Trim35控制时钟的泛素化和退化。(一)293英尺细胞转染Flag-tagged Trim35或空向量。转染后48小时,细胞溶解产物是准备和接受IP anti-Flag珠子和免疫印迹表示。293英尺(b)的免疫印迹细胞溶解细胞转染Trim35或空向量,连同HA-Ub。细胞溶解产物是准备和接受IP anti-HA珠子和免疫印迹表示。(c) Trim35 sgRNAs是人类Trim35位点设计目标。琼脂糖凝胶显示修改这两个位点在转染细胞。(d) Pfeiffer细胞感染病毒表达Trim35 sgRNA或控制sgRNA和选择;细胞溶解产物表明蛋白质免疫印迹。微量化蛋白质乐队,表现为相对的表达式。 (e) Pfeiffer cells were infected with Flag-Trim35 expression virus. Protein extracts were immunoblotted for the indicated proteins. CLOCK bands were quantified by densitometry and presented as relative expression. Pfeiffer cells with stable Trim35 overexpression (f) and Trim35-depleted Pfeiffer cells (g) were treated with a proteasome inhibitor MG132 (10 μg / mL)在过去5个小时才消散。时钟蛋白质含量进行了检测和分析。蛋白质乐队被测密度术和作为相对量化表达式。(h i)中描述的相同的细胞(e、d)被用于存在时钟mRNA表达分析。结果规范化GAPDH mRNA水平和表达褶皱mRNA表达与控制的变化。(j, k)中描述的相同的细胞(e、d)培养6 h和24小时之前进一步孵化放线菌酮(CHX)表示时间点。在不同时间点的时钟被免疫印迹检测。微量化时钟乐队,表现为相对的表达式。每个实验都成功进行了三次。^NS , , ,和 。