1。介绍
热带共生刺丝胞动物代谢交换为特征的有机碳和养分的共生腰鞭毛虫伙伴,允许他们在贫营养水域繁荣(
1,
2]。有机碳的化学特性,从共生有机体转移到主机似乎不同的有机体。Muscatine和沟
3,
4)确定甘油作为一个代谢物可能转移到动物宿主,包括珊瑚,一个巨大的蛤蜊,海葵,早些时候和zoanthid,虽然这工作进行了新鲜孤立的共生体。许多研究采用标记14C-bicarbonate已经证明了其吸收和光合作用固定的活动后的共生体,两个标签,自由碳水化合物中确定共生动物组织主要是甘油和葡萄糖(
5- - - - - -
13]。总的来说,几个贡献表明,碳转移从腰鞭毛虫的伴侣可能存在的分子池高流动率(
5,
10,
11,
14使它很难认同肯定。
考虑当前威胁珊瑚礁生态系统在世界范围内,碳易位礁珊瑚共生的代表一个重要的研究课题。定义转移代谢物的化学特性的共生关系是至关重要的理解机制,刺激他们的形成以及转移。多余的碳固定的共生体(即不能用于他们自己的优势。,increase in cell numbers), mainly due to the limitation of nitrogen and phosphorous of the symbiotic animals [
15- - - - - -
19),由于营养物的水域。因此这个多余的碳转移到动物宿主,主要用于呼吸、钙化和粘液生产(
20.- - - - - -
22]。考虑到光生理学的共生甲藻、葡萄糖和甘油释放机制的反对解释/目前易位的共生体可以推断:
(
1
)
葡萄糖生产由共生有机体可能受到反馈抑制光合作用[
23),不允许葡萄糖代表一个重要的溢出机制。
(
2
)
另一方面,释放甘油从共生体可能代表一个更重要的溢出机制,甘油以来建议有一个光保护功能为多余的碳汇和还原能力
24,
25]。
在模型中海葵
Exaiptasia pallida,Burriesci和合作者
13)指定,葡萄糖是主要内进行光合作用的产物在这种共生关系。然而,潜在的机制,调节葡萄糖的易位暴露以上建议需要进一步的实验证据。这一目的,我们研究了甘油,葡萄糖代谢共生动物及其应对共生体的损失。
2。材料和方法
2.1。生物和实验条件
我们最近与热带海葵共生合作,重命名
Exaiptasia pallida (Aiptasia)(
26]。自由成长海葵从水族馆水系统收集和确认根据Grajales和罗德里格斯(
26]。海葵有0.5厘米踏板盘维持3个月4 L水族馆冒泡空气供给。海水温度保持在室温下(27°C±1°C);动物喂养和刚孵化的每周两次
卤虫sp.无节幼虫
,后全部更换新鲜的海水。光提供荧光灯提供250(高亮度)或50
μ摩尔光子米−2年代−1(低光)12小时光/暗周期。漂白海葵被暴露动物获得两次4°C 4 h在黑暗中,在连续几天
27,
28),每日水置换。这种治疗之后,海葵回到水族缸在黑暗中一周收集和处理之前,美联储如上所述。
2.2。动物匀浆和量化的代谢物
收集动物PBS缓冲简要清洗,涂抹到滤纸(3毫米)和加权。粗蛋白提取被均质化准备动物组织(2 - 3海葵足够的材料),Glass-Potter均质器在一个卷(相对于组织质量)的提取缓冲
(
50 mM KH2阿宝4;0.01毫米EDTA pH值7.8
]
蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(美国完成,σ)在冰上,直到完全崩溃(小于2分钟)。每个样品分别处理。匀浆离心机在4°C在10000×g为15分钟;0.1毫升整除被布拉德福德蛋白质决定,测量与商业染料测定(美国σ)根据制造商,采用BSA作为标准。颗粒状藻细胞被固定Lugol共生有机体密度测定。总甘油和总葡萄糖决定,3整除(200
μL)从每个匀浆煮10分钟,离心机15分钟,和上层清液冻结在−70°C到处理。我们使用自由甘油试剂和去葡萄糖测定工具包(美国从σ)根据制造商的协议。与SmartSpec分光光度计读数得到相比(BioRad)和各自的标准。值归一化湿质量。
甘油3-phospate (G3P)和葡萄糖6-phosphate (G6P)根据协议Bergmeyer中描述和量化
βl (
29日]。简单,1 g的动物湿质量是用研钵和研杵在液态氮。由此产生的粉末被转移到15毫升猎鹰管,包含5毫升的0.6米高氯酸和3000×g离心10分钟。上层清液转移到一个干净的管,小球是reextracted 1毫升的0.6米高氯酸稀释1:2 nanopure水和离心机。上层清液池,5米的pH值调整到3.5 K2有限公司3(试纸)和水添加到最后一卷8毫升。提取被允许坐在冰15分钟和上层清液被转移到一个干净的管。G3P由肼反应试验(189毫米)/甘氨酸(470毫米)/ EDTA(2.7毫米)缓冲pH值9.5,2.3毫米NAD和100
μL的样品(
29日]。吸光度读数NAD(339海里)被直到常数
(
一个
1
)
;然后20
μ
1 kU L L−1解决GPDH添加,5分钟后第二次读数
(
一个
2
)
。G6P由200毫米的反应测定茶缓冲pH值7.6,20
μ5毫米MgCl2 M辅酶ii, 100
μL的样品(
29日]。阅读在339纳米
(
一个
1
)
每隔3分钟,直至稳定。然后,5
μ
L (35 kU L−1暂停G6PDH添加;反应可以进行第二组数据
(
一个
2
)
经过10分钟。吸光度是用于计算的差异代谢物浓度归一化湿质量和调整稀释因素介绍了样品的提取和中和期间(
29日]。
2.3。共生者密度
沉淀细胞从制备蛋白质和代谢物的提取获得固定Lugol解决方案(σ)为20%。共生者密度蛋白质量标准化是由直接计数四整除NewBauer血细胞计数器。稀释在需要的时候进行,调整相应的细胞数量。
2.4。酶化验
3 -磷酸甘油脱氢酶(GPDH)化验修改程序后(
24]。动物匀浆准备代谢物的决心,但在tr缓冲区(10毫米茶,1毫米EDTA, 1毫米德勤,和pH值7.5)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国σ完成)。原油提取被离心澄清在10000 g×15分钟在4°C。上层清液用于蛋白测定和酶化验,在这种情况下,挂钩(3500 MW)添加到最终稳定酶的浓度为15%。一些样品与微孔集中在分析离心离心过滤器(kDa MW截止30日)在4°C。具体活动是用2包含160毫升化验
μ二羟丙酮磷酸M NADH和1毫米。对于每一个样本,一式三份化验是由添加25或50
μL动物提取和随访5分钟。吸光度下降的速率NADH(339海里)测量在一个生物光谱计(美国埃普多夫)对空气用来计算的具体活动报告为单位(
μ摩尔的底物转化为分钟−1)g−1蛋白质的质量。
的决心G6P脱氢酶(G6PDH)酶活性,我们跟着Bergmeyer描述的协议和草地
βl (
30.]。简单,反应分析包含50毫米三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值7.5,380
μM辅酶ii, 6.3毫米MgCl23.3毫米G6P 5毫米马来酰亚胺。反应开始通过增加20
μL阐明动物提取物,阅读在339 nm nanopure水。后的反应是线性的,在测量1分钟间隔为5分钟。酶特定的活动是每克蛋白质质量报告为单位,一个单位被吸光度的增加对应于1的转换
μ每分钟摩尔的衬底。
2.5。西方墨点法
检测的甘油激酶(门将)和葡糖激酶(GCK),类似的总蛋白浓度的sds - page系统解决的丙烯酰胺浓度12%。解析后的蛋白质被转移到硝化纤维膜和孵化与商业具体提出反对人类抗原的抗体在鼠标(GK (h - 132), sc - 366975和GCK (h - 88), sc - 7908;圣克鲁斯生物技术,美国)。我们检查兼容性的抗体抗原决定基酶的氨基酸序列的几类动物。抗体都是使用1:500年,发现anti-mouse二级抗体与碱性磷酸酶(σ)。蓝底物的结合抗体开发套件(美国σBCIP /电视台)。
2.6。统计分析
所有的实验有三个生物独立复制,至少有两个技术复制。数据意味着±标准差。比较的代谢物,与方差分析结果进行了比较分析,后跟一个事后图基HSD测试集
p
=
0.0
1
的意义。特定的酶的活性比较学生之间的共生和漂白的动物
t
以及。
3所示。结果
我们获得了平均92%的还原漂白海葵的共生体。研究的结果发表在表
1。在共生海葵总甘油含量检测光政权(高、低)类似的浓度,而共生海葵G3P水平显著高于低光(图
1)。相比之下,漂白海葵显示总甘油的浓度显著升高,但其磷酸化形式类似于海葵在低光(图
1)。总葡萄糖的浓度高出10倍,甘油在共生海葵光政权和显著降低漂白动物(图
2)。G6P水平非常低(图在所有条件
2)。
前后共生者密度海葵漂白。值的总数细胞每毫克的蛋白质质量,孤立的从3个人为每个生物复制。对于每一个样本,四个技术复制数。
| 海葵 |
与共生体 |
漂白 |
| (1) |
5.31×106 |
4.37×105 |
| (2) |
5.80×106 |
3.14×105 |
| (3) |
3.71×106 |
4.34×105 |
|
| 的意思是 |
4.94×106 |
3.95×105 |
| SD |
1.09×106 |
0.70×105 |
甘油含量以共生和漂白海葵。动物处于共生状态维持在两种光照条件(HL = 250
μ摩尔光子厘米−2年代−1;你= 50
μ摩尔光子厘米−2年代−1)。漂白动物保持在黑暗中。列代表三个独立决定的平均值±SD(酒吧)。的值在
μg g−1湿质量。小写字母组治疗,为每个代谢物相似(图基HSD,
p
<
0.01
)。=共生海葵;A-Bl =漂白海葵。
![]()
血糖水平以共生和漂白海葵。动物处于共生状态维持在两种光照条件(HL = 250
μ摩尔光子厘米−2年代−1;你= 50
μ摩尔光子厘米−2年代−1)。漂白动物保持在黑暗中。列代表三个独立决定的平均值±SD(酒吧)。的值在
μg g−1湿质量。小写字母组治疗,为每个代谢物相似(图基HSD,
p
<
0.01
)。=共生海葵;A-Bl =漂白海葵。
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GPDH的具体活动,G6PDH以提取从共生动物保持在低光和漂白的动物。结果显示明显降低漂白GPDH酶活动的动物与动物在共生状态(表中
2)。另一方面,结果显示增加了约30%的具体活动G6PDH酶在漂白动物(表
2)。
3 -磷酸甘油脱氢酶(GPDH)和葡萄糖6-phosphate脱氢酶(G6PD)特定的活动在海葵共生状态而漂白海葵。值是三个独立的方式决定±SD。具体的活动单位(
μ摩尔底物转化为最小值−1每克蛋白质质量。对于每一个样本,我们执行了三个化验(技术复制)和平均。
| 酶 |
酶的特定活动 |
t
——学生 |
| 共生 |
漂白 |
p
|
| GPDH |
49.78
±
6.62
|
0.20±0.08 |
12.95 |
| 0.0001 |
| G6PDH |
0.65±0.28 |
0.85±0.10 |
3.11 |
| 0.036 |
葡糖激酶的检测结果,特别是葡萄糖磷酸化,没有结论性的。甘油激酶没有在动物中发现,共生或漂白,但只有在
Symbiodinium提取,检测多肽的表观分子量55 kDa(数据没有显示)。
4所示。讨论
4.1。漂白后代谢产物和酶活性的变化
尽管证据为甘油和葡萄糖转移cnidarian——代谢物
Symbiodinium共生,可能还不够,我们的研究结果表明,葡萄糖水平高出近50倍与共生体与漂白海葵海葵。相比之下,甘油含量增加约三次漂白海葵表明脂类物质的分解代谢,已经记录了发生由于营养赤字(
31日,
32]。我们测量的值为磷酸化甘油(G3P)同意这个解释,因为这代谢物不积累,当脂质被合成。然而,有趣的是,在弱光下,G3P水平更高,更类似于漂白动物共生动物高亮度下,这表明在低光海葵从共生体获得更少的碳。这种可能性并没有反映在血糖水平,或许是由于二次合成。相应地,酶在漂白GPDH海葵的具体活动显著低于海葵共生的状态。似乎脂质退化是补偿的大规模减少漂白海葵的葡萄糖。加勒特et al。
33)进行血脂水平
大肠pallida共生和aposymbiotic。在他们的发现,他们发现了非极性脂质,如三(标签)和甘油二酯(无进取心的人),更有丰富的海葵共生状态。至于我们的实验中,脂质降解可能解释aposymbiotic海葵的甘油含量的增加。此外,加仑日的具体活动在漂白海葵太低,强烈表明几乎没有脂质合成发生在这种情况下。GPDH催化G3P的可逆转换二羟丙酮磷酸(DHAP)作为主要的糖酵解过程之间的联系,糖质新生和脂质代谢。低水平的活动GPDH直接碳通量的糖酵解,通过脂质分解代谢。这个评估是否切合我们获得的结果为磷酸化形式和葡萄糖和甘油在漂白海葵的水平。
与海葵共生体,漂白海葵有显著提高的具体G6PDH活性,表明漂白补偿工作的动物来缓解赤字脂肪酸由于脂肪的分解代谢。G6PDH是第一步在再生NADPH的磷酸戊糖途径合成代谢,以及磷酸戊糖像ribose-5核苷酸的合成前体。当增加,酶参与氧化磷酸戊糖途径的水平(例如,G6PDH和6 p葡萄糖酸脱氢酶),而不是导致碳骨架的积累细胞增长,再生NADPH,减少脂肪酸生物合成所必需的(
34]。
4.2。光和喂养的影响
我们的结果显示出了相似的甘油和葡萄糖水平处于共生状态下两种光的水平,这可能暗示,我们使用的光线水平没有定性也不同。同时,我们保持温和的动物喂食,但是我们明确区分的影响显著减少的共生体(漂白)我们测量的代谢物。Tremblay et al。
35)表明,丰衣足食的珊瑚
Stylophora pistillata,辐照度水平确定转移碳的量,观察高易位在高亮度,以及更高的固定的共生有机体,导致主机生物量增加,同时,在低光,他们测量了易位但更高的主机和共生有机体生物质能。得不到支持的殖民地,辐照度水平并未显示差异易位或利用的碳。因为我们没有测量池的差异甘油和葡萄糖之间的高和低光治疗与共生体海葵,我们可以得出这样的结论:海葵没有丰衣足食的。最后,如果甘油或葡萄糖从共生有机体转移到主机上,我们会发现葡糖激酶和/或甘油激酶在共生动物。因为我们的结果是消极的,我们假设
(
1
)
这些酶可能是低但足够的水平足以使磷酸化这些代谢物,在假定的动物细胞吸收,或
(
2
)
适合抗体可以检测这些酶明显。我们没有分析己糖激酶对葡萄糖因为这不是一个特定的酶,但这种酶可能是更重要的在葡萄糖磷酸化可能发生易位。
4.3。在<斜体> Symbiont-Dependent新陈代谢Exaiptasia < /斜体>
我们的研究结果有力地表明,共生的新陈代谢
大肠pallida取决于新鲜的葡萄糖,同意发表的观察,发现13C-labeled葡萄糖在动物组织暴露为2分钟13C-bicarbonate [
13]。相比之下,热诱导漂白似乎有轻微影响葡萄糖代谢海葵,已被证明的Hillyer说道et al。
36]。
脂肪酸和脂质代表主要的碳和能量存储在宿主动物;伙伴之间的转移有机碳影响这些商店在共生
33,
37,
38]。Autotrophically衍生碳
Exaiptasiasp.最好存储在脂质可能很快被主机(
39]。Hillyer说道,合作者
40)测量损失的多个欧米后这些海葵的热应力。当面对共生体的减少发生在漂白过程中,宿主动物新陈代谢转向脂质分解代谢的商店提供必要的能源(
41- - - - - -
43]。我们能够区分代谢物的变化与我们的实验装置
(
1
)
减少葡萄糖池;
(
2
)
甘油和G3P池的增加,
(
3
)
G3PDH特定活动逐渐减弱,甘油的合成有关
(
4
)
增加的具体活动G6PDH酶。
甘油转移的可能性和用于合成葡萄糖的共生关系不能排除我们的实验方法。在这样的实例,甘油需要磷酸化(甘油激酶,我们不能发现在共生或漂白海葵)和氧化DHAP,能用1,6酮糖(醛缩酶的可逆的行动),需要2分子ATP,因此是一个能源消耗的途径。四个关键酶调节人体糖质新生:丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸carboxykinase,果糖1 6 bisphosphatase,葡萄糖6-phosphatase。前两个是涉及当碳水化合物产生氨基酸;后两个是参与糖质新生的最后步骤。它可能似乎期望葡萄糖产生的二次合成在漂白或饥饿(从脂肪或蛋白质分解代谢),但是能源消耗替代途径的合成在共生动物很难支持。此外,Burriesci和合作者
13)无法检测标记葡萄糖的变化评估光孵化后的样本海葵1-thioglycerol糖质新生抑制剂的存在。
最后,乙醛酸循环中的两个关键酶已确定在海葵的转录组,但只有异柠檬酸裂解酶显示,共生动物而不是aposymbiotic超表达的(
44]。通过这个途径,四元产生琥珀酸乙酰辅酶a,可以进入糖质新生,因此另一个路径从甘油的合成葡萄糖。然而,在这里,甘油会磷酸化,氧化DHAP,送入糖酵解产生乙酰辅酶a。这个替代葡萄糖的合成可能是活跃在共生动物在特定情况下。
5。结论
亏损共生体海葵的影响显然是观察葡萄糖的含量显著降低。我们的研究结果的一致性与文献[
13,
36,
45葡萄糖)强烈支持的假设是一个主要的化学形式的易位减少碳的共生关系
大肠pallida。葡萄糖从甘油合成的可能性似乎不太可能,作为能源消耗的道路。然而,我们仍然需要解释为什么葡萄糖被释放从共生体,鉴于其监管对光合作用的影响(
46),不期待葡萄糖碳溢出机制。相反,高氮条件可能覆盖反馈葡萄糖对光合作用的影响,但这种情况仍然是有争议的
Symbiodinium-cnidarian共生,在贫瘠的水域(
16,
47- - - - - -
49]。