文摘
树突状细胞(DC)的基础疫苗接种已经成为一种很有前途的抗肿瘤免疫治疗。然而,克服免疫耐受和免疫抑制肿瘤微环境(时差)仍然是一个巨大的挑战。最近的研究表明,玫瑰红(RB)能有效诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡(ICD),呈现整个肿瘤抗原的DC处理和表示。然而,相结合的协同抗肿瘤效应与未成熟dc intralesional RB (RB-iDCs)仍不清楚。在目前的研究中,我们调查了RB-iDCs是否有优越的抗肿瘤作用与单药和评估的免疫学机制RB-iDCs小鼠肺癌模型。结果表明,intralesional RB-iDCs抑制皮下肿瘤生长和肺转移,导致100%的老鼠生存和显著增加TNF -α生产CD8+T细胞。这些影响是密切相关的感应不同的ICD的表达特点,RB大部分肿瘤细胞和肿瘤干细胞(二者),尤其是calreticulin (CRT),从而提高免疫效应细胞(即。,CD4+,CD8+和记忆T细胞)渗透和衰减(即免疫抑制细胞的积累。,巨噬细胞亚群和myeloid-derived抑制细胞(MDSCs))的时间。本研究揭示了RB-iDC疫苗协同能摧毁原发性肿瘤,抑制远处转移,并防止肿瘤复发肺癌小鼠模型,它提供了重要的临床前数据发展的一种新型组合免疫疗法。
1。介绍
肺癌是全世界癌症相关死亡的主要原因,仍然是一个重大挑战1]。在所有肺癌类型,非小细胞肺癌(NSCLC)占大约85%的病例(2]。非小细胞肺癌的治疗、免疫治疗和分子靶向治疗目前显示更有前途的结果比传统疗法,包括化疗和放疗(2,3]。证据表明,分子靶向治疗,如针对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs),实现一个完整的响应在不到5%的患者(4]。免疫抑制剂检查站的客观缓解率(ICI)治疗是大约20%或更低5]。然而,相当比例的患者一个完整的反应不可避免地开发耐药然后肿瘤复发或转移的经验,这通常会导致死亡。因此,目前的治疗仍不能完全战胜癌症的复发和转移,这是肺癌的主要挑战管理(6]。因此,新颖的治疗策略是肺癌患者的迫切需要。
癌症免疫治疗的目的是通过利用宿主的免疫系统攻击肿瘤细胞;值得注意的是,树突状细胞(DC)的基础疫苗已经成为大多数病人(最可行的选择7]。作为最有效的抗原递呈细胞,DCs在抗肿瘤免疫治疗一直被认为是一个关键因素,因为他们可以有效地激活T lymphocyte-mediated抗肿瘤活性通过处理和显示肿瘤CD4抗原+或CD8+T细胞通过主要组织相容性复合体(MHC)二级或一级分子,分别为(8]。在过去的二十年里,位于各种方法已经开发的疫苗。dc与肿瘤相关抗原(taa)脉冲体外或在活的有机体内免疫疗法能引起抗肿瘤免疫力,从而对多种癌症,包括卵巢癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肾细胞癌、黑色素瘤等(9,10]。然而,位于免疫治疗的成功率仍相对较低,由于抗原不足表示单个抗原肽或蛋白质和immune-tolerating肿瘤微环境和免疫抑制的影响(时间)和其他不明原因11,12]。
令人鼓舞的是,最近的研究发现,某些免疫治疗敏如玫瑰红(RB),可以提高抗肿瘤免疫反应,引起免疫原性细胞死亡(ICD) (13]。“吃我”和“危险”信号,如calreticulin (CRT),表达肿瘤细胞表面发生ICD可以使未成熟dc (idc)吞噬肿瘤细胞和现在TAA抗原表位T细胞通过MHC I或II类分子(14,15]。这个过程促进DC的成熟和抒发抗原反应通过激活T细胞(16]。先前的研究已经证实,RB noncytotoxic在活的有机体内和在体外独立,其抗肿瘤效应功能的光刺激与其他敏化相比,比如5-aminolevulinic酸(5-AA) [17和金丝桃素18]。此外,RB已批准临床使用的食品和药物管理局(FDA)在美国。虽然RB拥有承诺黑色素瘤的抗肿瘤效果(19,20.)和肝细胞癌(21),它仍然是一个重大挑战将这些影响到其他固体肿瘤,这被称为“immune-desert肿瘤”或“冷肿瘤。“冷肿瘤的特点是精疲力竭的状态tumour-infiltrating淋巴细胞(尖)时间(22,23]。因此,我们假设RB只杀死了当地的肿瘤细胞,是肿瘤抗原的效率表示和诱导抗肿瘤免疫反应都相对较低的RB单独使用时。
肺癌的治疗数据使用位于免疫治疗或RB仅是有限的。到目前为止,还没有研究肺癌治疗RB,只有两个二期临床试验在NSCLC脉冲使用位于疫苗与重组与黑素瘤相关抗原或生存素肽进行。这两个临床试验证明一个特定疫苗免疫相关性和持续稳定的疾病,尽管有些病人显示疾病进展(10,24]。因此,我们假设,作为一种新型疫苗,intralesional注入RB和idc (RB-iDCs)将是一个更有效的方法对肺癌的治疗。
2。材料和方法
2.1。细胞系
小鼠黑色素瘤B16转椅细胞系的细胞库的购买类型文化的中国科学院和rpmi - 1640年培养基培养(Gibco, 61870044)补充10%胎牛血清(的边后卫)(生物产业,04 - 007 - 1 - a),链霉素(100μg / ml)和青霉素(100 U /毫升)。路易斯肺癌细胞系是善良的有天赋的明姚教授(癌症研究所、上海、中国),并保存在DMEM (Gibco, 10569010)补充10%的边后卫,链霉素(100μg / ml)和青霉素(100 U /毫升)。所有细胞培养在37°C公司5%2。
2.2。抗体和试剂
以下抗体被用于这项研究:FITC anti-CD3e (145 - 2 - c11), PE anti-CD4 (GK1.5) FITC anti-CD4 (GK1.5), PE anti-CD25 (PC61.5) APC anti-Foxp3 (FJK-16s) PerCP-Cy5.5 anti-CD8a (53 - 6.7), PE anti-CD44 (IM7) APC-anti-CD44 (IM7),聚乙烯anti-ABCG2 / CD338八国集团(3)PE-Cy7™anti-CD62L (MEL-14) PE-Cy7™anti-CD86 (GL1),纯化anti-CD16 / CD32 (2.4 g2), APC anti-CD80 (16-10A1), PE anti-CD11c (HL-3) APC-Cy7™anti-CD14 (rmC5-3) PerCP-Cy5.5™anti-I-A / i (M5/114.15.2) FITC anti-CD40 (3/23), APC anti-F4/80 (t45 - 2342), PerCP-Cy5.5™anti-CD11b (M1/70) PE-Cy7™anti-CD206 (MR6F3), PE - anti-Gr-1 (RB6-8C5)、艳紫510™anti-CD8a(53 - 6.7),亮紫421™anti-IFN -γ(XMG1.2)、艳紫421™anti-TNF -α(MP6-XT22) anti-calreticulin (D3E6),和山羊anti-rabbit IgG-FITC(圣克鲁斯生物技术、sc - 2359)。DAPI解决方案(564907)和FITC膜联蛋白V凋亡检测设备(556547)从BD购买生物科学。玫瑰红(330000)和其他化学物质从Sigma-Aldrich购买。
2.3。流式细胞术
流仪分析与贝克曼库尔特Cytomics FC500流式细胞仪系统。级的结果评估和FlowJo v10软件。
2.4。分析细胞周期和细胞死亡
Lewis肺癌细胞(llc)被播种 细胞每在6-well板和加工进行细胞周期分析与提高孵化后浓度的RB (0, 100, 200, 300μ米)24 h。浮动和附加llc对待RB(0、10、20和40μ米)1、2和4 h收集进行进一步分析。
DAPI用于染色坏死细胞DNA和标签。收集细胞,与75%乙醇固定,放置在-20°C一夜之间,然后用冷洗了三次PBS和孵化500μl的DNA染色的解决方案(1μg / ml DAPI)在室温下为5分钟(RT)。DNA流式细胞术分析的内容,和细胞比例sub-G1, G1, G2 / M阶段确定。
FITC膜联蛋白V凋亡检测试剂盒被用来观察细胞死亡。短暂,细胞与生物素化的彩色膜联蛋白V FITC 1×绑定缓冲,然后孵化15分钟在rt,细胞被洗两次PBS和resuspended PBS包含DAPI (0.2μg / ml)为5分钟。细胞死亡概要分析了级软件。被贴上DAPI坏死细胞+和DAPI+/膜联蛋白V+,凋亡细胞被贴上膜联蛋白V+(25]。
2.5。细胞生存能力
idc的可行性、mdc脉冲RB-treated LLC的溶解产物(RB-based mdc)和小鼠脾淋巴细胞治疗1毫米RB是衡量Vi-Cell XR(贝克曼库尔特公司、沥青、钙、美国)。短暂、mdc和小鼠脾淋巴细胞孵化没有或1毫米RB,分别。细胞数量和生存能力被Vi-Cell XR发现24小时。试验进行了一式三份,重复三次。
2.6。检测的CRT在肿瘤细胞表面表达
肿瘤细胞表面上的CRT表达式被免疫荧光染色鉴定。LLC和B16转椅细胞治疗10μ米和100μ米的RB 24 h。细胞与4%多聚甲醛固定为5分钟。非特异性结合被5%正常山羊血清2 h RT。anti-CRT抗体的细胞培养(1:100)在一夜之间在4°C。洗涤三次后5分钟Tween-20 / PBS RT为0.2%,细胞被孵化的FITC-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体稀释在PBS (1: 200) RT 45分钟。LLC和B16转椅细胞染色anti-rabbit IgG抗体被包括,视为同形像控制。然后,这些细胞被洗了三次有0.2% Tween-20 / PBS RT每次5分钟。最后,DAPI染色细胞核。所有染色细胞观察和拍摄徕卡SP5共焦荧光显微镜。图像分析与徕卡SP5共焦荧光显微镜放大1000倍。
CRT的表达在肿瘤细胞表面被流仪量化分析。有限责任公司与10治疗30分钟μ米和100μRB的M。细胞与胰蛋白酶收获,在寒冷的PBS洗两次,然后用一只兔子孵化anti-CRT抗体在4°C(1: 200) 30分钟后跟FITC-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体(1:200)在4°C 30分钟。在寒冷的PBS洗两次后,这些细胞被resuspended在500年μl流缓冲区(PBS的边后卫为2%)。相同浓度的正常兔免疫球蛋白是利用同形像控制。CRT-positive细胞的百分比由流仪结果决定。
2.7。球体形成分析
有限责任公司被播种在300细胞/在six-well超低集群板块(康宁,07-200-601)和无血清培养系统在DMEM / F12 7天(Gibco, 11320033)补充20 ng / ml重组鼠表皮生长因子(EGF) (PeproTech, 315 - 09年),10 ng / ml重组鼠碱性纤维母细胞生长因子(bFGF) (PeproTech 450 - 33), 5μg / ml胰岛素(σ),0.4%的牛血清白蛋白(σ)。
2.8。实时定量聚合酶链反应
llc形成球体在7天。然后,我们收集了刘易斯癌症干细胞(二者)和评价干细胞标记物的表达在mRNA水平。总RNA从刘易斯二者孤立和llc试剂盒(互补脱氧核糖核酸合成、表达载体,15596018)。ABCG2表达Oct-4, CD44被实时定量PCR检测。鼠标β肌动蛋白是作为内部控制。根据协议执行PCR SYBR绿色(豆类、日本)。引物序列如下:Oct-4:向前,5 - - - - - -GGAAAGGTGTTCAGCCAGAC-3 ,相反,5 - - - - - -CTCATTGTTGTCGGCTTCCT-3 ;ABCG2:向前,5 - - - - - -TGGTTTGGACTCAAGCACAG-3 ,相反,5 - - - - - -ATACCGAGGCTGATGAATGG-3 ;和CD44:向前,5 - - - - - -TCAAGTGCGAACCAGGACAG-3 ,相反,5 - - - - - -GATGCAGACGGCAAGAATCA-3 。信使rna表达的相对量化计算了2- - - - - -ΔΔCt算法。
2.9。CRT二者表面检测
有限责任公司被培养成球体了7天,然后,球被StemPro分离Accutase®细胞分离试剂(Gibco A1110501)到单个细胞悬液。然后,二者治疗10 - 100μM RB 30分钟。胰蛋白酶的细胞被收获,在寒冷的PBS洗两次,然后用一只兔子孵化anti-CRT抗体(1:200),anti-CD44-APC抗体和anti-ABCG2 / CD338-PE抗体在4°C 30分钟后跟FITC-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体(1:200)在4°C 30分钟。在寒冷的PBS洗两次后,这些细胞被resuspended在500年μl流缓冲区(PBS的边后卫为2%)。相同浓度的正常兔免疫球蛋白是利用同形像控制。CD44 CRT-positive细胞的百分比+ABCG2+细胞群是由流仪分析。
2.10。代小鼠骨骨髓来源DC DC成熟的分析,免疫小鼠
DCs在诱导小鼠骨髓(Bm)细胞根据出版协议(26]。短暂,DCs从C57BL / 6小鼠Bm祖细胞生成如下:Bm提取股骨和胫骨的8-week-old C57BL / 6小鼠。淋巴细胞的分离进行了使用Histopaque®-1077 (Sigma-Aldrich)。单一的Bm细胞悬浊液准备,在寒冷的PBS细胞被洗两次。然后,细胞被维护在rpmi - 1640中补充10%的边后卫,ng / ml重组小鼠白介素- 10 (IL -) 4 (PeproTech, 214 - 14),和20 ng / ml重组小鼠集落刺激因子(gm - csf) (PeproTech 315 - 03)。第二天,不依从细胞被丢弃,文化与新鲜ref rpmi - 1640中包含细胞因子。4天6天,新鲜rpmi - 1640中包含细胞因子代替文化上层清液的一半。7天,LLC的idc收获和脉冲处理1毫米RB的比率1:10 (LLC): idc) 69 h。同时,一些idc和100 ng / ml刺激大肠coli-derived有限合伙人(Sigma-Aldrich L4516) 24 h,而这些idc被认为是一个积极的控制DC成熟。此外,iDC分别刺激1毫米RB 24 h或培养RB-based mdc的比率1:1 69 h来验证是否RB mDCs影响iDC成熟。 All cells were incubated with anti-CD16/CD32 at 4°C for 10 min and then detached, washed twice in cold PBS, and stained with the following antibodies: PE-Cy7™ anti-CD86, APC anti-CD80, PE anti-CD11c, APC-Cy7™ anti-CD14, PerCP-Cy5.5™ anti-mouse I-A/I-E, and FITC anti-CD40 antibodies. A fluorescence-minus-one (FMO) control was used as the negative control, which was stained with all the antibodies except the antibody that bound to the antigen of interest. The data were analysed by flow cytometry.
2.11。特区内吞作用分析
评估了负载抗原的树状突细胞的内吞作用与FITC-dextran (FD40S,平均分子量:40000)。总共 idc的细胞或mdc被播种在six-well盘子RPMI 1640含10%的边后卫。在添加FITC-dextran之后(1毫克/毫升)的细胞被孵化2 h在37°C或4°C(负控制)。然后,这些细胞被洗冷PBS和2%多聚甲醛固定的三倍。之后,BMDCs占用的百分比FITC-dextran由流仪结果决定。试验进行了一式三份,重复三次。
2.12。在体外细胞毒性试验
我们使用CytoTox 96®非放射性细胞毒性试验(Promega G1780)评估脾淋巴细胞的细胞毒性根据制造商的协议。从每个老鼠脾脏的实验。脾淋巴细胞刺激与RB-treated LLC 5天作为效应细胞。有限责任公司,二者被用作目标细胞,分别。简单地说,共有 有限责任公司在96好圆底板培养。效应脾淋巴细胞分布在一式三份,靶细胞的效应细胞涨跌互现(llc)和二者)在E: 25 T比率:1、12:1,6:1,,3:1在100年最后一卷μl。所有的效应和目标细胞都孵化96年在37°C 6 h,圆底板块离心机。测定的最大释放,10μl 10 x裂解缓冲是添加到积极控制井和孵化前45分钟在37°C离心法一步。然后,50μl上层清液小心地转移到一个新的96 -圆底板,和50μl底物被添加到每个混合,和孵化在黑暗中在RT为30分钟。最后,50μl停止解决方案添加到每个。板是在490 nm,具体的比例溶解,发生在每个计算由以下方程: 。
2.13。在体外细胞因子生成
抗原CD8产生的细胞因子+T细胞在体外使用下面的协议进行评估。从每个老鼠脾脏的实验。切碎后脾脏,单个细胞悬液由密度梯度离心法分离。然后,脾淋巴细胞( )在PBS控制、RB RB-based mDC疫苗,和RB-iDC疫苗治疗组与RB -(100孵化μM -)有限责任公司。2 h后引发刺激,3μg / ml莫能菌素和2μM brefeldin(来自eBioscience)被用于4 h,然后,所有样本resuspended 50μl鸡尾酒稀释的抗体细胞表面标记和孵化为30分钟在4°C。染色细胞内TNF -α和干扰素-γ通过添加100,这些细胞被固定μl固定缓冲区(eBioscience)细胞悬浮在100年μ在4°C l染色缓冲区和孵化了30分钟。洗后两次1×透化作用缓冲区,细胞在胞内抗体稀释resuspended鸡尾酒,在4°C的环境为30分钟,然后洗两次1×透化作用缓冲。流式细胞仪的数据被收集和分析。
2.14。在活的有机体内肿瘤治疗的研究
动物实验进行了复旦大学实验动物中心(上海,中国)。所有实验协议涉及动物被批准的机构复旦大学动物保健和使用委员会,号码是20171143 a083和协议。雄性C57BL / 6小鼠(年龄在6 - 8周)从上海购买Lingchang生物技术有限公司有限公司
Intralesional注射PBS, RB, RB-based mDC疫苗和RB-iDC疫苗进行如下。总共 有限责任公司是皮下注射接种的右翼C57BL / 6小鼠(每组5 - 6)。RB intralesional注入前/ DCs,我们选择小鼠肿瘤。当肿瘤直径4 - 5毫米(0),1毫米RB(溶解在PBS)是由intralesional注入,注入体积等于一半的体积肿瘤(0.5毫升/厘米3)。对于免疫的动物,idc或成熟dc脉冲RB-treated LLC溶解产物水洗三次在寒冷的PBS和resuspended PBS的最终浓度 细胞/毫升。直流悬挂(100μl)皮下注射同系的C57BL / 6小鼠。PBS注入用作控制。RB-iDC疫苗策略涉及初加工与intralesional RB肿瘤10分钟,然后执行intralesional注入 国际数据公司(idc)。测量肿瘤大小与数字卡钳和近似乘以测量维度。肿瘤大小调查肿瘤出现后的每一天,和老鼠牺牲他们的肿瘤直径超过10 - 15毫米。基于数字卡尺的测量肿瘤体积的计算是通过以下方程: 。
2.15。制备单一细胞悬浊液
从肿瘤获得单一细胞悬浮液和脾脏通过机械分离和酶消化,分别。简单地说,以肿瘤为例,它被无菌和碎到1 - 2毫米3其次是洗涤rpmi - 1640中。肿瘤离解常数摇晃在PBS进行含有1毫克/毫升胶原酶D(罗氏)和30μg / ml DNase我(罗氏)20分钟在rt,然后透过70细胞悬液μ米尼龙过滤器网删除任何未消化的组织碎片,和淋巴细胞被密度梯度离心法分离。淋巴细胞与rpmi - 1640中清洗两次。细胞数量计算,和细胞生存能力是用台盼蓝染料排斥试验确定。同样,淋巴结被柱塞机械分离和过滤70μm细胞的过滤器。然后,从肿瘤细胞、脾脏和淋巴结染色有以下确定抗体免疫抑制细胞的比例(调节性T细胞亚群)、巨噬细胞和myeloid-derived抑制细胞(MDSCs))和免疫效应细胞(T效应记忆细胞(显微镜),中央记忆细胞(中药),T记忆干细胞(Tscms),幼稚T细胞(Tns), CD4细胞+T细胞、CD8+):T细胞亚群被确定为cd4阳性/ CD25-positive / Foxp3-positive;M1巨噬细胞被确定为F4/80-positive / CD11b-positive / CD11c-positive,和M2巨噬细胞被当成F4/80-positive / CD11b-positive / CD206-positive;MDSCs被确定为CD11b-positive / Gr-1-positive;中药被确定为cd8 + / cd44阳性的/ CD62L-positive,显微镜被确定为cd8 + / cd44阳性的/ CD62L-negative,和Tscm + Tn细胞被确定为cd8 + / CD44-negative / CD62L-positive。细胞被洗流缓冲区(PBS的边后卫为2%)和500年resuspendedμl的DNA染色的解决方案(1μ在RT g / ml DAPI) 5分钟。fluorescence-minus-one (FMO)控制作为消极的控制,这是沾以外的所有抗体的抗原抗体结合的兴趣。上述不同的免疫细胞的百分比被流式细胞术分析。
2.16。检查肺转移
肺转移是检查使用先前描述的方法(27]。短暂治疗后,PBS, RB, RB-based mDC疫苗,或RB-iDC疫苗,老鼠牺牲21天,注入印度墨水(15%)通过染色肺部的气管。然后,肺部被收集并存储在Fekete的解决方案(100毫升70%的酒精,5毫升的冰醋酸,和10毫升的福尔马林)在RT 3天。最后,肺部拍摄。白色结节black-stained肺被认为是肿瘤转移的网站。然后我们计算每个每组小鼠的肺转移率。
2.17。统计分析
所有统计分析使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件Inc .)。学生的 - - - - - -测试和单向方差分析之后,适当的事后测试(图基的多重比较检验)被用来比较单个数据点之间的差异。kaplan meier存活曲线和重复测量方差分析被应用于肿瘤治疗实验。生存曲线之间的差异,用于计算生存率较值。 被认为是一个统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。RB诱导G2 / M期细胞周期阻滞和坏死的肺癌细胞系
RB治疗的效果被流式细胞仪进行细胞周期分布。细胞周期分析,llc是处理0,100,200,300μM RB 24 h。与细胞受到控制治疗相比,在不同的RB曝光剂量,llc表现出减少的年代和G1期细胞的比例,和G2 / M期细胞的比例增加。这些结果表明,RB可能诱发G2 / M期细胞周期阻滞(图1(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
探索细胞死亡的模式,llc治疗与RB的浓度增加。我们发现细胞的数量与sub-G1 DNA内容增加剂量依赖性的方式(图1 (b))。此外,RB促进细胞死亡的细胞凋亡和坏死的剂量和时间的方式,可以在膜联蛋白V的比例显著增加FITC和DAPI (4 ,6-diamidino-2 - - - - - -phenylindole盐酸盐)-double-positive细胞(数字1 (c)- - - - - -1 (e))。
3.2。肿瘤细胞治疗RB暴露在表面Calreticulin (ecto-CRT)
RB可能诱发LLC死亡在体外,细胞死亡的机制是决定快速坏死。然而,诱导细胞死亡是否免疫原性评估。因此,我们下一个调查是否RB治疗诱导ecto-CRT表达癌细胞。
共焦显微镜LLC和B16转椅细胞染色膜surface-exposed CRT证实CRT在质膜(图的确是本地化2(一个))。此外,CRT表达式是量化,RB发现CRT llc表达的诱导剂量依赖性的方式(数字2 (b)和2 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。刘易斯癌症干细胞治疗RB受到Calreticulin在细胞表面(ecto-CRT)
我们确定了CRT刘易斯二者的表达。7天后,细胞球体的大小显著增加,和一个三维球体成立于培养基(图3(一个))。然后我们检查的表达干细胞标记Oct-4, CD44, ABCG2在llc和刘易斯二者,所有这些标记的表达刘易斯二者显示显著差异而llc(图3 (b))。我们发现,30分钟的RB治疗ecto-CRT表达升高刘易斯二者在剂量依赖性的方式(数字3 (c)- - - - - -3 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。iDC的角色RB-Treated llc的成熟
DCs有可能激活免疫反应,并且这种能力取决于他们的成熟状态,反映在刺激分子的表达。idc装满RB-treated llc体外显示增加分子CD86的表达、CD80 MHC II级,CD11c, CD40与未经处理的国际数据公司(idc);然而,CD14表达的是两组低。这些表面分子的表达mDCs刺激RB-treated llc是类似mDCs刺激由脂多糖(LPS)(补充图1)。表达水平,这些分子的平均荧光强度量化(数字4(一)和4 (b))。和RB-based mDCs LPS-stimulated mDCs显著降低FITC-dextran吸收与idc(图4 (c))。此外,我们进一步研究了RB的细胞毒性idc, mdc和脾淋巴细胞。这些免疫细胞的生存能力是不受高浓度的RB(1毫米)与NC组( )(图4 (d))。此外,单靠RB idc刺激(图4 (e))或RB-based mdc(补充图2和图4 (f))没有接受成熟。
(一)
(b)
(c)
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(e)
(f)
3.5。Intralesional治疗RB, RB-Based mDC疫苗,RB-iDC疫苗诱导显著肺转移肿瘤回归和抑制肺Cancer-Bearing老鼠
确定RB, RB-based mDC疫苗和RB-iDC疫苗是可行的抗肿瘤方法对肺癌患者;我们调查是否intralesional注射治疗引起了近年肺癌小鼠模型的治疗效果。使用同系的小鼠的免疫活性的C57BL / 6小鼠模型采用有限责任公司。定义RB的影响,RB-based mDC疫苗和疫苗RB-iDC llc皮下肿瘤小鼠模型建立,肿瘤注射PBS, RB, RB-based mDC疫苗或RB-iDC疫苗。大约72小时后,所有肿瘤RB和RB-iDC疫苗组表现出减少体积和临床证据显示溃疡。接受5天,肿瘤体积的差异是显而易见的,坚持到最后的实验比较RB -时,RB-based mDC疫苗和RB-iDC vaccine-treated组与PBS控制( )(图5(一个))。更重要的是,长时间生存在RB-iDC集团100%存活率的实验(图5 (b))。此外,我们发现一半的老鼠的肿瘤RB-based mDC疫苗和RB-iDC疫苗组治疗后检测不到3天。然而,在第四天RB-based mDC疫苗组和RB-iDC疫苗组的第七天,肿瘤的生长;然而,肿瘤的数量保持稳定,不增加之后(数据未显示)。权重处理RB肿瘤的老鼠,RB-based mDC疫苗,或RB-iDC疫苗也显著低于PBS的控制数据5 (c)和5 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
有限责任公司是高度恶性肿瘤细胞转移到肺部在老鼠28]。因此,我们进一步研究了RB的antimetastatic效果,RB-based mDC疫苗,RB-iDC疫苗LLC tumour-bearing老鼠。代表图像的肺和肺表面转移性结节的数量在不同的组织(图所示5 (e)和5 (f))。在PBS对照组,所有老鼠3 - 4在21天肺转移肿瘤病变。然而,没有观察到转移性肺损伤在RB, RB-based mDC疫苗,和RB-iDC疫苗组( )。这些结果表明,RB, RB-based mDC疫苗,和RB-iDC疫苗治疗对肺转移施加显著的抑制效应。这些结果表明,RB-iDC疫苗,RB, RB-based mDC疫苗可以显著提高抗肿瘤效应和抑制肺转移的临床肺癌小鼠模型。特别是,与其他三个治疗相比,RB-iDC疫苗显示优越的治疗效率。
3.6。RB-iDC疫苗诱导更多的肿瘤特异细胞毒性T细胞和其他免疫效应细胞,减毒免疫抑制细胞的积累
评估是否RB, RB-based mDC疫苗,以及RB-iDC疫苗引发加强肿瘤特异细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应处理老鼠,我们分析了小鼠脾淋巴细胞的细胞毒性T淋巴细胞活性与PBS的小鼠,RB, RB-based mDC疫苗,RB-iDC疫苗实验的最后通过CytoTox 96®非放射性细胞毒性试验。我们发现RB-iDC疫苗,RB, RB-based mDC疫苗都能诱发CTL活动对llc和二者显著强于PBS(数字6(一)和6 (b))。E: 25 T比:1,老鼠接受RB的CTL活性,RB-based mDC疫苗,RB-iDC疫苗引起肿瘤特异靶细胞溶菌作用水平显著高于观察小鼠接受PBS控制。有趣的是,对待RB-iDC疫苗的老鼠显示的比例明显高于TNF -α第脾淋巴细胞在在体外引发刺激比老鼠接受RB或者RB-based mDC疫苗(数字6 (c)和6 (d))。此外,RB-iDC疫苗也显示频率的增加中医和Tscm + Tn细胞与其他三组相比(图6 (e)),代表流仪分析补充图所示3。此外,CD4细胞的百分比+和CD8+脾淋巴细胞T细胞,tumour-infiltrating细胞,和tumour-draining淋巴结(TDLN)人口RB, RB-based mDC疫苗,和RB-iDC组明显高于PBS控制老鼠,CD8+T细胞表现出一个更具戏剧性的差异,尤其是在RB-iDC组(图6 (f))。因此,这些结果表明,RB, RB-based mDC疫苗,RB-iDC疫苗内在肿瘤特异CD8的比例增加+为肿瘤特异CD8 T细胞,并建议了至关重要的作用+代的T细胞抗肿瘤免疫力。
(一)
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(c)
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(k)
(左)
此外,老鼠的Treg人群对待RB, RB-based mDC疫苗,和RB-iDC疫苗的老鼠明显低于PBS对照组,在肿瘤微环境和脾(数字6 (g)和6 (h)),代表流仪分析结果补充图所示4。碰头,Treg老鼠接受RB-iDC疫苗的数量远低于老鼠RB单独处理。的百分比比例MDSCs MDSCs RB-iDC疫苗的制造时间和RB-based mDC疫苗组均低于PBS的控制和RB组(图6 (j))。代表流仪分析MDSCs补充图所示5。然而,在脾脏,没有差别的比例MDSCs(图6(我))。同样,M2的RB-iDC疫苗和RB-based mDC疫苗组PBS的时间均明显低于对照组和RB组(图6(左)),M2巨噬细胞的百分比在RB的脾脏或RB-iDC疫苗组明显低于PBS对照组(图6 (k))。代表流仪分析补充图所示6。有趣的是,没有统计上的显著差异之间的比例M1治疗组和PBS对照组。
4所示。讨论
根据最新的全球癌症统计,肺癌仍是最常见的恶性疾病威胁人类健康(1]。尽管EGFR-TKIs针对EGFR-sensitive突变和艾多酷针对程序性死亡1 (PD-1) /编程death-ligand 1 (PD-L1)已成为一线治疗非小细胞肺癌5,29日),几种不良事件和耐药性的发展导致这些疗法的失败30.- - - - - -32]。这些消极的结果可能的原因包括肿瘤免疫抑制,肿瘤的异质性,CD8不足+T细胞浸润(33,34]。此外,这些最终治疗产生耐药性,导致肿瘤复发或转移。不幸的是,除了T790M突变患者最佳的治疗获得性耐药,第一代和第二代EGFR-TKIs尚未明确定义(32]。因此,迫切需要发展新型免疫治疗肺癌的治疗策略。目前,树突细胞疫苗已成为一种很有前途的抗癌治疗,虽然成功的抗肿瘤效果一直受到免疫耐受,免疫抑制等不明因素的时间(11,12]。然而,RB,光敏剂,可以有效杀死肿瘤细胞,诱导ICD [13]。因此,我们开发了一个原位mDC疫苗(intralesional RB-iDCs),调查了这种疫苗是否有更好的抗肿瘤效果比RB-based mDC疫苗在小鼠肺癌模型。
与先前的研究结果一致显示肿瘤特异诱导的T细胞介导免疫intralesional RB小鼠模型或小鼠腹腔注射mDCs脉冲与hypericin-treated癌细胞体外(35,36),我们表明,CD8+脾脏T细胞数量显著增加,肿瘤组织,和TDLN RB, RB-based mDC疫苗,和RB-iDC疫苗组比PBS对照组和CTL活动反对LLC和TNF的比例α第脾淋巴细胞也在这些治疗组高于PBS对照组。此外,这三个组织也表现出较大的Tem人口。这些特点突出肿瘤特异CD8的重要性+所产生的T细胞反应RB-treated llc和mDCs脉冲RB-treated llc体内或体外在抗肿瘤免疫力。这是第一个研究证实,RB,体外RB-based mDC疫苗,在活的有机体内RB-iDC疫苗都显示肺癌小鼠模型中的一个重要的抗肿瘤效应。
ICD,定义的分泌有关的分子模式(抑制),能够触发有效的抗肿瘤免疫(14]。CRT,把从内质网(ER)死于肿瘤细胞的表面,是主要的信号分子,介导ICD [37]。与其他研究报告观察小鼠CT26结肠癌细胞系(13和人类的海拉细胞38),我们确认RB有能力杀死肿瘤细胞诱导的表达ecto-CRT散装LLC和B16转椅细胞培养。此外,我们首次阐明RB可以诱导ecto-CRT表达刘易斯二者。二者负责耐药性和肿瘤转移研究基于瓦伦而言C”(39]。有趣的是,我们验证了实验组的细胞毒性T淋巴细胞对刘易斯二者仍有一笔影响,抑制肺转移相关的RB, RB-based mDC疫苗,和RB-iDC疫苗组。因此,这意味着针对二者的新靶向治疗的可能性。尽管热休克蛋白70/90 (HSP70/90)、三磷酸腺苷(ATP)和高机动组盒1 (HMGB1)发布在CRT ICD除了关键信号分子;RB-induced ICD的机制仍然不明,可能与ER的角色压力和活性氧(ROS) (37]。
有一个当intralesional RB结合idc协同效应。我们证明了1毫米的细胞毒性效应RB正常组织几乎没有副作用,这剂量符合用于治疗黑色素瘤的临床试验(40]。多项研究表明,RB intralesional注射引发idc迁移到肿瘤(41,42),虽然偶尔,DCs无法进入时间由于免疫抑制的时间,导致有效的免疫细胞渗透到这个时间不足(34]。因此,RB和idc的intralesional注入可能颠覆这些免疫抑制效应,保证足够的抗原表达。我们表明,更多的免疫效应细胞(CD4细胞+和CD8+T细胞)和更少的免疫抑制细胞(巨噬细胞亚群,MDSCs)观察脾脏,肿瘤组织,和TDLNs治疗组,尤其是在RB-iDC疫苗组,比PBS对照组。尽管RB, RB-based mDC疫苗和RB-iDC疫苗能够诱导抗原表达;只有RB-iDC疫苗能够产生足够的TAA表示T细胞。这可以解释为什么RB-iDCs明显增强的抗肿瘤效果,如图所示,延长小鼠的存活时间。尽管先前的研究表明,5-AA intralesional注射结合DC疫苗可以产生更好的抗肿瘤效应(43),这是第一个研究揭示的原位感应的DCs观察RB-iDC疫苗可以加强治疗相对于效率体外mDCs的感应。具体来说,主要的肿瘤内的坏死或凋亡的肿瘤细胞后可以作为intralesional RB管理原位疫苗,“冷”时间转换为“热”(免疫原性)时间(44,45),促进宿主抗肿瘤免疫的激活ecto-CRT肿瘤细胞或二者并通过促进DC的成熟。这种反应可能“打破”的免疫抑制时间和提供一种新的方法拓宽和增强抗原表达和免疫细胞浸润46]。因此,RB-iDC疫苗可以有效防止肿瘤的复发和转移,因为RB诱导长期记忆的反应。
一些研究人员已经表明,RB或mDC疫苗结合PD-1封锁可以达到更好的治疗效果要比任何一种单独的策略(47,48]。这些发现表明,RB-iDC疫苗与免疫抑制剂或其他临床可行的检查站抗癌疗法可能协同增强抗肿瘤T细胞反应,而这可能值得进一步研究。我们研究的另一个限制是,我们使用单剂intralesional注入,和更好的结果可能是通过增加剂量。
5。结论
根据我们的临床前数据,我们提出一个联合治疗策略,可以提供一个更好的人类肺癌和正在进行的临床免疫治疗选择调查的组合治疗肺癌和其他固体肿瘤。特别是,它是有利于避免劳动密集型的协议和体外直流一代的高成本;DCs可以快速目标、激活和成熟在活的有机体内。对于一些肤浅的肿瘤,我们可以直接采用intralesional注入方法,和一些nonsuperficial肿瘤,实际利用内窥镜技术或图像引导手术方法直接注射肿瘤。
数据可用性
作者声明,所有数据支持本研究的发现可以从相应的作者在文章或合理要求。
的利益冲突
作者声明没有潜在的利益冲突。
确认
这项工作是支持由中国自然科学基金会(格兰特号码:81372527),上海市自然科学基金会的卫生和计划生育委员会(格兰特号码:201540373),与自然科学基金会上海(授予数量:12 zr1406500)。
补充材料
补充图1:直方图代表从一个实验显示CD80的表达,CD86, CD40, MHC II级、CD11C, CD14表示后治疗。阳性细胞的百分比显示根据FMO控制。6天,idc收集和培养公司对待RB 69 h。结果显示为“RB-based争取民主变革运动拟写的。“作为一个积极的控制,idc与LPS刺激24 h。结果显示为“LPS-stimulated争取民主变革运动拟写的。“和idc没有刺激表现为一种消极的控制。补充图2:直方图代表从一个实验显示指定的治疗之后CD80的表达。阳性细胞的百分比显示根据FMO控制。6天, idc的数据收集和cocultured RB-based mDCs 69 h。结果显示为“iDC: RB-based 。“idc和RB-based mDCs作为消极的控制和积极控制,分别。补充图3:基于CD8 T细胞分析,CD44、CD62L。不同类型的CD8 T细胞是封闭的+T细胞。中央记忆T细胞(中药)被确定为CD8+CD44+CD62L+T效应(显微镜)确认为CD8记忆细胞+CD44+CD62L- - - - - -,和T内存干细胞(Tscms)和幼稚T细胞(Tn) (Tscm + Tn) CD8+CD44- - - - - -CD62L+。代表流仪Tem的百分比,分析中医,Tn + Tscm脾的老鼠在接受不同的治疗了。补充图4:Treg被确认为CD4细胞+CD25+Foxp3+。CD25+Foxp3 + T细胞的CD4 + T细胞。代表流仪分析亚群比例脾(A)和时间(B)的老鼠在接受不同的治疗方法。补充图5:MDSC被确认为CD11b+Gr-1+。代表流仪结果的百分比MDSCs脾(A)和时间(B)的老鼠在接受不同的治疗方法。补充图6:M1 F4/80巨噬细胞被确定+CD11b+CD11c+,M2巨噬细胞被确定为F4/80+CD11b+CD206+。代表流动仪的百分比分析M1和M2巨噬细胞在脾脏(a - b)和时间(c - d)的老鼠在接受不同的治疗方法。(补充材料)