G3P可逆转化为二羟基丙酮磷酸(DHAP)，是糖酵解、糖异生和脂质代谢的主要环节。低水平的GPDH活性将引导碳通量通过脂质分解代谢到糖酵解。这项评估与我们在漂白海葵中获得的磷酸化形式和葡萄糖和甘油水平的结果一致。

与有共生体的海葵不同，漂白海葵对G6PDH的比活性显著增加，表明漂白动物为缓解脂类分解代谢导致的脂肪酸缺乏所做的补偿努力。G6PDH是戊糖磷酸途径的第一步，它能再生NADPH进行合成代谢，也能产生戊糖，如核苷酸合成的前体核糖-5磷酸。当增加时，参与氧化戊糖磷酸途径的酶(如G6PDH和6-P葡萄糖酸脱氢酶)的水平，而不是导致细胞生长所需的碳骨架的积累，而是再生NADPH，这对脂肪酸生物合成的减少至关重要[34］.

4．2．光照和摄食的影响

我们的结果显示，在两种光照水平下，共生状态下的甘油和葡萄糖水平相似，这可能表明我们使用的光照水平在质量上没有太大差异。此外，我们保持动物适度喂养，但我们清楚地区分了共生体显著减少（漂白）的效果在我们测量的代谢物中[35在营养充足的珊瑚中显示了这一点Stylophora pistillata，辐照度水平决定了转位碳的数量，在强光下观察到较高的转位，以及共生体的较高固定，导致宿主生物量的增加，而在弱光下，他们测量到的转位较少，但宿主和共生体生物量较高。对于未饲养的菌落，辐照度水平没有显示出碳的转运或利用的差异。由于我们没有测量高光和低光处理对具有共生体的银莲花的甘油和葡萄糖池的差异，我们可以得出结论，银莲花没有得到很好的喂养。最后，如果甘油和/或葡萄糖从共生体转运到宿主，我们希望能够检测到共生动物中的葡萄糖激酶和/或甘油激酶。由于我们的结果为阴性，我们假设这些酶的水平可能较低，但足以使这些代谢物在被动物细胞摄取后磷酸化，或我们没有检测己糖激酶，因为它不是葡萄糖的特异性酶，但这种酶在磷酸化潜在转位的葡萄糖方面可能更重要。

4．3．Symbiont-Dependent新陈代谢Exaiptasia

我们的结果强烈地表明，共生的代谢大肠pallida取决于新鲜葡萄糖的供应，这与已发表的观察结果一致¹³c标记的葡萄糖在动物组织中暴露2分钟¹³碳酸氢盐[13］.相比之下，热诱导的白化似乎对这种海葵的葡萄糖代谢有很小的影响，正如Hillyer等人所证明的[36］.

脂肪酸和脂类是宿主动物碳和能量的主要储存物;伙伴之间的有机碳转移影响共生关系中的这些储存[33,37,38].植物自养源碳Exaiptasiasp.最好储存在可被宿主快速消耗的脂质中[39］.希里尔及其合作者[40]测量了这些海葵在热应激后多种PUFAs的损失。当面临白化过程中出现的共生体减少时，动物宿主将其代谢转向脂质储存的分解代谢，以提供必要的能量[41–43］.我们能够通过我们的实验装置来区分代谢物的变化葡萄糖池减少；甘油和G3P池的增加，G3PDH比活性降低，与甘油的合成有关G6PDH酶的比活性增加。

我们的实验方法不能排除甘油在共生体中被转运并用于合成葡萄糖的可能性。在这种情况下，甘油需要磷酸化（通过甘油激酶，这是我们在共生体或漂白银莲花中无法检测到的）然后氧化回DHAP，缩合成1,6二磷酸（通过醛缩酶的可逆作用），需要2个ATP分子，因此是一个能量消耗途径。四种关键酶调节人体糖异生：丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、果糖1,6双磷酸酶和葡萄糖6-磷酸酶。前两种酶与氨基酸产生碳水化合物有关；后两种酶与糖异生有关在糖异生的最后步骤中。在漂白或饥饿过程中（通过脂质或蛋白质分解代谢）可能会通过二次合成产生葡萄糖，但在共生动物中其合成的能耗替代途径将难以支持。此外，Burriesci及其合作者[13]在评估有糖异生抑制剂1-巯基甘油存在的海葵光孵育样品后，无法检测标记葡萄糖的变化。

最后，乙醛酸循环中的两种关键酶已在海葵的转录组中被识别出来，但只有异柠檬酸裂解酶在共生动物中表现出过表达，而非非共生动物中则相反[44］.通过这一途径，乙酰辅酶a产生四碳琥珀酸，它可以进入糖异生，因此是由甘油合成葡萄糖的另一条途径。然而，在这里，甘油必须被磷酸化，氧化为DHAP，并进入糖酵解以产生乙酰辅酶a。在特定环境下，这种合成葡萄糖的替代品在共生动物中可能是活跃的。

5.结论

海葵中共生体的丧失明显降低了葡萄糖水平。我们的结果与文献的一致性[13,36,45强烈支持这样一种假设，即葡萄糖是植物共生过程中还原碳转运的主要化学形式大肠pallida．用甘油合成葡萄糖的可能性似乎不大，因为这是一种消耗能量的途径。然而，考虑到葡萄糖对光合作用的调节作用，我们仍然需要解释为什么会从共生体中释放葡萄糖[46而不是指望葡萄糖是一种碳溢出机制。相反，高氮条件可能会超过葡萄糖对光合作用的反馈作用，但这种条件在中国仍有争议共生藻-营养贫乏水域下的刺胞动物共生[16,47–49］.

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

Raúl Eduardo Castillo-Medina感谢墨西哥国民教育协会Tecnología的研究生奖学金。这项工作得到联阿援助团-联阿援助团- papiit的支持。IN205714)。

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