文摘

背景。肺移植全球已经完成并承认作为患者的有效治疗各种终末期肺部疾病。然而,极限可靠的临床指标存在识别同种异体移植物衰竭的高危患者在肺移植受者。最近的进步肺部疾病的免疫学方面的知识,先天巨噬细胞激活,引起病原体或pathogen-derived分子和被广泛接受的关键证据肺部炎症和纤维化的发病机制之一。本研究旨在评估CD86的临床意义和巨噬细胞清道夫受体1 - (MSR1)阳性细胞在特发性肺纤维化(IPF)的发展和肺动脉高血压(PAH),和他们潜在的角色在肺移植后的预测结果。方法。从肺移植组织37 IPF患者和15的心胸外科手术在无锡人民医院从2015年12月到2016年12月通过免疫组织化学方法分析(包含IHC)检测和CD86表达MSR1肺移植后和与临床相关的事件。结果。包含IHC结果表明MSR1的表达,IL-13, arginase-1 (__arg1)但不是CD86在IPF患者的肺部分与PAH患者相比显著增强。MSR1的表达、IL-13 __arg1但不是CD86在肺IPF患者吸烟与不吸烟,相比显著增加。此外,在IPF MSR1-positive细胞的表达主题肺炎克雷伯菌感染显著增强比noninfection科目。MSR1-positive巨噬细胞与FEV1和FVC的负相关但不与TLC和TL_有限公司。然而,CD86-positive巨噬细胞与上述肺function-related因素没有显著相关。此外,MSR1有较高的ROC曲线下面积(AUC)比CD86 IPF诊断。生存分析显示,高水平的MSR1-positive巨噬细胞有一个糟糕的预后效果IPF患者肺移植。结论。我们的研究表明的临床意义肺炎克雷伯菌感染相关性MSR1-positive IPF细胞进程,它可能是一个在IPF肺移植后预后标记;发展战略以减少MSR1-positive巨噬细胞的表达在IPF肺移植可能是有益的。

1。介绍

特发性肺纤维化(IPF)是一种进步的和致命的疾病,其特征是细胞外基质沉积的发展导致严重的呼吸困难和障碍的肺功能(1]。患者的平均生存IPF诊断范围从2.84到4.8年后,根据疾病的阶段和病理特征2- - - - - -4]。病理过程导致疾病进展被认为可能与个体遗传和nongenetic因素(如病原体感染和吸烟)5]。肺动脉高压(PAH)是一个进步的前毛细管的肺血管疾病,发生在大多数的整个肺小动脉直径缩小,最终导致血液流动阻力和右心衰和死亡(6]。尽管大量的药物靶点和化合物,肺移植是唯一干预显示提高IPF患者的预期寿命和严重的多环芳烃,当药物治疗不再是有效的。因此,准确理解疾病进展的指标可能改善肺移植的临床管理。

个别病人的预后突显出,肺移植是很难预测的,因为没有可靠的临床参数或生物标志物反映疾病进展。最丰富的免疫细胞在肺部(大约70%的免疫细胞)、巨噬细胞吞噬细胞病原微生物发挥核心作用在伤口愈合的气道重塑和肺纤维化7]。肺巨噬细胞显示两极分化表型,他们可以分为两个不同的种群,肺泡巨噬细胞(AMs)和间质巨噬细胞(IMs) [8]。AMs位于腔的表面和启动免疫反应在肺部中遇到各种病原体,而IMs位于肺组织间质和改造肺组织(9]。证据指向肺的改变微生物的潜在作用触发IPF进展(10),这表明一些病原体或pathogen-derived分子IPF发展相关联的潜在角色肺巨噬细胞激活(11]。根据不同的微环境,巨噬细胞可以分化成经典(M1)激活巨噬细胞,或者激活(M2)巨噬细胞(12]。M1巨噬细胞被激活的微生物菌剂和/或Th1细胞因子,如干扰素(IFN -γ),可以增加吞噬能力随着costimulatory分子(如CD86)的表达和分泌促炎细胞因子(TNF -α、il - 6和il - 12),并发挥重要作用在清除细菌、病毒或真菌感染,导致组织损伤(13]。另一方面,M2巨噬细胞受Th2细胞因子的刺激,参与组织修复和重建,血管生成,和代谢反应13- - - - - -15]。巨噬细胞极化纠缠不清的促进和调节肺纤维化。M1 MMP28巨噬细胞诱导的基因敲除减弱bleomycin-induced肺纤维化(16]。此外,老鼠ST2-deficient bleomycin-induced纤维化受损,伴随着增加M1巨噬细胞(17]。肺纤维化与不同类型的M2激活有关,表明profibrotic M2巨噬细胞在肺纤维化的发展中的作用[18,19]。

先前的研究表明,MSR1, M2极化的标志(20.发挥了至关重要的作用,诱导炎症反应和先天和适应性免疫反应的识别其为病原体外生的分子模式(PAMP时)和内源性配体(21,22]。MSR1 silica-induced纤维化的过程中扮演重要角色,MSR1-deficient老鼠表现出没有沉积的胶原蛋白(23]。的表达MSR1增加在单侧输尿管梗阻(UUO)诱导肾纤维化(24]。据报道,MSR1的表达显著增加在IPF患者的全血(25]。刺激与胶原类型单体显著调节MSR1特发性肺纤维化患者的肺泡巨噬细胞表达,暗示的潜在作用MSR1肺纤维化的发展(26]。然而,对巨噬细胞的潜在临床角色子集在临床表现和个人IPF患者肺移植后的结果。

这些发现的背景下,我们感兴趣调查激活的巨噬细胞类型从15 IPF患者使用含有肺动脉高血压病人的免疫化学染色,已经发展成为一个重要的因素,可以影响结果在慢性肺疾病(27,37严重IPF从2015年12月到2016年12月。我们不仅评估之间的相关性MSR1——或者CD86-expressed巨噬细胞和肺纤维化的临床病理的因素也对肺移植后的存活率的影响。我们假设MSR1-positive IPF患者巨噬细胞可以作为一个新的预后的生物标志物和肺移植的潜在的治疗目标。

2。材料和方法

2.1。研究设计和人类组织样本

大脑和心脏死亡后的肺自愿捐赠公民已成为在中国大陆唯一的器官移植来源从2015年1月28]。这项研究是无锡人民医院伦理委员会的批准和执行按照道德原则源于赫尔辛基宣言,与良好的临床实践和适用的法规要求一致。这些过程和参与本研究样本由心胸外科手术团队的无锡市人民医院从2015年12月到2016年12月。协议和知情同意表格适当的机构审查委员会批准了这项研究。之前所有的病人提供书面知情同意参与任何研究过程。

共有52名患者的肺样本来自37个严重IPF患者和15多环芳烃(病人的平均肺动脉压力大于25毫米汞柱(29日]),这两个诊断根据公布的共识声明通过结合临床、放射和病理检查(29日,30.),包括在研究。人口和IPF患者的临床资料和PAH患者获得纸记录。所有患者的主要临床特点和数据,如年龄、性别、吸烟史、体重指数,已匹配(表1)。没有病人接受疾病修饰治疗手术前(pirfenidone或nintedanib)。其中37 IPF患者,11个受试者评估积极感染(肺炎克雷伯菌)根据以前的标准31日]。

所有的肺组织样本选自移植外植体根据病人的知情同意和显示功能的优秀组织保存和足够的肺膨胀。肺切除术在4%多聚甲醛固定,沉浸在20%蔗糖,安装在10月化合物,并在5与切片机μm;然后,所有肺组织样本保持在4°C。

2.2。免疫组织化学

删除10月或石蜡后,肺组织的幻灯片都是脱蜡和水分利用一系列分级的乙醇和水。然后,抗原进行检索与柠檬酸缓冲的pH值6 5分钟。之后,幻灯片和4%多聚甲醛固定,在PBS permeabilized 0.4% Triton x - 100在室温下15分钟。未指明的结合位点与PBS + 2% BSA被封锁在4°C 30分钟。兔子兔子反CD86抗体分子,反MSR1抗体(CST, 1: 1000稀释),兔子反IL-13抗体(CST, 1: 800稀释),或兔子反arginase-1抗体(表达载体,1:1000稀释)作为主要抗体和cocultured过夜。然后,多余的抗体与PBS移除,然后,幻灯片是沾HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白,其次是孵化在室温下30分钟。最后,切片在显微镜下观察。CD86或MSR1蛋白的阳性反应是可见黄褐色的细胞质染色。

六个随机(100 x)数字图像捕捉从每个样本准备检测的强度CD86和MSR1-positive肺细胞使用Image-Pro +软件6.0(美国马里兰州银泉的媒体控制论)。然后,每个样本的平均IOD计算。

2.3。统计分析

所有的统计方法进行使用SPSS软件,版本21.0 (SPSS Inc .,芝加哥,IL)。结果表示为 (SEM)。比较之间的特点和CD86 / MSR1表达式PH值和IPF患者受试者使用独立执行 - - - - - -正态分布的测试数据和Mann-Whitney测试不是正态分布的数据。卡方测试被用来分析相关性CD86 / MSR1表达和临床病理的IPF的特征。生物标志物的水平进一步分析了接受者操作特征(ROC)曲线来确定截止水平,导致最优诊断准确性为每一个标记(CD86 / MSR1)之间的IPF患者和PH值。生存分析是评估使用kaplan meier方法,并为每一个变量进行了评估结果的差异使用生存率较。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。病人的人口统计

表1提供所有的细节的人肺样本进行免疫组织化学染色。这些参数包括数量、年龄、性别、吸烟史、肺功能、身体质量指数,和治疗。15岁的PAH主题( 岁)与IPF不尽相同的科目( ,岁)。雌性的比例(80.0%)在IPF科目几乎是一样的多环芳烃受试者(86.5%)。受试者吸烟史的比例在IPF相似(32.4%)和多环芳烃(26.7%)科目( ,

3.2。增强患者表达MSR1的奖学金项目肺炎克雷伯菌感染

先前的研究已经表明,CD86和MSR1特别表达了对巨噬细胞和M1和M2巨噬细胞标记非常有用,分别,32,33]。因此,我们执行CD86或MSR1使用肺组织化学染色部分从IPF和PAH患者接受肺移植。如数据所示1(一)和1 (b),CD86-positive巨噬细胞在肺的表达部分IPF患者从PAH患者相似,表明M1巨噬细胞极化可能不涉及IPF发病的。此外,没有明显的顺从CD86-positive细胞IPF科目之间有或没有吸烟(图1 (c))或肺炎克雷伯菌感染(图1 (d))。

然而,可见MSR1在肺癌组织中表达显著增加IPF患者相比,PAH患者(数字2(一个)和2 (b))。肺组织中的表达MSR1吸烟者比不吸烟者呈明显上升的IPF患者(图2 (c)),这表明烟雾诱发M2巨噬细胞极化与IPF发病机制的发展。有趣的是,在IPF MSR1-positive细胞的表达主题肺炎克雷伯菌感染增强比noninfection主题(图2 (d))。由于MSR1 M2巨噬细胞的关键制造商,我们下一个检测到其他M2 macrophage-related因素IPF患者肺组织,发现IL-13的表达和Arg-1 IPF患者肺组织也显著提高IPF患者相比PAH患者(数字2 (e)- - - - - -2 (h))。

3.3。MSR1是负相关的表达与IPF患者的肺功能

接下来,我们分析了CD86的表达之间的联系或MSR1和参数与肺功能有关。如数据所示3(一个)- - - - - -3 (d)CD86的表达,没有关联,残,FVC、TLC、TL_有限公司在IPF科目( ,p= 0.5831; ; 23日, ; , )。然而,残,FVC发现MSR1表达显著负相关,在肺纤维化的IPF科目( , ; , ;数据4(一)和4 (b)),而没有明显的表达之间的相关性MSR1和TLC或TL_有限公司在IPF科目( , ; ,p= 0.178;数据4 (c)和4 (d))。

3.4。MSR1表达式在IPF患者的肺纤维化的严重程度和肺功能显著相关

患者的平均生存IPF肺移植后稳定 个月。我们下一个检查烟雾和BMI的预后的角色,是密切相关的结果IPF (34,35肺移植后],IPF患者。结果表明,吸烟患者 )明显降低预期寿命与不吸烟者相比 )在IPF患者肺移植(图5(一个); )。然而,没有区别在生存比较子组之间的IPF患者低BMI ( )和高体重指数( )观察(图5 (b); )。

评估MSR1或CD86的表达是否预测生存在IPF患者移植后,ROC曲线分析被用来评估这两个生物标记的识别能力区分IPF患者多环芳烃。结果表明,集成光学密度(IOD)值 是分界点(数据吗6(一)和6 (b))。这个值是最好的折中最好的敏感性(90.0%)和特异性(94.1%)(MSR1: ,95%置信区间:0.672—-0.964, )。然而,没有明显的分布差异的CD86值两组(CD86: ,95%置信区间:0.235—-0.564, )。

随后,我们将病人分成两组根据MSR1的表达式,证明了不到638集成光密度(IOD)或超过638 IOD低表达和高表达,分别。kaplan meier生存分析显示,患者的高表达MSR1(21例)针对疾病的存活率明显降低比低表达患者(16)(图6 (b); )。

4所示。讨论

在这项研究中,我们评估macrophage-specific标记PAH患者和患者的肺部严重的阶段IPF接受肺移植。结果表明,M2 macrophage-related标记(MSR1、IL-13 __arg1)比PAH IPF患者的异常表达。此外,肺组织中的表达MSR1 IPF患者也是高度与折磨人的肺功能有关。其他示威这里有较高的情况下,数字的M2巨噬细胞在肺部IPF患者肺移植后临床疗效不佳。我们的数据是由一小群IPF患者研究,增加MSR1表达式的肺泡巨噬细胞从支气管肺泡灌洗26]。有进一步证据的潜在作用M2巨噬细胞极化的纤维组织反应包括肝纤维化(36,37),肾纤维化(38),肺纤维化(16,39),胰腺纤维化(40),和心脏间质纤维化(41]。

不同的巨噬细胞子集贡献重要活动启动,维护和纤维化的决议阶段(42]。M2巨噬细胞是至关重要的通过提供profibrogenic IPF发病的因素,有利于细胞生长,胶原蛋白的形成,和愈合功能(43]。佳里布等人报道,MMP28促进肺纤维化与感应M2编程利用MMP28基因敲除小鼠(16]。另一篇文章报道,肺纤维化引起的il - 10 M2巨噬细胞的过度增加了表达BAL和全肺组织(44]。然而,CD86的表达(M1巨噬细胞)弱发现纤维化[/周围地区的45]。这些观察可以解释增强M2但不是M1巨噬细胞入侵的肺纤维化的发展在我们的研究中。为什么M2 macrophage-related IPF的标记高于PAH患者可能参与许多不同的介质,包括前列腺素(PG) E2、内皮素1 (ET-1)、转化生长因子- (TGF)βPH值、il - 6的发展(46),在未来需要进一步研究。

我们发现MSR1-positive巨噬细胞的数量负相关与IPF患者肺功能(FEV1和FVC);然而,CD86之间没有关联⁺巨噬细胞和肺功能。Kaku等人显示出类似的结果,M2巨噬细胞(CD163⁺或MSR1⁺慢性阻塞性肺病患者)有显著的负相关FEV1 (47]。吸烟已被报道是一个风险因素对特发性肺纤维化(48),而之前transcriptome-based提供研究证据表明巨噬细胞可能导致肺部疾病发病机理由于吸烟引起的重组对M2-polarized表型(49]。我们的数据表明,MSR1表达式而不是CD68在吸烟者的肺是急剧增加而MSR1表达式不吸烟的IPF患者。我们所知,这是第一个研究显示的与吸烟有关的upregulation MSR1 IPF患者的表达式。一个潜在的机制可能涉及内毒素(LPS)接触吸烟,如需要MSR1 LPS-induced TLR4-mediated NF -κB激活巨噬细胞(50]。此外,据报道,吸烟影响很多生物炎症介质通过其影响免疫炎症细胞,如中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞,树突状细胞,肥大细胞,巨噬细胞;我们推测MSR1受到上述细胞的激活(51]。类似的结果COPD患者的肺泡巨噬细胞被发现和CD204表达在慢性阻塞性肺病吸烟者比non-COPD吸烟者和非吸烟者(52]。与此一致的是,IPF患者吸烟历史上有关肺移植后临床预后较差。然而,目前的研究仅说明了代表标记(MSR1和CD86)的病人,尽管存在各种巨噬细胞表型标记,包括细胞因子、趋化因子、可溶性细胞因子受体,和其他表面受体(53),在未来需要进一步评估。一项研究已经表明,明显的病原体感染,如肺炎克雷伯菌,结核分枝杆菌,鲍曼不动杆菌,与IPF患者症状恶化[31日]。很有趣的探索潜在的角色之间的表达MSR1 IPF患者和病原体感染。我们的数据表明,MSR1在IPF主题的表达肺炎克雷伯菌感染多在noninfection主题,可能由于肺炎克雷伯菌冲击波各种引起内毒素(LPS)可能涉及在MSR1激活(50]。

尽管一些可溶性分子和支气管肺泡灌洗液(BALF)标记,包括CXCL11 [54],KL-6 [55],IL-7 [56],YKL-40 [57),对IPF调查,然而,目前迫切需要发现新的生物标记物预测肺移植后IPF患者的临床结果。只有少数报告显示肺移植后与生存相关因素对IPF检查,包括术前肺动脉压力(58)和肺分配分数(59]。事实上,我们推测,IPF患者肺部的微环境提供了他们生存的最好机会。所以,寻找潜在的标记在肺部可能是一个有意义的预后指标。当IPF决心接受肺移植的患者,我们可以得到足够的病理肺组织检查特殊标记。进一步的问题是生存具有重要的应增加或减少体重pro -或抗炎巨噬细胞,这可能是受各种病原体和pathogen-derived分子。我们的数据表明,高表达的MSR1肺与IPF患者临床预后恶化是相关联的肺移植后,表明MSR1可能作为一个潜在的定量工具来衡量的生存具有重要的意义。

5。结论

总之,我们的数据意味着增加MSR1, IL-13,和__arg1表达发生在IPF患者,观察,可以建议一个可能的角色M2巨噬细胞在肺纤维化的发病机制。自MSR1的表达与功能指数显著相关(FEV1、FVC)肺纤维化严重,这可能是一个有用的生物标志物评估的IPF患者的临床状态。更重要的是,M2巨噬细胞似乎是一个潜在的疾病严重度肺移植后标记,表明预测值的MSR1生存。

缩写

多环芳烃:	肺动脉高血压
MSR1:	巨噬细胞清道夫受体1
IPF:	特发性肺纤维化
包含IHC:	免疫组织化学
自动对盘及成交系统:	肺泡巨噬细胞
IMs:	间质巨噬细胞
M1:	经典激活巨噬细胞
M2:	或者激活巨噬细胞
FVC:	用力肺活量
薄层色谱:	肺活量
残:	一秒钟用力呼气量
TL有限公司:	转移因子的肺一氧化碳。

数据可用性

没有数据被用来支持本研究。

的利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益。

作者的贡献

铭丰郑,添添了同样的工作。

确认

这项工作得到了江苏省病原生物学重点实验室(批准号KLPBJP-K202002)和自然科学基金中国江苏高等教育机构(批准号20 kjb320020)。