文摘
作为第二大妇科癌症,宫颈癌近年来被广泛报道的环状RNA是参与了疾病的过程。我们早些时候发现hsa_circ_0000511在宫颈癌细胞的表达明显增加,但其作用的过程中,宫颈癌是不清楚。本研究的目的是探讨宫颈癌的可能机制。定量逆转录聚合酶链反应(存在),细胞计数kit-8化验,Transwell试验、细胞转染,RNA拉试验和dual-luciferase记者分析,和免疫印迹分析被用来检测的表达和分布hsa_circ_0000511 SiHa和海拉细胞入侵和扩散的能力,和调制hsa_circ_0000511之间的关系和hsa - mir - 296 - 5 - p, hsa - mir - 296 - 5 - p,和HMGA1。hsa_circ_0000511最高表达SiHa和海拉细胞和细胞质中的表达明显高于在细胞核,及其表达并不影响核糖核酸酶r . hsa_circ_0000511沉默时,其表达在SiHa和海拉细胞明显减少;扩散、入侵和两种细胞的迁移能力明显增强;和钙粘蛋白的蛋白表达显著调节,而N-cadherin的蛋白表达显著下调。的表达hsa - mir - 296 - 5 - p是低SiHa和海拉细胞;然而,它的表达增加当hsa_circ_0000511抑制和减少hsa_circ_0000511过表达时,扩散的能力,也入侵,迁移和钙粘蛋白的蛋白表达。有趣的是,HMGA1的蛋白表达也改变了在这两种细胞在hsa - mir - 296 - 5 - p是抑制或过表达。 Our results indicate that the upregulated hsa_circ_0000511 can inhibit the proliferation, invasion, and migration of SiHa and HeLa cells by regulating hsa-mir-296-5p/HMGA1, suggesting that the hsa_circ_0000511/hsa-mir-296-5p/HMGA1 pathway may be a potential target for the treatment of cervical cancer.
1。介绍
子宫颈癌,常见的恶性肿瘤,是一个主要的健康挑战全世界的女性。仅在2018年,大约有570000个新的宫颈癌患者,和超过311000名患者死亡1]。可喜的是宫颈癌已经确认主要高危亚型引起的人类乳头状瘤病毒(HPV) (2),和早期筛查和疫苗接种是有效的措施,防止宫颈癌(3- - - - - -5]。然而,宫颈癌侵袭转移的分子机制尚不清楚。
圆形rna (circRNAs)是内源性rna,它是由反向线性前体mRNA的拼接6]。然而,circRNA可以抵抗核酸外切酶的降解核糖核酸酶R,比线性mrna(更稳定7]。一些研究发现,一些circRNAs可以在某些细胞类型特异表达高度或在某一阶段的细胞增殖(8,9]。同时,circRNAs可能的海绵吸附小分子核糖核酸的功能,作为竞争力内生吸附小分子核糖核酸rna,以调节基因的表达,结合蛋白(10,11]。因此,circRNA癌症的发病机理中起着重要的作用,包括宫颈癌。事实上,最近的研究发现,一些circRNAs,比如circAMOTL1 [12],circNFATC3 [13],circNRIP1 [14],circRNA-AKT1 [15],circAMOTL1 [16],等等17- - - - - -19),参与宫颈癌的发生和发展。
小分子核糖核酸(microrna) 17-25核苷酸的尺寸已确认扮演的角色在几乎所有肿瘤生物学过程,如扩散、入侵/转移、血管生成、细胞凋亡(20.]。有些microrna调节在某些肿瘤和充当促进者癌症恶化的沉默肿瘤抑制,如apoptosis-related基因。因此,许多研究人员相信,microrna的表达水平分析可作为生物标志物用于癌症诊断和发展21]。先前的研究已经发现,一些microrna如miR-10a miR-21, miR-19,和mir - 146在经济增长中发挥作用,移民,和宫颈癌细胞的入侵,mir - 372, mir - 214, mir - 218对宫颈癌细胞有抑制作用(21]。值得注意的是,大量的最近的研究发现,microrna受circRNAs参与宫颈癌的进展,如circNFATC3促进宫颈癌的发展通过骗取miR-9-5p [13),负责监管PTP4A1 / ERK1/2 circNRIP1通路通过骗取mir - 629 - 3 - p和促进宫颈癌的迁移和入侵14海绵,circ_0000520 mir - 146 b - 3 - p释放PAX5表达了宫颈癌的进展体内,体内22]。在这项研究中,我们还发现的异常表达circRNA (circ_0000511)在宫颈癌细胞(HcerEpic < SiHa < C-33A <海拉细胞< CaSki < SW756)地学分析(GSE113696),然后通过生物信息学方法预测其目标和验证它在体外和体内。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类宫颈上皮细胞永生化细胞系H8和C-33A从希伯来文名字购买文化集合(苏州,江苏,中国),而SiHa和海拉细胞从细胞获得银行的中国科学院(中国上海)。前两个在RPMI1640培养介质(Gibco表达载体,沃尔瑟姆,妈,美国)含10%胎牛血清,第二两人在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM Gibco)含10%胎牛血清(Gibco), 2毫米谷酰胺,青霉素、链霉素的1%。这些细胞培养在37°C在潮湿的气氛中(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA) 5%的股份有限公司2。
2.2。定量实时聚合酶链反应(存在)的分析
这些细胞总RNA的提取与GeneJET RNA净化设备(热费希尔科学)根据指令。高容量的逆转录酶被处决cDNA反转录试剂盒(热费希尔科学)根据制造商的手册和放大SYBR预混料DimerEraserTM(豆类、日本)的实时PCR检测系统(Bio-Rad大力神,CA)。一式三份的实验进行的特定的引物序列hsa_circ_0000511, RPPH1, mir - 296 - 5 - p,高机动组A1 (HMGA1)和GAPDH列在表中1。计算的相对表达式是规范化和2−ΔΔCt方法。
2.3。核糖核酸酶R测定
SiHa和海拉细胞被孤立的RNA RNeasy系统。然后,RiboMinus工具包(表达载体,卡尔斯巴德,加州,美国)是用于执行我们的第一和第二生物复制60μg和20μg总RNA,分别11]。稀释样本被加热变性(70°C)和冷却(40°C),然后混合10×核糖核酸酶(1.7 R缓冲μL)在40°C 1 h。每组提供三个多个井。评估hsa_circ_0000511和稳定的RPPH1人类mRNA表达水平取决于使用中存在。
2.4。细胞增殖实验
转染SiHa和海拉细胞的增殖与细胞计数检测kit-8 (CCK-8;Beyotime、上海、中国)测定。总之,SiHa和海拉细胞对数生长期被播种在96孔板的细胞密度 细胞/。与相应细胞转染重组质粒(17,24)(表2)为0,12、24、48 h,分别。每组提供三个多个井。在每个时间点,10μL CCK8的解决方案是添加到每个在37°C,孵化2 h;然后,吸光度测量在450海里。
2.5。Transwell化验
SiHa和海拉细胞转染与控制,si-circ, si-circ-NC, microrna的模仿,microrna的数控或overexpressed-HMGA1 24小时。 转染细胞被播种在无血清DMEM Transwell室的上部,而较低的Transwell室与含有10%胎牛血清的DMEM。孵化24小时后,迁移或入侵细胞与4%多聚甲醛溶液固定10分钟,然后沾0.5%结晶紫为25分钟,和显微镜下的细胞数。应该注意,Transwell钱伯斯的上层是预镀0.8%矩阵在入侵实验中,但不是在迁移实验。六个字段被随机选择从每个细胞计数,计算平均值。每组提供了有三个多井,三个井的平均值用于统计分析。
2.6。Dual-Luciferase记者分析
hsa_circ_0000511或HMGA1的结合位点mir - 296 - 5 - p与ciecBank预测,Circinteractome,母星数据库。验证circ_0000511之间的相互作用和mir - 296 - 5 - p, mir - 296 - 5 - p, HMGA1、野生型(circRNA-wt)或突变的序列hsa_circ_0000511 (circRNA-mut)野生型或突变HMGA1 3 - - - - - -UTR, microrna的模仿和microrna的数控被克隆到pGL3向量(美国威斯康辛州Promega)形成重组质粒,分别。SiHa和海拉细胞被播种到96孔板和cotransfected上述质粒。每组提供三个多个井。转染48 h后,荧光强度检测dual-luciferase记者分析系统(Promega)根据制造商的协议。
2.7。裸鼠致瘤性试验
转染si-circRNA或si-circRNA + microrna的模仿和正常SiHa和海拉细胞( )是皮下注入的右边还是thymus-free裸体小鼠( /组)。四个星期后,裸体小鼠颈被spondylectomy,肿瘤组织被摄影。然后,肿瘤被切成两部分:一部分是免疫组化染色和4%多聚甲醛溶液固定,另一部分在液氮低温贮藏蛋白质检测。动物实验动物保护和利用委员会批准。
2.8。免疫组织化学
固定的肿瘤组织脱水和嵌入式,然后切成5μ片,然后用柠檬酸(修理 )。然后,antiproliferating细胞核抗原(PCNA) (ab92552 1: 400年,Abcam)在4°C一夜之间,孵化和第二抗体是孵化为30分钟37°C。随后,部分与苏木精染色后颜色开发与民建联工具包(AR1022博士德生物技术有限公司,武汉,中国)。每个样本的平均光密度是由Image-Pro + 6.0(美国媒体控制论)。
2.9。免疫印迹分析
每个培养细胞总蛋白提取与里帕裂解缓冲(Applygen技术有限公司、北京、中国)。在蛋白质浓度由BCA试剂盒(MultiSciences,杭州,中国),目标蛋白质分类15%或8% sds - page (MultiSciences),然后转移到PVDF膜(微孔,达姆施塔特,德国)和屏蔽5%脱脂奶粉25°C 90分钟。一夜之间,细胞膜被孵化在4°C主要抗体,anti-E-Cadherin (ab40772, 1: 20000), anti-N-Cadherin (ab76011, 1: 10000), anti-HMGA1 (ab168260, 1: 1000)和anti-GAPDH (ab8245, 1: 5000) (Abcam,剑桥,英国)。膜被孵化与HRP-conjugated二级抗体(1:1000年,MultiSciences) 25°C 90分钟,由化学发光和乐队是可视化。
2.10。统计分析
所有的数据提出的 (SD),由一个未配对的双面的差异进行了分析 - - - - - -测试或单向方差分析,和一个值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。hsa_circ_0000511 SiHa和海拉细胞中高度表达,主要分布在细胞质中
在早期,我们发现hsa_circ_0000511的表达,也叫hsa_circ_002144显著调节在宫颈癌细胞(HcerEpic细胞< SiHa < C-33A <海拉< CaSki < SW756)。来验证这个结果,我们使用中存在检测hsa_circ_0000511的表达在不同的子宫颈癌细胞系。结果表明,hsa_circ_0000511 SiHa和海拉细胞的表达水平高于H8、C-33A细胞(图1(一))。因此,在未来的研究中,我们使用SiHa和海拉细胞研究向量继续检测SiHa和海拉细胞的分布。如数据所示1 (b)和1 (c)hsa_circ_0000511的表达水平及其基因符号(RPPH1)主要是在细胞质中表达在SiHa和海拉细胞,分别。与此同时,我们与核糖核酸酶消化R+和检测其耐核糖核酸酶R+。结果表明,在SiHa hsa_circ_0000511的表达水平无明显变化,海拉细胞核糖核酸酶处理R+(图1 (d)),但是这些的RPPH1被显著降低(图1 (e))。
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3.2。抑制hsa_circ_0000511显著促进了SiHa的入侵和迁移和海拉细胞
研究是否hsa_circ_0000511扮演了一个角色在宫颈癌的过程中,我们通过使转染体外沉默hsa_circ_0000511 SiHa和海拉细胞hsa_circ_0000511沉默质粒。首先,我们分析了这种效应的扩散SiHa和海拉细胞。结果表明,吸光度的si-circ组明显高于对照组和si-circ-NC集团(数字2(一个)和2 (b))。同时,存在显示的相对表达式的结果hsa_circ_0000511 si-circ组明显低于对照组和si-circ-NC集团(图2 (c))。接下来,我们调查的影响细胞入侵和迁移(数据hsa_circ_0000511沉默2 (d)和2 (f))。结果表明,入侵的数量或迁移细胞si-circ组明显高于对照组和si-circ-NC集团分别(数字2 (e)和2 (g))。上皮间充质转变(EMT)是一个重要因素导致细胞迁移和入侵的功能变化26],N-cadherin和钙粘蛋白的异常表达被认为是EMT的标志(27]。因此,我们继续研究的影响钙粘蛋白的表达和N-cadherin hsa_circ_0000511沉默。如数据所示2 (h)- - - - - -2 (j)si-circ组中,蛋白质钙粘蛋白的表达均明显高于对照组和si-circ-NC集团,而N-cadherin si-circ组明显低于对照组和si-circ-NC组。
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3.3。hsa_circ_0000511提升SiHa和海拉细胞的入侵和迁移骗取hsa - mir - 296 - 5 - p
探索hsa_circ_0000511促进EMT的潜在的分子机制,我们使用在线数据库circBank, Circinteractome,母星预测潜在的hsa_circ_0000511 microrna的目标,发现hsa - mir - 296 - 5 - p是hsa_circ_0000511的目标。来验证它,我们第一次发现的表情hsa - mir - 296 - 5 - p SiHa和海拉细胞明显低于H8和C-33A细胞(图3(一个)),它的表达si-circ组明显高于对照组和si-circ-NC组(图3 (b))。然后,我们执行一个dual-luciferase记者化验证实hsa_circ_0000511是否直接与hsa - mir - 296 - 5 - p(图3 (c))。结果表明,荧光素酶的活动circRNA (wt) + microrna的模仿组明显低于circRNA (wt) + microrna的NC组,而circRNA的(狗)+ microrna的模仿组相比没有明显变化的circRNA(傻瓜)+ microrna的NC组(数字3 (d)和3 (e))。
(一)
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然后,我们继续研究hsa_circ_0000511的影响和hsa - mir - 296 - 5 - p相互作用对细胞,发现细胞生存能力的microrna的抑制剂组显著低于其他组,和hsa的影响- mir - 296 - 5 - p细胞生存能力依赖于hsa_circ_0000511(数据的影响3 (f)和3 (g))。随后,我们使用Transwell试验检测的影响他们的交互SiHa和海拉细胞的入侵和迁移。结果表明,入侵的数量和迁移细胞si-circ + microrna的模仿组明显减少。虽然入侵或迁移细胞的数量在microrna的模仿,microrna的数控集团si-circ + microrna的抑制剂组和microrna的抑制剂组显著高于si-circ + microrna的模仿,入侵的数量和迁移细胞microrna的抑制剂组显著高于其它三组(数字3 (h)- - - - - -3 (k))。同时存在的结果表明,该表达式的hsa_circ_0000511 microrna的模仿,microrna的数控集团和microrna的抑制剂组明显高于si-circ + microrna的模仿组和si-circ + microrna的抑制剂组,而表达hsa - mir - 296 - 5 - p在si-circ + microrna的模仿组和microrna的模仿组明显高于microrna的NC组si-circ + microrna的抑制剂组,microrna的抑制剂组(数字3(左)和3(米))。
3.4。hsa - mir - 296 - 5 - p抑制入侵和迁移SiHa和海拉细胞表达下调HMGA1
目标基因的进一步研究hsa - mir - 296 - 5 - p,我们使用miRTarBase, miRDB,母星,TargetScan7.2预测,根据分数选择miRDB大于80。结果表明,有两个共同目标基因(NFIC和HMGA1),和HMGA1被选为候选基因,因为它被广泛研究。来验证它,我们也调查HMGA1的表达在不同的子宫颈癌细胞的表达水平,发现HMGA1 SiHa和海拉细胞高于H8 C-33A细胞(图4(一))。然后,我们发现在不同条件下HMGA1蛋白表达的microrna的模仿和microrna的抑制剂。结果表明,HMGA1的表达下调microrna的模仿,但调节的作用下,当microrna的抑制(数据4 (b)- - - - - -4 (d)),这表明hsa - mir - 296 - 5 - p与HMGA1可能直接交互。进一步证实,dual-luciferase记者试验(图执行4 (e)),结果表明,荧光素酶的活动HMGA1 3 - - - - - -UTR (wt) + microrna的模仿组低于HMGA1 3 - - - - - -UTR + microrna的数控,之间的荧光素酶活性没有显著差异HMGA1 3 - - - - - -UTR(傻瓜)+ microrna的模仿和HMGA1 3 - - - - - -UTR(傻瓜)+ microrna的NC组(数字4 (f)和4 (g))。
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接下来,我们继续分析这种监管机制对细胞增殖的影响,入侵,移民和EMT SiHa和海拉细胞。CCK-8试验的结果表明,过度的HMGA1可以显著促进SiHa和海拉细胞的增殖,但这种效应可能被microrna的模拟(数字4 (h)和4(我))。类似Transwell化验结果,侵入性或迁移细胞的数量si-circRNA + OV-HMGA1和OV-HMGA1组明显高于控制或si-circRNA组,但在si-circRNA + OV-HMGA1 + miRNA-mimics组低于si-circRNA + OV-HMGA1或OV-HMGA1组(图5(一个)- - - - - -4 (d))。同时,我们分析了HMGA1的表达式和EMT-related蛋白质免疫印迹。结果表明,钙粘蛋白和蛋白表达比值N-cadherin显著降低HMGA1高度表达,而E / N-cadherin的蛋白表达率显著增加,HMGA1表达低(数字5 (e)- - - - - -5 (h))。
(一)
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3.5。hsa_circ_0000511促进EMT宫颈癌细胞体内的表达下调hsa - mir - 296 - 5 - p / HMGA1
进一步证实我们的体外实验的结果,我们注射转染SiHa和海拉细胞皮下注射到裸鼠实验观察肿瘤的生长。结果表明,肿瘤重量si-circRNA + microrna的模仿组明显低于对照组和si-circRN集团(数字6(一)和6 (b))。免疫印迹分析的结果与体外研究结果是一致的,也就是说,E / N-cadherin蛋白的表达率显著增加,HMGA1表达式很低(数字6 (c)- - - - - -6 (e))。同时,存在显示表达式的结果的hsa_circ_0000511 si-circRNA组和si-circRNA + microrna的模仿组明显高于对照组,而表达hsa - mir - 296 - 5 - p是相反的hsa_circ_0000511在si-circRNA + microrna的模仿组高于其他两组(数字6 (f)和6 (g))。此外,增殖细胞核抗原在肿瘤的蛋白表达是通过免疫组织化学方法检测(图6 (h)),结果表明:PCNA si-circRNA组的平均光密度和si-circRNA + microrna的模仿组明显低于对照组,而在si-circRNA + microrna的模仿组低于si-circRNA组(图6(我))。
(一)
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4所示。讨论
高通量测序和微阵列分析的广泛应用,越来越多的受到关注的重要作用circRNAs在癌症的发展。只有在子宫颈癌,数十个circRNAs已报告,如circPCNX [28],circAMOTL1 [12],circCDKN2B-AS1 [29日],circNFATC3 [13]。在最近的一项研究中,353年的9359年circRNAs被发现宫颈癌组和正常组之间的差异表达,和881 mRNA转录差异表达(30.]。在这项研究中,我们发现一个高度调节circRNA (circ_0000511)在各种各样的宫颈癌细胞由地理分析(GSE113696),它促进了SiHa和海拉细胞的增殖是沉默。进一步,我们发现它能促进细胞增殖,入侵和转移SiHa和海拉细胞通过调节hsa - mir - 296 - 5 - p / HMGA1、相关监管EMT的体外和体内实验。研究表明,hsa_circ_0000511 / hsa - mir - 296 - 5 - p / HMGA1轴可能在宫颈癌的发展起着重要的作用。
EMT,细胞,上皮细胞在此过程中获得间质表型和行为调节上皮特征后,由信号接收到触发细胞微环境(26]。EMT细胞不仅显示纤维母细胞形态学和细胞结构也增加迁移和侵袭性的能力26]。值得注意的是EMT的发展特点是基因表达的变化和转译后的监管机制的多个连接上皮细胞,包括,粘合连接处并且细胞桥粒,缝隙连接和紧密连接(26]。钙粘蛋白属于I型经典钙粘蛋白,它扮演着重要的角色在维持上皮表型和调节组织内稳态31日]。研究发现,肿瘤细胞钙不足导致各种EMT的转移和激活转录因子(32]。复苏以来的钙粘蛋白表达E-cadherin-negative恶性细胞不能反向EMT,一些研究人员不同意减少钙粘蛋白的表达是EMT的标志(33]。同时,各种侵袭性和转移性癌症如前列腺癌、卵巢癌和胶质母细胞瘤与高水平的钙粘蛋白表达(27]。然而,钙粘蛋白的双重效应可能是由于膜的存在受钙粘蛋白和可溶性钙粘蛋白(34]。尽管钙粘蛋白和N-cadherin属于I型经典钙粘蛋白,N-cadherin可以嵌入微血管内皮细胞和壁细胞稳定,然后促进血管生成和维护血管完整性(27]。因此,它被认为是持续的EMT的风向标,大量的研究已经证实,其表达与多种癌症的发展(27]。此外,研究表明,钙粘蛋白主要抑制Wnt /的激活β连环蛋白和RTK / P13K通路在上皮细胞,而N-cadherin-mediated附着力促进激活MAPK / ERK信号和PI3K / PDGFR途径来增强细胞存活和迁移nonepithelial细胞(27]。所以N-cadherin和钙粘蛋白的异常表达被认为是EMT的标志。
HMGA1,属于非组蛋白的染色质结合蛋白的总科,是一种新的转录监管机构和参与多种细胞生物过程,包括转录调控、DNA修复、细胞周期调控、分化、胚胎发生、转换和病毒集成(35]。许多研究已经发现,不同的癌症中高度表达,包括宫颈癌(36,37),胃癌38,39),肝癌40],肾癌[41),和其他癌症(35]。此外,HMGA1 Wnt信号放大和维护已发现Wnt和其他转录网络,这表明HMGA1过度参与肿瘤发生和发展失调(25]。值得注意的是,HMGA1被确诊为监管等microrna mir - 125 b (42],miR-221/222 [37],mir - 296 - 5 - p [36],mir - 214 (43),参与了EMT。在这项研究中,我们发现mir - 296 - 5 - p可以调解HMGA1调节EMT在SiHa和海拉细胞;它还证实,HMGA1的直接目标mir - 296 - 5 - p (36]。除此之外,我们还证明了mir - 296 - 5 - p是由hsa_circ_0000511也可以参与调节细胞核抗原,但其分子机制需要进一步研究。
总结,我们证明了沉默hsa_circ_0000511减少了扩散和EMT SiHa和海拉细胞通过抑制HMGA1的表达上调mir - 296 - 5 - p。值得注意的是,我们观察到细胞的入侵和迁移在这项研究中,但只有调查相关的蛋白质粘附,不是退化和移民相关的蛋白质。同时,我们预测hsa - mir - 296 - 5 - p有两个共同目标基因(NFIC和HMGA1),但是我们只HMGA1验证。我们将进行相应的研究在未来这些内容。这项研究可能有助于了解细胞入侵的分子机制和迁移过程中宫颈癌并提供一个潜在的治疗目标。
数据可用性
相对应的数据集和支持数据可从作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
求,WF负责概念化。JX和质量控制策划研究数据。JX和QC方法和验证。WF分配给项目管理和监督。JX和QC负责可视化。JX和QC参与角色/初稿的写作。JX, QC,求出,WF的写作,审查和编辑。JX和QC的贡献同样co-first作者。