文摘
客观的。牙周炎是一种炎症性疾病的微生物主要由失调病因引起的口腔微生物群。我们的目的是比较口腔微生物的组成变化的年轻人患有严重牙周炎根据性别。方法。17严重牙周炎患者龈下的菌斑样本来自男性和6女性(11)分裂为16 s rRNA基因测序。的成分,α多样性,β多样性的病人的口腔微生物组男性和女性之间的比较。线性判别分析效应大小(LEfSe)被用来分析两组中的特定类群丰富。功能配置(KEGG通路)获得使用基于16 s rRNA PICRUSt基因测序数据。结果。Chao1指数和系统发育多样性的树全部都明显高于男性比女性。辛普森和香农指数两组之间没有显著差异。β多样性表明,样品被合理地分成组。克鲁斯卡尔-沃利斯测试物种的相对多度的基础上,结合LEfSe分析显示,在男性占主导地位的细菌假单胞菌和Papillibacter占主导地位,而女性Fusobacteriales和细菌Tannerella。KEGG分析预测,口腔微生物的变异可能与女性免疫系统,而免疫系统疾病在男性占主导地位的途径。结论。我们发现口腔微生物在一个样品上的性别差异与严重的牙周炎的年轻人。的差异可能与免疫内稳态的变化并导致更好地了解牙周炎。
1。介绍
口腔微生物群的干扰可引起宿主的免疫反应,影响牙周组织的保护和支持,导致牙周病的发展(1]。牙周炎是一种非常普遍的成年人口腔疾病,患病率高达50%的发达国家(2]。患病率更高(~ 90%)在发展中国家3]。的全球负担牙周炎与预期寿命增加,由于世界范围内减少牙齿脱落。在第四届全国口腔健康调查在中国大陆,成人牙周炎的频率为52.8%,重度牙周炎(阶段III或IV) 10.6% (4]。了解口腔微生物的组成和结构可以改善预防牙周炎,使得公共卫生很重要。
口服牙周炎之前直接动态、幼童腹壁薄弱微生物。细菌社区发展,从微生物群落生态演替状态失调表现为出现新的占主导地位的社区成员,而不是新物种的出现(5]。细菌的具体组织和组合,包括“红复杂,”Porphyromonas gingivalis (p . gingivalis),梅毒denticola(t . denticola),Tannerella forsythensis (t . forsythensis)已经与牙周炎的病理密切相关(6]。这些细菌可以改变宿主免疫毒性的增加产量的能力因素。例如,p . gingivalis毒性的因素已显示减少宿主反应(7通过颠覆先天免疫信号)。虽然与宿主的关系通常是稳态,通过操纵补充和toll样受体之间的串扰(通常)[8),会触发一个破坏性的变化(9]。此外,毒性的因素p . gingivalis能具体地识别epitope-specific CD4 + T细胞表型(10]。此外,集群的物种与不那么严格的与疾病被定义为“橙色复杂”,包括普氏菌spp。梭菌属spp。,Parvimonas微米(原消化链球菌属微指令)[11]。他们还发现与免疫有关。梭菌属nucleatum(f . nucleatum)可以有能力的差别产生对这些抗菌肽,如hβd 1和LL-37宿主防御的差别,但这对这些基因可能成为另一个bacteria-mediated毒性机制(12]。
先前的研究已经表明,宿主遗传和免疫因素都是重要的在口腔微生物生态失调,进一步证明这种情况的复杂性。种族/民族、心理压力、社会经济地位、性别、和其他社会人口因素也得到了越来越多的重要性在牙周炎的发病率和严重程度,改变口腔微生物组(13]。然而,性别的影响仍存在争议。没有发现性别关系的酵母和葡萄球菌的微生物分析3075名“难治性”牙周炎患者(14]。同样,一项研究分析了性别和种族的关系与组件的龈下的微生物区系与不同程度的个人牙周疾病和牙周健康发现男性和女性之间没有显著差异(15]。相比之下,繁华等人提出性别与特定的生物,运输证明普氏菌媒介物/ nigrescens(媒介物/ P。nigrescens)更有可能被发现在唾液和龈下的和supragingival斑块的男性比女性16]。
在最近的研究中,我们确定了口腔微生物组上的性别差异的年轻人患有严重牙周炎通过16 s rRNA基因测序和口腔微生物的变化预测,可能与免疫有关,以获得进一步的了解牙周炎。
2。材料和方法
2.1。参与者和入选标准
我们登记共有17个参与者(11雄性和雌性6)体检中心访问第二个中南大学湘雅医院。入选标准是病人年龄在20到44岁之间;至少15现有自然牙齿的存在(不含第三臼齿);没有可移动部分假牙,桥,或植入物;没有1月内使用抗生素和牙周治疗在过去6个月;没有其他细菌感染性口腔疾病或全身性疾病;病人是不抽烟的。所有的参与者都得到了全面的口腔检查,其中包括由专业的牙医专业评估标准的基础上,2017年世界研讨会牙周的分类和高的疾病和条件“分期和分级的牙周炎:框架和建议的新分类和定义”(17]。在测量之前,网站被风干。“初始”牙周炎被定义为至少一个牙齿与探索 毫米和附件 mm或 毫米, mm≤30%的牙齿。牙周炎是定义为“温和的” 毫米, 毫米< 30%的牙齿或 毫米, 毫米30 - 60%的牙齿。牙周炎是“严重的” 毫米, 牙齿或毫米≥30% 毫米, 毫米≥60%的牙齿。严重的患者(第三阶段)和高级(四期)牙周炎招募(18]。基于性别的参与者被分为两组。这项研究是伦理委员会批准第二中南大学湘雅医院。所有的参与者被告知研究目标和提供口头和书面同意。临床试验注册号码是ChiCTR2100046828。
2.2。龈下的斑块集合
口试后患者样本。在采样之前Supragingival斑块被前仔细。龈下的斑是收集使用无菌Gracey刮匙。刮匙是引入网站的底部和斑块内容被在一个中风成1.5毫升管包含1毫升的PBS。样本储存在-80°C。
2.3。DNA提取和16 s rRNA基因文库准备和测序
从每个示例使用基因组DNA分离DNeasy PowerSoil工具包(试剂盒)遵循制造商的指示。我们评估了产量、纯度和完整性的DNA使用NanoDrop 2000光谱仪(马热费希尔科学Inc .)、美国)和琼脂糖凝胶电泳。完成了16 s rRNA oebiotech(上海,中国)。16 s rRNA基因扩增在两个步骤进行。首先,V3-V4高变区扩大了使用基因组DNA, PCR引物如下:向前,343 F (5 - - - - - -TACGGRAGGCAGCAG-3 );相反,798 R (5 - - - - - -AGGGTATCTAATCCT-3 )。在反应混合物15放大了μL (2 x Gflex PCR缓冲,5μ引物343 F, 5μ引物798 R, 0.75 u橡胶草Gflex DNA聚合酶(豆类)和50 ng的模板DNA总量的30μ信用证样本。反应是运行在一个PCR thermocycler (BIO-RAD)按照下列循环计划:5分钟在94°C的变性,紧随其后的是26日周期30年代在94°C(变性),30年代在55°C(退火)和20年代在72°C(延伸率),最后一个扩展在72°C 5分钟。放大产品检查1%琼脂糖凝胶电泳,纯化使用AMPure XP珠子(Agencourt),在新一轮的PCR和放大。
在第二步中,测序引物和适配器(1 x KAPA HiFi Hotstart ReadyMix, 0.5μ和0.5 M融合前进μM融合反向引物,30 ng Meta-gDNA)被添加到2μL的稀释50扩增子的总量μl . PCR如上所述除了7运行周期。量子位量化系统(技术)是用于量化的扩增子根据制造商的指示。在一个管,放大产品汇集克分子数相等的数量和浓度决定使用量子位系统。扩增子测序在Illumina公司MiSeq系统(美国CA Illumina公司Inc .)。
2.4。生物信息学和统计分析
Fastq文件去复用使用MiSeq控制器软件(Illumina公司Inc .)。Vsearch(诉2.4.2)[19)是用于操作分类单位()集群在97%或以上。辣子鸡的分类法是分配,根据RDP序列对齐朴素贝叶斯分类器方法(20.),席尔瓦数据库。辣子鸡被系统发育分析方法定量对微生物生态学(QIIME)软件(v.1.9.0)。我们计算了α辛普森多样性(观察到的物种数量,香农指数,指数,曹国伟指数,PD整个树索引,和良好的覆盖指数)β多样性(二进制Jaccard未加权的UniFrac距离,距离加权UniFrac)基于稀薄OTU计数。我们使用了主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)情节相似或不同样本的组成的社区。序列用于微生物群落与PICRUSt metagenome预测21)基于绿色煤电数据库(22]。微分类群分析与线性判别分析效应大小(LEfSe)使用默认参数(α的意义阈值参数设置为0.05,和对数LDA得分截止值设置为2.0)。功能推理被确认使用京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路。Wilcoxon测试是用来确定不同丰富KEGG两组之间的通路。
3所示。结果
3.1。临床特征的参与者
的 (SD)患者年龄 和 分别为男性和女性。没有统计上的显著差异在男性和女性之间的年龄( ,表1)。
3.2。序列信息
我们使用Illumina公司MiSeq和QIIME分析微生物成分在从严重和先进的牙周炎患者龈下的斑块。平均72118分钟。70569年,马克斯。74730)清洁标签来自男性和71104分钟。64237年,马克斯。从雌性74255)清洁标签。去除嵌合体之后,分析了标签的数量下降到平均64454分钟。61201年,马克斯。在男性和66097(68461)分钟。60115年,马克斯。68779年女性。)使用Vsearch (v.2.4.2)软件集群个体序列有97%的遗传相似性在物种水平上,我们发现5181辣子鸡17份样品中,用最少的1171辣子鸡、在一个示例最高1752辣子鸡(表2)。
测序通常可以确定的质量基于稀疏的指数曲线,rank-abundance曲线,或物种累积曲线。在我们的示例中,稀疏曲线基于良好的报道倾向于接近饱和,表明样品的数量是足够的,没有明显的差异在两组之间的稀疏曲线(图1(一))。与rank-abundance曲线得到了类似的结果,表明的测序数据量足够丰富,以反映大多数微生物物种样本(图中的信息1 (b))。
(一)
(b)
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(d)
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(f)
3.3。多样性分析
α口腔微生物群落的多样性反映了丰富性和多样性。在每组细菌丰富度和均匀度(α多样性)估计使用Chao1指数测量PD整个树,和辛普森和香农指数(数字1 (c)- - - - - -1 (f))。整个树Chao1指数和PD男性显著高于女性(Wilcoxon rank-sum测试, )。辛普森和香农指数两组之间没有显著差异(Wilcoxon rank-sum测试, )。因此,社区的多样性并不是严重的和先进的牙周炎患者根据不同性别。
随后,对群落结构,相对丰度是评估在顶部15门(图2(一个)),属(图2 (b)分别)级别。虽然主要的特色是相似的,每个物种的丰度是截然不同的。主要的微生物群(> 1%)的门和属水平及其丰度表中列出3。统计分析的主要细菌进行了两组之间,和箱线图表示上面3种不同物种的丰度在门和十大不同物种在属的水平( )如数据所示2 (c)和2 (d)。与男性相比,相对丰富的Fusobacteria,Synergistetes,Chloroflexi在门级增加女性( ),的丰度Chloroflexi男性是0(图2 (c))。在属级的相对丰度Tannerella,Eubacterium_nodatum_group,幽门螺杆菌女性高于男性( )的相对丰度拟杆菌,假单胞菌,prevotellaceae_ucg - 001,Clade_la,Prevotellaceae_NK3B31-group,不动杆菌,Parabacteroides在女性低于男性( ;图2 (d))。图3显示了Wilcoxon分析男性和女性之间的差异的相对比例的门(图3(一个)),属(图3 (b)热点图的形式)的水平。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
β两组之间的多样性反映了微生物多样性的差异。因此,我们评估之间的相似程度的微生物群落利用PCA, PCoA,非度量多维标度(nmd)分析基于未加权的UniFrac距离。男性和女性有严重和先进的牙周炎可以形成相对集群(数字4(一)- - - - - -4 (c)),通常被分为一个二维空间分布,表明两个社区是不同的(数据4 (b)和4 (c))。一个ANOSIM测试β多样性表现出显著差异(值和未加权的UniFrac距离 ; )。
(一)
(b)
(c)
3.4。LEfSe分析
线性判别分析的影响大小(LEfSe)被用来识别分类单元描述两组之间的差异。基于物种丰度的结果比较两组口腔微生物群,在门的社区团体之间的差异进行了分析使用LEfSe分析(数据属水平5(一个)和5 (b))。我们的研究结果表明,门Fusobacteria,其类Fusobacteria及其顺序Fusobacteriales,随着家庭Tannerellaceae及其属Tannerella丰富的女性患者。此外,订单Pseudomonadales和其家庭假单胞菌科和属假单胞菌,以及属Papillibacter丰富的男性患者。Tannerella是关键组件,可以通过选择第一组的区别30属的相对丰度和执行随机森林特征选择过程(图5 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.5。功能代谢途径预测
KEGG途径预测微生物功能中,我们确定了几种途径表现出显著差异丰富的男性和女性在不同的层次之间Wilcoxon测试(图6)。预测KEGG通路的通路分析每个样本在门级表示,改变了丰富的微生物主要是参与免疫系统和心血管疾病相关通路(图6(一))。类级别的结果还表明,途径是与免疫系统有关,包括nod样受体信号通路和抗原处理和表示(图6 (b))。预测KEGG途径基于组表明,免疫系统也大大丰富了女性和免疫系统疾病主要集中在男性(图6 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在这项研究中,我们使用16 s rRNA高通量测序以确定物种丰度的差异在口腔微生物组的年轻男性和女性严重牙周炎。关于α多样性物种丰富度的基础上,男性比女性有更高的价值。此外,β多样性表明,样品被分成合理的组。克鲁斯卡尔-沃利斯测试物种组成的相对丰度的基础上,结合LEfSe分析显示,在男性占主导地位的细菌假单胞菌和Papillibacter女性占主导地位,而细菌是Fusobacteriales属Tannerella。KEGG分析预测,口腔微生物的变异可能与女性免疫系统,而免疫系统疾病在男性占主导地位的途径,为进一步了解牙周炎。
牙周炎是一种炎症扩展深入组织并导致支持结缔组织和牙槽骨的损失(23]。口腔微生物组被定义为口腔中的微生物,包括细菌,病毒,真菌,原生动物,古生菌(24]。失调假说认为,从牙周健康过渡到疾病发生由于物种丰度的变化中细菌的牙周袋。这种转变在微生物群落的组成是足以改变宿主相声,导致破坏性炎症和骨丢失(7]。健康的口腔微生物群落通常有较低的多样性和丰富性25]。一般植物的物种多样性是年轻人比老年人更低,通常反映在年轻人的牙周状况是健康的。此外,年轻人更受激素影响,所以有临床意义讨论性别差异。我们发现整个Chao1指数和PD树在男性显著高于女性,男性的代表更大的细菌丰富,他们可能有严重的牙周组织破坏。日本人肠道微生物群的健康调查发现,尽管在微生物结构有显著差异在20 - 89岁的男性和女性之间α肠道微生物群的多样性并不是不同的男性和女性之间或在年龄组(26]。
在美国牙周病学研讨会在1996年举行,专家也认为有11个牙周疾病密切相关的微生物,包括革兰氏阴性细菌等p . gingivalis,t .连翘,媒介物/ P。nigrescens,f . nucleatum,Aggregatibacter actinomycetemcomitans(A.actinomycetemcomitans),t . denticola(27]。其中,我们发现Fusobacteriales在女性明显高于男性通过克鲁斯卡尔-沃利斯检验的门和LEfSe分析。最普遍的女性Fusobacteria厌氧革兰氏阴性杆菌,引起组织坏死,败血症,intra-amniotic感染、早产,和口腔的疾病,如牙髓的感染,牙槽骨脓肿和牙周疾病。f . nucleatum诱发炎性细胞因子和细胞增殖,抑制细胞凋亡,细胞入侵和迁移通过宿主细胞基因组改变(12]。f . nucleatum反应在牙周疾病和炎症反应导致分泌的唾液抗菌肽影响宿主细胞和调节免疫反应12]。Kostic等人指出,Fusobacteria产生炎性微环境有利于结直肠肿瘤的进展通过招募肿瘤浸润免疫细胞(28]。门变形菌门被浓缩在男性患者。关等人发现,高表达也存在严重的支气管扩张(29日]。
我们的结果显示口腔微生物组显著变化的不同性别的年轻人。在我们的研究中,在属水平,增加Porphyromonas,普氏菌,Tannerella在口腔微生物组的女性造成牙周破坏。p . gingivalis是最广泛研究的所有主要的牙周致病菌。的毒力因子p .牙龈脂多糖(LPS)、菌毛和胶囊(30.]。p . gingivalis有限合伙人和菌毛刺激导致的upregulation TLR2表达式和促炎细胞因子的生产在活的有机体内和在体外,导致致病性炎症性骨丢失(31日]。p .媒介物和p . nigrescens从牙周网站往往是孤立的,曾经被认为是两个不同基因型的p .媒介物(32,33]。p .媒介物有限合伙人可以参与骨破坏通过刺激破骨细胞的分化和活动,促进破骨细胞和成骨细胞的释放基质金属蛋白酶(34]。值得注意的是,我们发现Tannerella在女性通过LEfSe分析显著增加。Tannerella专性厌氧的革兰氏阴性,不动的,多形性杆菌(35],可以影响宿主的免疫系统通过诱导的促炎细胞因子(例如,il - 1β并通过CD4 + T辅助细胞il - 6)和肿瘤坏死因子-α(36]。临床横断面研究发现的存在p . gingivalis和高的殖民t . denticola和p .媒介物发挥重要作用在泰国人口严重的牙周炎(37]。除此之外,青少年牙周炎的严重程度是与高水平的激素有关。队列研究的106名妇女(58岁),激素替代疗法导致更少的阳性样本的牙周病原体p . gingivalis,p .媒介物,Tannerella连翘在龈下的斑38]。
我们的结果表明,奈瑟氏菌属和Capnocytophaga增加男性严重牙周炎,与以前的结果一致。明蒂等人报道Capnocytophaga男性比女性过多的唾液样本(39]。Capnocytophaga canimorsus是一种革兰氏阴性杆菌具有独特的毒力因子,使其逃避人体免疫系统;它存在于口腔龋齿的22%到74%的健康狗(40]。纤毛菌属、Prevotella_7 Prevotella_2显示男性和女性之间没有显著差异。此外,男性和女性之间没有差异被发现对于辛普森和香农指数,表明大量的相似的菌株在男性和女性中,这是符合报告结果陈et al。41]。与我们的结果相比,当Belstrøm等人使用微阵列研究292年丹麦人的口腔微生物组与低水平的龋齿和牙周炎,他们发现,饮食、体重指数、年龄、和性没有明显影响微生物丰富,尽管社会经济地位影响口腔微生物的概要文件(42]。其他可能的因素可以解释观察到的差异在我们的研究中,包括遗传变异、社会因素,齿年表喷发,和激素的差异,这可能会影响斑块的构成微生物(14,43]。
在我们的研究中,KEGG分析发现免疫系统,内分泌系统,代谢疾病和传染病女性通路显著变化。这可能与这一事实有关女性占主导地位的细菌f . nucleatum形成生物膜的能力和coadhere,从而导致系统性疾病,如泌尿道感染、菌血症,心包炎,中耳炎44,45]。但具体机制需要进一步研究。这表明口腔微生物群的失衡参与免疫和代谢体内平衡的规定根据性别差异。然而,通过LEfSe分析的数量Papillibacter明显高于男性。一些研究发现高的相对丰度Papillibacter rumminococcacea与黑色素瘤患者具有高响应PD-1免疫疗法(46),这表明Papillibacter免疫疾病密切相关,这是符合KEGG分析男性的浓缩。此外,Papillibacter可以引起局部炎症,导致聚合吗α-核蛋白和一代的路易小体,可以参与帕金森病的发生和发展在男性47]。这可能是相关的现象称为移动微生物,这被认为是导致系统性疾病发生和发展。这种现象由口腔微生物的变化;产生的变化在当地的宿主免疫反应和溢出的促炎介质进入体循环可能影响系统性炎症和免疫系统疾病(48]。此外,几乎所有免疫细胞表达激素受体(49,50],许多免疫相关基因具有雄激素雌激素receptor-responsive receptor-responsive元素和元素的推动者,这可能是另一个因素影响的性别差异在免疫反应(51,52]。
5。结论
总之,我们的研究证明了性别之间的关系的假说的口腔微生物组和严重的牙周炎青年通过16 s rRNA基因测序。此外,KEGG通路分析预测,口腔微生物的变异可能与免疫内稳态。因此,进一步的研究需要深化我们对机制的理解。
数据可用性
生读已经沉积在NCBI BioProject加入PRJNA763727数量。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Ya-Qiong赵和Ying-Hui周贡献了同样的工作。
确认
我们感谢所有的龈下的斑块捐助者参加我们的研究。这项研究得到了国家自然科学基金(拨款81773339,81773339,82001004),湖南省科学技术厅,中国(2018年拨款2017 wk2041 sk52511),湖南省的国家自然科学基金(批准2018 jj3708),该基金为中南大学湘雅临床医学数据库(2014年格兰特- zdyz - 1 - 16),和大型仪器设备开放共享基金的中南大学。