文摘
原发性干燥综合征(pSS)是一种自身免疫性疾病侵入泪腺体,唾液腺,和其他外分泌腺体,但其发病机理尚不清楚。CD4+CD8+double-positive T (DPT)细胞被发现近年来发挥重要作用在自身免疫性疾病和病毒感染,但DPT的频率和意义在原发性干燥综合征仍不清楚。本研究发现的频率DPT pSS患者的外周血检测患者的临床指标及细胞因子。然后我们DPT和临床指标之间的相关性分析,细胞因子,与疾病活动的分数。结果表明,外围DPT pSS患者的频率显著高于健康对照组。外围DPT频率与ESR负相关,IgA,免疫球蛋白,周边DPT频率呈正相关,抗炎细胞因子il - 10。分析DPT和pSS疾病活动得分发现,DPT频率与ESSDAI和SSDAI负相关。这项研究表明,外围DPT可能在pSS发挥保护作用。外围的频率DPT细胞可以作为疾病活动的指标。调节外围DPT的表达细胞有望成为pSS的治疗新策略。
1。介绍
原发性干燥综合征(pSS)是一种弥漫性结缔组织病的特点是入侵泪腺体,唾液腺,和其他外分泌腺体,淋巴细胞浸润,特定的自身抗体的存在(anti-SSA /单边带)(1,2]。pSS的第一症状多样,临床表现是复杂的。典型的症状是口干和干眼睛。系统性症状可能包括发烧、疲劳、关节疼痛。pSS还可以包括呼吸系统、血液系统、消化系统和神经系统,导致多系统损害(3]。
有许多异常的pSS患者的免疫功能。淋巴细胞亚群的异常分布和细胞因子的不平衡是重要的机制pSS (4]。T细胞是一个异构可分为CD8细胞群+细胞和CD4+根据不同的细胞表面分化抗原的细胞。外围CD4+CD8+double-positive T (DPT)细胞首先发现了30多年前(5,6]。起初,研究人员认为DPT细胞是一群非功能的细胞。蓝等人报道少量的DPT人类外周血细胞但这群细胞没有引起足够的关注,从研究人员5- - - - - -7]。然而,近年来的研究发现,DPT细胞比例增加在某些病毒感染和自身免疫性疾病,可能参与疾病的进展(8- - - - - -10]。豪等人发现的数量DPT hiv - 1感染患者的外周血细胞显著增加。外围DPT细胞可以持续表达cell-killing-related分子C1.7和穿孔素。此外,DPT细胞也能产生干扰素-γHIV-1-infected病人和肿瘤坏死因子,发挥细胞毒性作用[11]。研究也表明,有一个高比例的DPT细胞系统性硬化症患者的皮肤组织。与CD4阳性T细胞相比,DPT细胞可以产生更多的il - 4和可能参与系统性硬化病的发病机理12]。DPT细胞抑制的产生自身抗体在系统性红斑狼疮(SLE)患者,可能抑制在系统性红斑狼疮疾病进展13,14]。
原发性干燥综合征是一个典型的自身免疫性疾病,但比例和DPT在干燥综合征中的作用仍不清楚。本研究发现外围DPT的频率和分析与临床的相关性参数,血清细胞因子,与疾病活动的分数。本研究也试图探索外围DPT的关系干燥综合征疾病活动和在疾病进展中的意义。
2。材料和方法
2.1。病人和控制
35 pSS患者和35名健康对照组性别和年龄匹配,包括在这项研究中。pSS患者承认南京鼓楼医院从2019年1月至2019年6月。pSS的诊断是基于2002年欧美共识集团(AECG)分类标准15]。性别、年龄、临床表现、实验室发现,pSS患者的治疗策略和其他数据收集和分析。疾病活动计算使用欧拉干燥综合征疾病活动指数(ESSDAI)和干燥综合征疾病活动指数(SSDAI)。pSS患者和健康对照组的临床特点进行了总结表1。这个研究是医学伦理委员会批准的南京鼓楼医院南京大学医学院的。
2.2。流式细胞术
50μL从健康对照组外周血和pSS患者加入流式细胞术管。细胞被沾染了5μL fluorescence-conjugated Abs: PerCP-Cy5.5-conjugated anti-CD3 Ab(美国BD生物科学),FITC-conjugated anti-CD4(美国BD生物科学)和APC-conjugated anti-CD8(美国BD生物科学)。混合后,细胞培养在黑暗中在室温下15分钟,1毫升的血红细胞溶菌作用的解决方案是补充道。裂解后在室温下5分钟,3毫升的染色缓冲区(PBS包含2%的边后卫)被添加到细胞,其次是在1500 rpm 5分钟洗两次。流式细胞仪是用来检测。BD Cellquest软件被用来获取数据通过CD3盘旋+细胞在向前散射光(FSC)和侧散射光(SSC)点的情节。比例的CD4 / CD8 T细胞CD3 double-positive+细胞进一步分析。流数据分析和图形使用Flowjo软件(树明星,美国)。
2.3。ELISA
il - 6的浓度、肿瘤坏死因子、干扰素-γ/ il - 10 / il - 12在健康对照组和pSS患者的血清酶联免疫试剂盒测定的(美国BD生物科学)后,制造商的协议。血清干扰素-α测量使用人类IFN-alpha酶联免疫试剂盒(研发系统、美国)根据制造商的协议。ELISA标仪是用来测量吸光度在450海里。
2.4。统计分析
所有分析使用GraphPad棱镜版本5(美国)。数据表示为媒体和四分位范围Mann-Whitney相比测试。之间的相关性DPT pSS患者的细胞和临床参数测量的皮尔森相关系数。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。频率的增加周边DPT pSS患者的细胞
研究的频率和临床意义DPT pSS患者的细胞,我们使用流式细胞仪检测的频率DPT外周血细胞CD3-positive pSS患者和健康对照组的细胞。图1(一)显示的控制策略和频率DPT细胞典型的pSS患者和健康对照组。结果表明,DPT CD3细胞的比例+pSS患者的细胞明显高于健康对照组(图1 (b))。35 pSS患者中,16日没有收到入学前免疫抑制治疗。我们的研究结果表明,在DPT频率没有显著差异接受免疫抑制治疗的病人和那些没有接受免疫抑制剂治疗之前入学(图1 (c))。我们分析了外围DPT频率和自身抗体之间的关系。结果表明,DPT频率没有显著差异anti-SSA /单边带之间积极的病人和消极的病人。此外,没有外围DPT的频率之间的相关性和抗核抗体的效价(图S1)。
(一)
(b)
(c)
3.2。外围DPT细胞之间的相关性及临床参数
为了澄清外围DPT细胞频率增加的临床意义在pSS患者中,我们发现了有关化学和免疫参数在病人的血清和分析之间的相关性外围DPT细胞频率和这些临床参数。结果表明,外围DPT细胞没有增加的频率随着年龄的病人(图2(一个))。相关分析表明,外围DPT频率与ESR负相关,但不是统计学与CRP, C3和C4(数字2 (b)- - - - - -2 (e))。pSS患者的免疫球蛋白水平高于正常人,与疾病的活动有关。因此,我们还分析了外围DPT的频率之间的相关性和免疫球蛋白。我们发现周边的频率与IgM DPT细胞没有相关性,但与IgA的水平和免疫球蛋白(负相关数据2 (f)- - - - - -2 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.3。细胞因子水平升高在pSS患者的血清
细胞因子是T细胞功能的重要方法之一。我们发现各种细胞因子的表达水平在pSS患者和健康对照组的血清用ELISA。这是发现,il - 6的水平,TNF -α干扰素-α、il - 12、il - 10在pSS患者明显高于健康对照组(数字3(一个)- - - - - -3 (f))。这是符合增加pSS患者血清细胞因子在先前的报道16]。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。外围DPT细胞频率呈正相关,il - 10的水平
为了进一步分析周边的可能角色DPT pSS患者的细胞,我们分析了频率外围DPT细胞和血清细胞因子之间的相关性。结果表明,周边DPT频率没有相关与il - 6、TNF -α干扰素-γ干扰素-α和il - 12(数字4(一)- - - - - -4 (e)),但它与抗炎细胞因子il - 10(图有正相关4 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。循环DPT细胞的频率与ESSDAI / SSDAI负相关
ESSDAI和SSDAI常用临床pSS疾病活动的分数。在这项研究中,患者根据临床症状和检测指标得分pSS患者住院时,ESSDAI / SSDAI成绩之间的相关性和外周血DPT水平进行了分析。如图5从研究结果发现,pSS患者的外周血DPT水平与ESSDAI和SSDAI分数负相关,这表明DPT细胞可能发挥保护作用的发病和进展pSS。
(一)
(b)
4所示。讨论
干燥综合征是一种慢性炎症性自身免疫性疾病,会影响多个系统。主要入侵外分泌腺,也可以涉及nonexocrine腺组织。外围DPT细胞是一群细胞,一直被忽视,但被发现在病毒感染和自身免疫性疾病近年来。外围DPT的频率和作用细胞干燥综合征患者目前未知。本研究发现的频率DPT pSS患者的外周血细胞和分析与临床参数的相关性。发现DPT pSS患者的细胞的频率显著高于健康对照组。此外,DPT细胞的频率与ESR负相关,IgA,免疫球蛋白,ESSDAI,与细胞因子il - 10和SSDAI,呈正相关。这项研究还显示,DPT pSS患者细胞升高和pSS患者可能有保护作用。
在胸腺中T细胞的发展,有一个阶段的双CD4和CD8阳性。然而,由于正面和负面的选择由细胞、成熟T细胞进入末梢循环是CD4和CD8阳性细胞(17]。关于外围DPT细胞的来源,研究表明,阳性T细胞可以诱导刺激成为double-positive细胞体外。蓝色的和他的同事们分离和纯化CD4+CD8- - - - - -和CD4- - - - - -CD8+T细胞在体外。与ConA刺激这些细胞纯化后,他们发现阳性T细胞可以产生CD4 / CD8 double-positive T细胞(5]。此外,Paliard和他的同事们发现,il - 4的体外能促进从头合成纯化CD4阳性T细胞(CD8受体的18]。这个过程是完全依靠il - 4的存在。il - 10和il - 4都是抗炎细胞因子(19]。在这项研究中,发现周边的频率DPT细胞呈正相关,il - 10。因此,il - 10可能也是一个因素,诱发阳性T细胞分化成DPT细胞。因为本研究主要集中在临床意义DPT pSS患者的频率增加,并没有进一步探索DPT的来源,这是本研究的一个限制。研究表明,外围DPT细胞高表达ab T细胞受体,CD45RO和CCR7,因此属于中央记忆T细胞。HLA-DR和CD56的表达高于外围DPT细胞CD4阳性T细胞,但DPT细胞不表达iNKT标记(20.]。因为DPT的表型细胞已经在文献中报道,表型并没有研究研究。
细胞因子发挥重要作用在pSS的发生和发展。这项研究测试了多种细胞因子il - 6、TNF-a,干扰素-γ干扰素-α、il - 12、il - 10。其中,白介素、干扰素-α、il - 12、il - 10明显高于健康对照组,这与先前的研究一致(16]。我们分析了外围DPT细胞和细胞因子之间的相关性,发现外围DPT细胞只与il - 10水平呈正相关。il - 10是一种可以调节免疫耐受和免疫抑制细胞因子肿瘤免疫逃避和在抗炎也起着关键作用。可以由巨噬细胞il - 10, Breg,一些T细胞如Treg [21,22]。在这项研究中,患者的血清il - 10水平pSS是增加的,这是与外围DPT的程度呈正相关,表明DPT可能产生il - 10的免疫抑制功能。DPT细胞是否可以直接产生il - 10和pSS患者在抑制炎症中发挥作用需要进一步研究。
外围DPT细胞的功能可能是不同的在不同的疾病。在艾滋病毒感染,DPT细胞高度增殖和活性效应细胞,和他们的扩散和影响能力强于阳性T细胞(23]。T细胞CD4 / CD8 DP的频率在黑色素瘤显著增加。这些DPT细胞细胞因子有一个独特的和有体外抗肿瘤活性24]。然而,在转移性结直肠癌的研究,DPT细胞被认为促进肿瘤生长、转移和表达下调免疫反应结直肠癌(25]。DPT细胞被认为是自身免疫性疾病的免疫抑制作用。在系统性硬化症,DPT病人的皮肤组织的细胞可以产生高水平的il - 4对免疫抑制功能(12]。DPT也存在于肠上皮细胞层细胞在炎症性肠病,并能抑制肠道炎症Th1-induced IL-10-dependent地(26]。在系统性红斑狼疮患者,DPT细胞被认为是抑制自身抗体的生产。然而,在这项研究中,我们没有发现显著相关性DPT细胞和SSA /单边带/ pSS患者的安娜,和更多的样本可能需要包括澄清这一点。在这项研究中,外围DPT pSS患者的频率增加,这是负相关ESR和免疫球蛋白,呈正相关,抗炎细胞因子il - 10和与疾病活动分数负相关,这表明了外围DPT具有免疫抑制功能,起着保护的作用在疾病的发生和发展。
总之,外围DPT pSS患者的频率显著增加在这个研究。相关分析与临床参数、细胞因子和疾病活动成绩表明,DPT pSS患者的细胞具有免疫抑制效应。DPT细胞可能作为潜在的治疗pSS策略或缓解炎症的症状。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
西南和JW进行实验。HS和BB分析数据。SW写的手稿。瞬设计研究和修改后的文章。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81601765和81601765),江苏省博士后科学基金会(1601155 b),和南京医学科学技术发展基金会(QRX17142)。
补充材料
图S1:外围DPT频率和自身抗体之间的相关性。比较外围DPT频率之间SSA /单边带病人积极的和消极的。误差线表示中位数和四分位范围(a)。外围DPT频率和抗核抗体效价之间的相关性(b)。(补充材料)