清除剂受体B类成员1体外培养的肝细胞对转thyretin的独立摄取受高密度脂蛋白的调控

摘要

甲状腺激素(甲状腺素，T4)对所有细胞类型的正常功能都是必不可少的，并在血清中携带，与包括转thyretin在内的几种蛋白质结合。最近，有证据表明激素进入细胞的替代途径依赖于激素结合蛋白。Transthyretin和Transthyretin结合T4被胎盘滋养细胞通过高密度脂蛋白受体，清除剂受体B型1 (SR-B1)内吞。高密度脂蛋白(HDL)影响SR-B1在滋养细胞中的表达和功能。肝细胞中SR-B1也表达，我们试图确定肝细胞SR-B1是否参与转thyretin或转thyretin- t4摄取，以及摄取是否受HDL影响。肝细胞摄取转thyretin和转thyretin- t4不依赖于SR-B1。HDL处理降低了SR-B1的表达。然而，用高密度脂蛋白预处理肝细胞增加了转thyretin- t4的摄取。siRNA敲低SR-B1表达也增加了转thyretin- t4摄取。在摄取高密度脂蛋白的同时，摄取转thyretin和转thyretin- t4的实验均受阻。 Hepatocyte uptake of transthyretin-T4 uptake is influenced by, but is not dependent on, SR-B1 expression. HDL also decreases transthyretin-T4 uptake and therefore diet or drugs may interfere with this process. This suggests that multiple lipoprotein receptors may be involved in the regulation of uptake of transthyretin-T4 in a cell-type specific manner. Further study is required to understand this important process.

1.介绍

甲状腺激素进入细胞是正常生理的关键。已知游离甲状腺激素通过特定的细胞表面运输蛋白进入细胞，包括单羧酸转运蛋白8和10，以及有机阴离子运输多肽[1]。多年来，这种摄取未结合的甲状腺激素被认为是唯一的相关机制，支持了游离激素假说[2]。

甲状腺激素结合蛋白转thyretin (TTR)也由许多不同类型的细胞产生和内吞[3-五]。肝脏是血清TTR产生和分泌的主要部位，也是其分解代谢的主要部位[6]。TTR是主要的蛋白质在人脑脊液（总蛋白的25％）发现，被合成和脉络丛上皮细胞[分泌到CSF7]。然后TTR被Megalin (LRP2)内吞[4]，脑星形胶质细胞中低密度脂蛋白(LDL)受体家族的内吞多配体受体[8，9以甲状腺素(T4)形式存在的甲状腺激素增加。脉络膜丛TTR合成是T4在脑周围分布的重要因素[10]。肾的TTR摄取也通过肾近端小管上皮细胞表达的Megalin介导。肝脏摄取TTR也被认为是原因之一通过脂蛋白受体五];然而，这种特殊的受体尚未被鉴定出来。TTR是甲状腺激素的载体;它通过与视黄醇结合蛋白的结合来转运视黄醇;它结合许多远端和外源生物(特别是内分泌干扰化学物质);它参与星形细胞糖酵解的调节[11];TTR突变可导致遗传性淀粉样变[12]。

TTR也是由人胎盘合成的[13和滋养细胞内吞作用[3]由于T4的存在而增强[3]。受体介导的胎盘滋养细胞中与甲状腺素(TTR-T4)结合的转thyretin的摄取依赖于清清剂受体B型1 (SR-B1)的表达，SR-B1也是一种高密度脂蛋白(HDL)受体[14]。用高密度脂蛋白预处理细胞4小时，滋养细胞对TTR- t4的摄取增加，而高密度脂蛋白也通过SR-B1与TTR竞争摄取[14]。

鉴于T4对肝细胞功能的重要性，肝脏在TTR和T4代谢中的重要性，以及SR-B1在肝细胞中的强表达[15，我们试图确定SR-B1和/或HDL在调节肝细胞TTR和TTR- t4摄取中是否重要。

2.方法

2.1。试剂

转thyretin(人血清前白蛋白)以冻干粉的形式从澳大利亚维多利亚的Sigma Aldrich公司购买。人类血浆中的高密度脂蛋白(HDL)作为溶液从澳大利亚维多利亚的Sigma Aldrich公司购买。除非另有说明，试剂来自澳大利亚维多利亚的Sigma Aldrich公司。

2.2。细胞培养

人肝细胞HepG2 (HB-8065)从美国型培养标本(ATCC) (VA, USA)中获得，并在95%空气和5% CO的加湿气氛中保存在杜尔贝科的改良Eagle’s培养基(DMEM)(西格玛，NSW, Australia) /10%胎牛血清中₂。

2.3。使用Mission esiRNA敲低SR-B1的表达

使用MISSION esiRNA (Sigma)结合Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher)实现SR-B1的沉默，按照制造商的说明和之前的描述[14]。Kif11a esiRNA为阳性转染对照，EGFP esiRNA为模拟对照。细胞培养于24孔板(50000个/孔)中，培养过夜。24小时后，用无抗生素培养基代替培养基。随后,1.2μOpti-MEM中的M MISSION esiRNA和Opti-MEM中的0.04% (V/V) Lipofectamine RNAiMAX共孵育24小时后加入细胞。24小时后重复上述转染过程。细胞在最终转染24小时后用于实验。

2.4。Alexa-TTR标签

使用Alexa Fluor®568蛋白标签试剂盒(Life Technologies, VIC, Australia)对纯化的本地人类TTR蛋白进行标记。简单地说，1ml 2 mg/ml纯化TTR蛋白与Alexa Fluor®568活性染料在室温下孵育2小时。利用生物凝胶P-6柱(BioRad, CA, USA)纯化Alexa Fluor 568 labelled-TTR (Alexa- ttr)。为了确定标记TTR的浓度和荧光标记的程度，在280 nm和540 nm的NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific, NC, USA)中测量共轭溶液。

2.5。定量测定Alexa568-TTR摄取

HepG2细胞(约50,000个细胞/孔)在24孔板上培养48-72小时。血清饥饿4小时后，细胞用1uM Alexa568-TTR±10孵育μmt4如先前公布[3使用IncuCyte ZOOM™活细胞成像系统(Essen BioScience, MI, USA)进行相位和红色通道成像，每隔2-3小时扫描一次，扫描时间最长为48小时。使用IncuCyte ZOOM软件对每井9张不重叠图像中的红色物体进行量化(9个值的平均值等于n=1)。数据以每幅图像中红色物体的平均数量相对于融合百分数来表示。

2.6。西方墨点法

二十μg的总细胞裂解液在NuPAGE Novex Bis-Tris梯度凝胶(Invitrogen)上运行。蛋白转移到硝酸纤维素中，使用下列Sigma抗体检测:兔抗sr - b1、1:50 50和小鼠抗β肌动蛋白，1：2000。印迹使用的SuperSignal西仔试剂盒（Pierce，斯考，VIC，澳大利亚）开发和成像使用LAS-4000（富士胶片，​​Brookvale的，新南威尔士，澳大利亚）。使用ImageJ软件（NIH）印迹进行定量。

2.7。统计分析

使用Microsoft Excel或GraphPad Prism软件(GraphPad Software, Inc.， CA, USA)进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析(Tukey’s test)或配对学生t检验(paired Student’s t test)。P值≤0.05为显著性。

3.结果

3.1。HDL处理对HepG2细胞SR-B1水平的影响

SR-B1是HDL受体和温育与HDL在滋养层[增加SR-B1水平14]。血清HDL的正常参考范围为400 - 600 ug/ml，而HDL值低于400 ug/ml的个体患心脏病的风险较高。我们测试了高密度脂蛋白(0-500 ug/ml)是否影响肝细胞的SR-B1水平。在无血清培养基中4小时后，用高密度脂蛋白治疗24小时可显著降低SR-B1水平，但效果不存在剂量依赖性。250 ug/ml HDL降低SR-B1水平至对照组的50%以下(p= 0.001, n=2)， 15 ug/ml HDL降低SR-B1水平至对照组的70%以下(p=0.04, n=4)(图)1)。

3.2。Alexa的-TTR的摄取HDL处理的细胞

高密度脂蛋白降低HepG2细胞中SR-B1的表达，但高密度脂蛋白也通过SR-B1转运，当高密度脂蛋白和TTR在摄取介质中同时存在时，高密度脂蛋白可能通过SR-B1与TTR和TTR±T4的摄取竞争[14]。因此，我们也测试了与HDL共孵育是否通过SR-B1影响HepG2细胞TTR(±T4)摄取。我们先用不含HDL(未处理)或500ug /ml HDL(预处理过的/血清正常水平的HDL)预孵育，再用500ug /ml HDL(正常水平的HDL)或1000ug /ml HDL(血清高水平的HDL)共孵育。

3.2.1之上。用HDL预处理细胞

用500ug /ml HDL在无血清培养基中预处理HepG2细胞4小时(橙色条)，24小时后与对照组(蓝色条)相比，Alexa-TTR的摄取没有显著变化(图)2(一个)和2 (b))。HDL预处理导致24小时alexa - trt - t4摄取增加(441.1±39.5 vs对照组344.5±9.3,n= 4, p <0.05)(图)2(一个)和2 (c))。尽管高密度脂蛋白预处理导致24小时时Alexa-TTR-T4摄取增加，但在500ug/ml高密度脂蛋白预处理4小时后，我们无法证明SR-B1蛋白水平有任何显著变化(数据未显示)。

3.2.2。在Alexa-TTR摄取培养基中添加HDL导致Alexa-TTR和Alexa-TTR- t4摄取减少

24小时后，与500 ug/ml HDL共孵育，未处理(蓝色条，194.5±23.8,n=4, p=0.01)和预处理HDL(橙色条，230.3±11.8,p<0.05)细胞的Alexa-TTR摄取显著低于对照组(313.3±20.8,415.0±54.7,resp)。,n = 4)。1000 ug/ml HDL可显著降低HDL预处理细胞的Alexa-TTR摄取(219.7±1.8,n=4, p<0.05)(图)2)。

24小时后，与500ug /ml或1000ug /ml HDL共孵育，未处理细胞和HDL预处理细胞的Alexa-TTR-T4摄取均显著减少。在未处理细胞中，与对照组(344.5±9.3,n=4)相比，500 ug/ml HDL降低Alexa-TTR-T4摄取至210.1±38.4 (n=4, p= 0.01)， 1000 ug/ml HDL降低至240±12.4 (n=4, p=0.001)。在细胞中，500 ug/ml高密度脂蛋白预反应4小时后洗涤后进行摄取实验，500 ug/ml降低alexa - trt - t4摄取至265.2±9.5 (n=4, p=0.005)， 1000 ug/ml高密度脂蛋白降低至254.4±10.0 (n=4, p<0.005)，与对照组(441.1±39.5,n=4)相比(图)2)。

共同培养与HDL导致TTR的摄取减少（图2 (b)）和TTR-T4（图2 (c))在48小时的实验中保持一致。

3.3。肝细胞中SR-B1的表达及表达下调

SR-B1在HepG2细胞中强表达[16]。使用esiRNA, SR-B1蛋白被持续敲除至29±8% (n=4, p=2.0 x 10)^-7）在HepG2细胞中模拟对照（图3)。

3.4。SR-B1敲低对的Alexa-TTR（T4±）摄取在HepG2细胞的影响

然后我们测试了HepG2细胞中SR-B1敲除对TTR(±T4)摄取的影响。SR-B1基因沉默仅导致TTR-T4在48h时摄取显著增加(约为模拟对照细胞摄取的133%，见图4, n = 4, p < 0.05)。

4.讨论

本研究表明，HepG2细胞吸收了TTR和TTR- t4复合物。当TTR与T4结合时，细胞更易吸收TTR [3，五，8]。T4结合稳定了TTR同四聚体，这种构象更容易被膜受体识别[3]。HepG2细胞与HDL 4小时导致增加的Alexa-TTR-T4的摄取的预处理（虽然检测在蛋白质水平没有变化以下中HDL 4小时）。然而，与HDL和Alexa-TTR（或Alexa-TTR-T4）的结果在这两个的Alexa-TTR和Alexa-TTR-T4的减少摄取的细胞共同培养。这表明，HDL的竞争对手和块TTR和TTR-T4摄取肝细胞。大约1-2％血清中TTR循环结合到脂蛋白[17，而HDL之前已被证明会影响未结合的T4进入成纤维细胞[18]和胎盘滋养层摄取TTR和TTR-T4的[14]。

撞倒SR-B1表达对的Alexa-TTR的摄取没有影响显著，但令人惊讶地增加的Alexa-TTR-T4的摄取。这些结果表明，TTR-T4摄取不依赖于SR-B1的表达，但反比通过SR-B1表达水平的影响。先前的研究还推测，SR-B1可能参与TTR的摄取，并试图以两种CHO细胞系来比较摄取，但无法显示任何摄取的差异，虽然数据没有在出版物中介绍[五]。然而，与我们的研究一致的是，该研究确实证明高密度脂蛋白能够减少大鼠肝癌细胞中TTR的摄取[五]。苏萨et al。也表明脂蛋白抑制了TTR的内在化;然而，他们也证明摄入并非脂蛋白依赖或ttr -脂蛋白复合物所致[五]。我们目前的研究明确表明，不像滋养细胞[14]，SR-B1是不负责摄取TTR肝细胞中的受体;然而TTR-T4摄取至少通过SR-B1的水平的影响。

除TTR外，血清中还通过甲状腺素结合球蛋白(TBG)和白蛋白携带T4。TTR-T4摄取在胎盘中已有报道[3),星形胶质细胞(9，脉络膜丛[7、视网膜色素上皮细胞[19，20，及肾脏[4，五]。TBG对T4有较强的结合亲和力;然而，对tbg结合的T4的摄取尚未有报道。白蛋白与T4的结合亲和力弱，虽然细胞摄取白蛋白很常见;目前也没有证据表明细胞摄取白蛋白- t4。

巨蛋白是已经通过示出其他组织如肾脏中TTR摄取参与膜受体[4]和星形胶质细胞[9]。Megalin在肝脏中不表达，特别是在HepG2中不表达[21)细胞。除了SR-B1和Megalin，到目前为止还没有发现其他的TTR受体。

参与TTR和TTR- t4摄取的肝细胞脂蛋白受体尚不清楚。这可能是这个过程是如此基本的TTR代谢，摄取机制是多余的，几个脂蛋白转运体能够执行这一重要的作用，使很难确定一个具体的。

TTR摄取机制可能对局部TTR水平(血清TTR总量和局部分泌TTR)的变化特别敏感，这使得它对分泌和内吞TTR的细胞(如胎盘滋养细胞[3，13和肝细胞[五)或与分泌TTR的细胞接近的细胞(如神经元/星形胶质细胞[11]）。

与高密度脂蛋白共孵育会降低TTR和TTR- t4摄取，因此，TTR的代谢(合成、分泌、摄取和降解)可能受到饮食和营养的影响。肝脏对减少的膳食蛋白质摄入非常敏感，并迅速关闭蛋白质合成。由于TTR半衰期很短，只有2-4天[22，血清TTR水平常被用作营养不良的标志，自20世纪70年代以来就出现了[23]。另外，在脂蛋白的血清水平降低应该引起肝细胞TTR的吸收增加，从而增加了细胞内降解。因此，饥饿疗法/营养不良将可能导致降低血清TTR水平由于双方降低TTR合成和增加的TTR摄取和分解代谢。同样地，饮食或与胆固醇代谢干扰药物（如他汀类药物[24)也会影响TTR的周转率。任何循环脂蛋白水平的增加或减少都可能对TTR的摄取和代谢产生影响。

5.结论

本研究结果表明，培养肝细胞对TTR-T4的摄取不依赖于SR-B1的表达，而与SR-B1表达水平呈负相关。由于高密度脂蛋白水平影响肝脏对TTR- t4的摄取，显然，有助于改变血清TTR和脂蛋白水平的药物或饮食的影响，将影响肝细胞TTR(和TTR- t4)的摄取和随后的TTR周转。对肝脏TTR转运机制的进一步研究将为这一重要过程提供更多线索。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

本研究由昆士兰病理学科学教育与研究委员会资助。

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