文摘

背景。2019年新型冠状病毒SARS-CoV-2全世界引发了大量的COVID-19爆发。COVID-19类似于社区获得性肺炎(CAP)。我们的目标是识别淋巴细胞亚种群区分COVID-19和帽子。方法。我们比较296年外周血淋巴细胞及其子集COVID-19患者和130例帽。参数独立预测COVID-19被逻辑回归计算。结果。主要的淋巴细胞亚群(CD3⁺CD4⁺,CD16⁺CD56⁺,CD4⁺/ CD8⁺比)和细胞因子(TNF -α和干扰素-γ)COVID-19患者明显不同于帽的病人。CD16⁺CD56⁺%,CD4⁺/ CD8⁺比,CD19⁺和CD3⁺CD4⁺被确定为通过逻辑回归预测COVID-19诊断。此外,CD3⁺CD4⁺计数,CD3⁺CD8⁺计数,andTNF -α患者的疾病严重程度的独立预测指标。结论。淋巴细胞减少是SARS-CoV-2感染的一个重要组成部分,淋巴细胞和细胞因子子集可能是有用的预测疾病的严重程度和临床结果。

1。介绍

COVID-19是一种新兴的疾病感染率高,发病机制不明疾病进展迅速,发病率相对较高的死亡率。COVID-19影响了许多国家,与世界卫生组织(世卫组织)报告122536880 March21确诊病例和2703780例死亡,2021年,在全球范围内(1]。

最早期的报告是机密案件COVID-19基于临床病例定义,但是具体的实验室确认后可以识别SARS-CoV-2的病原体(2]。COVID-19流行全球激增,研究人员正努力了解一个重要的流行病学谜感染者的比例有轻微或没有症状,可能将病毒传递给他人。一些初步和详细的估计这些秘密情况下表明他们可能约占60%的感染(3]。症状COVID-19似乎引起类似于社区获得性肺炎(CAP)的其他原因,如发烧、咳嗽、气短、呼吸困难、胸闷、腹泻(4,5]。区分COVID-19和其他原因的限制是COVID-19暴发的主要挑战之一。我们组和其他人之前报道的大量血液异常COVID-19 [5- - - - - -8]。突出在异常淋巴细胞减少;虽然,淋巴细胞亚群在大多数研究尚未报道。

在这项研究中,淋巴细胞亚群检测296年一群COVID-19病人和130个帽的病人。本研究的目的是评估的能力区分COVID-19和淋巴细胞和细胞因子子集的帽子。

2。材料和方法

2.1。病人和数据收集

296年从Feb1 COVID-19患者呈现给我们医院,2020,Mar10, 2020。所有患者SARS-CoV-2感染实时rt - pcr实验室确认。帽组包括130名患者从2019年1月至2019年11月访问了我们医院。入选标准包括以下几点:(一)肺炎被定义为肺浸润和一个或多个下列症状:发烧( ),有或没有咳嗽痰放电、呼吸困难或呼吸的变化通过听诊声音;(b)完整的患者淋巴细胞亚群的记录;和(c)医院的病人。排除标准如下:(a)患者临床淋巴细胞缺乏数据子集和(b)门诊病人。在那段艰难的时期,244年(82.4%)COVID-19在家病人服用抗病毒药物,但没有COVID-19患者接受immunomodulating药物之前访问了医院。所有的COVID-19患者接受血液采样后出现症状。病人的临床收集的数据是通过武汉大学中南医院的伦理委员会。道德委员会放弃书面知情同意新兴传染病。

2.2。淋巴细胞亚群检测

从每个病人空腹全血收集无菌通过静脉穿刺到乙二胺四乙酸(EDTA)集合管的量化主要淋巴细胞亚群。全血与BD Multitest孵化6色TBNK试剂,然后细胞溶解与BD流式细胞仪™赖氨酸的解决方案。淋巴细胞亚群与BD FACSCanto临床获得和分析软件。的BD Multitest 6色TBNK试剂包含以下抗体识别和计数不同的淋巴细胞亚群:CD3 FITC用于T淋巴细胞识别、CD16和CD56 PE NK淋巴细胞识别、CD45 PerCP-Cy™5.5人口淋巴细胞识别、CD4 PE-Cy™7辅助/诱导淋巴细胞识别和CD19 APC B淋巴细胞识别、和CD8 APC-Cy7抑制/毒性T淋巴细胞识别子集。最终结果可以很容易地观察到在流式细胞术模板,我们建立了(图1(一))。

通常,我们20吸管μL (BD Multitest 6色TBNK试剂到BD Trucount管的底部,然后吸管50μL的混合,实际上全血管的底部。帽管和涡轻轻混合其次是孵化15分钟在黑暗中在室温(20°C-25°C)。我们增加450μL 1 x BD流式细胞仪赖氨酸解决管和孵化管在室温下15分钟在黑暗中。样品在流式细胞分析仪进行分析。绝对计数软件计算了BD FACSCanto临床使用以下公式。

这个值被发现在BD Trucount管铝箔袋标签和可以从很多很多不同。

2.3。细胞因子分析

这种方法涉及到多路复用仪珠阵列(CBA) 6种细胞因子的定量分析,包括肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、移行细胞(IFN -γ)、白介素- 2、il - 4和il - 10。影城CBA执行根据制造商的指示。简单地说,25μL血清与同等体积的混合捕获珠子和孵化25μL PE-binding抗体在黑暗中在室温为2.5小时。珠子被离心机在200 g 5分钟,和上层清液轻轻吸气,复苏与磷酸盐缓冲盐水(PBS) (100μL)。CBA解决在流式细胞分析仪(BD)和分析临床软件。最终结果可以很容易地观察到的流式细胞术模板建立了(图1 (b))。

2.4。统计分析

使用SPSS统计分析(22.0版本,SPSS, Inc .,芝加哥,美国)。统计分析的结果都使用了学生 - - - - - -测试。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

296 COVID-19患者(152名男性与144名女性),平均年龄为53年和130帽患者(80名男性和50名女性),平均年龄为50年,武汉大学中南医院住院,都参加了这项研究。130帽患者中,76例(58.5%)患者细菌性肺炎、31(23.8%)病毒性肺炎,5例(3.8%)患者真菌性肺炎、5例(3.8%)患者支原体肺炎,和13例(10.0%)患者pneumocystosis或其他感染。淋巴细胞亚群指数的平均值COVID-19病人和限制患者证明表1和数字1和2。CD19的平均值⁺%和CD3⁺CD8⁺% COVID-19患者患者明显低于上限。CD3的平均值⁺CD4⁺,CD16⁺CD56⁺,CD3, CD4 / CD8比值⁺CD4⁺%,CD16⁺CD56⁺% COVID-19患者明显高于帽。患者CD3的平均值⁺,CD19⁺和CD3⁺CD8⁺没有显著COVID-19组和帽组之间的不同。

在轻度组(71帽和257 COVID-19), COVID-19患者显示CD19下降⁺,CD3⁺CD8⁺%,CD3增加⁺CD4⁺%,而盖的病人。同样,在严重的患者(59帽和39 COVID-19), COVID-19患者CD3增加⁺CD4⁺%和CD3下降⁺CD8⁺%,而盖的病人(图3)。

患者淋巴细胞亚群异常的比例如表所示2。COVID-19病人和帽患者淋巴细胞减少。更高比例的上限患者CD3显示减少⁺,CD3⁺CD4⁺,减少CD16⁺CD56⁺,减少CD4⁺/ CD8⁺比,增加CD19⁺%,CD3正常⁺CD4⁺%与COVID-19病人。逻辑回归分析表明,实验室指标可以独立区分COVID-19和帽。口服补液盐的因素来预测COVID-19和帽子都在表中显示了3,CD16⁺CD56⁺%,CD4⁺/ CD8⁺比,CD19⁺和CD3⁺CD4⁺独立辨别COVID-19帽。此外,CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺数量是独立预测疾病的严重性COVID-19组和联合COVID-19帽组(表4)。

在这项研究中,我们还分析了6种细胞因子数据92年COVID-19患者和38帽患者(数字1 (b)和4)。肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ较低水平COVID-19病人与帽子患者相比。然而,我们发现干扰素-γ与CD8水平并不相关⁺细胞毒性T淋巴细胞在COVID-19患者基于数据库的分析,表明降低干扰素-γ不是由于CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(图3(左))。il - 6, 2、il - 4和il - 10,我们并没有发现两组之间的显著差异。Logistic回归分析显示,肿瘤坏死因子-α独立辨别COVID-19患者的疾病严重程度(表5)。

4所示。讨论

COVID-19和免疫系统之间的相互作用是复杂的。在最近的研究中,淋巴细胞和细胞因子子集COVID-19和帽检查病人。相当一部分COVID-19患者淋巴细胞减少的亚种。这项研究证实了淋巴球减少症中观察到的大部分其他一系列COVID-19例(5- - - - - -7]。这里讨论的数据扩展这些观察,表明CD3⁺CD4⁺和CD16⁺CD56⁺淋巴细胞计数较高但TNF -α和干扰素-γ低COVID-19患者相比帽的病人。

目前最常用的淋巴细胞亚群检测,包括T淋巴细胞(CD3⁺),B淋巴细胞(CD19⁺)、NK细胞(CD16^{+ 56 +}),辅助T淋巴细胞(CD3⁺CD4⁺),抑制T淋巴细胞(CD3⁺CD8⁺)。T和B淋巴细胞百分比和绝对数量和辅助的比例/诱导与抑制细胞毒性T细胞提供有价值的信息在患者免疫状态的条件(7]。辅助T淋巴细胞细胞可以帮助B细胞分泌抗体和调节其他T细胞的免疫反应(9]。它可以释放- 2,干扰素-γ、il - 4和其他细胞因子激活巨噬细胞和NK细胞(10]。抑制T淋巴细胞细胞通常表现为细胞毒性活动和主要的细胞毒性效应细胞。作为主要身体的自然免疫系统的免疫细胞,NK淋巴细胞已被证明是某些肿瘤和病毒的细胞毒性11,12]。分泌抗体和中介的体液免疫应答的主要功能是B淋巴细胞。激活B淋巴细胞可以分泌抗原,诱导T细胞免疫力。

淋巴细胞减少是COVID-19的一个重要组成部分,淋巴细胞计数可用于预测疾病的严重程度和临床结果。总淋巴细胞减少和子集也发生在其他人类SARS冠状病毒感染13]。实验在人类冠状病毒229 e感染导致淋巴细胞减少(14]。COVID-19淋巴球减少症可能归因于直接从SARS-CoV-2病毒入侵和破坏的淋巴细胞。然而,研究表明人类的COVID-19受体可能是血管紧张素转换酶2 (ACE2) [15]。ACE2的功能细胞受体SARS-CoV-2但不表达B和T淋巴细胞(16,17]。这表明,淋巴细胞减少COVID-19并不直接感染和被SARS-CoV-2,需要进一步研究。

其他可能的解释为淋巴细胞减少淋巴细胞在肺隔离SARS-CoV-2损害最为明显(18),或cytokine-mediated改变淋巴细胞运输(7]。冠状病毒229 e可以诱导细胞凋亡的单核细胞/巨噬细胞在体外(19]。目前尚不清楚不同菌株的SARS-CoV-2诱导淋巴细胞凋亡。SARS-CoV-2-induced免疫抑制可能容易继发感染,尤其是重症患者,仍有待决定是否有任何长期影响体液或细胞介导的免疫反应。

我们的研究结果表明,淋巴细胞功能子集,特别是CD16⁺CD56⁺%,CD4⁺/ CD8⁺比,CD19⁺和CD3⁺CD4⁺独立预测COVID-19帽,CD3的分化⁺CD4⁺,CD3⁺CD8⁺计数,TNF -α是疾病严重程度的独立预测指标。因此,检测淋巴细胞和细胞因子子集的发病机制提供了新的见解COVID-19帽,这有助于了解患者的免疫功能,值得推广应用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

Guohong刘和湘江泽民的贡献同样这项工作,应该视为co-first作者。

确认

我们承认所有卫生保健工作者参与诊断和治疗的病人在武汉。