文摘

背景。产妇补充1α,25-dihydroxyvitamin D3 (VD3)已经通过多个途径免疫对胎儿发育的影响。本研究旨在调查的影响VD3补充免疫失调的后代在过敏性鼻炎。方法。不同剂量VD3以及控制给出了怀孕的雌性老鼠。卵清蛋白(OVA)挑战和氢氧化铝凝胶在无菌生理盐水被用来诱发后代小鼠过敏性鼻炎。鼻灌洗液体收集(NLF),嗜酸性粒细胞数在NLF 24小时后卵子的挑战。Th1、Th2 Th17, Treg subtype-relevant细胞因子,包括干扰素-γ、il - 4、il - 10、IL-17 TGF -β,OVA-IgE后代小鼠血液和独立的水平,被检测到的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。通过流式细胞术Treg亚型分析。Treg细胞纯化从后代,过继转移到OVA-sensitized后代外源的老鼠。结果评估在同种异体的后代。结果。补充我们的数据表明,VD3显著减少嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞、淋巴细胞在外周血和独立。CD4细胞的比例⁺CD25⁺FoxP3⁺亚与VD3正相关剂量依赖性的方式。血清IgE水平、il - 4和IL-17下降,而干扰素的表达γ、il - 10和TGF -βVD3补充组明显增强。过继转移CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚VD3补充组织提升Th1和抑制Th2反应在过敏性鼻炎的后代。结论。我们的研究结果表明,低剂量VD3供应怀孕的老鼠的饮食抑制Th2和Th17反应过敏性鼻炎升降Th1亚型和CD4细胞的比例⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群的后代。它表明,低剂量VD3供应可能有可能作为治疗过敏性鼻炎的新策略。

1。介绍

变应性鼻炎(AR)是最常见的一种过敏性疾病的患病率逐渐增加,影响36% - -40%的儿童和-30%的成年人(10%1,2]。基于“增大化现实”技术是一种过敏性疾病由特定的IgE过敏原,特点是一个破坏性的Th1平衡(辅助T 1型)/ Th2细胞因子(T辅助2型)和Th2扭曲(3]。虽然环境因素和遗传易感性都证实了基于“增大化现实”技术的发展发挥了关键作用[4),其确切的发病机制仍不明。

1α25-Dihydroxyvitamin D3 (VD3)最初是在骨代谢特征的作用,但最近的研究证实,它还可以调节各种免疫细胞和多发地的功能细胞,包括单核细胞、树突状细胞、T和B淋巴细胞,上皮细胞,等等5]。此外,VD3受体也被发现在几乎所有的研究。大多数的研究也可以通过表达维生素D转化为VD3 VD3-activating酶(6,7]。

最近的研究调查VD3水平之间的关系和基于“增大化现实”技术的发病率8,9]。发现AR发病率下降VD3水平增加(10]。挪威的一项研究发现类似的结果在女性在男性(但交谈的结果11]。然而,其他研究显示,没有VD3水平和AR的发病率之间的联系被发现(12]。因此,VD3水平和AR发生率之间的关系尚不清楚,以及VD3在AR的作用似乎更加复杂。妊娠期缺VD3在大多数国家是相当普遍。据报道,孕产妇VD3地位在怀孕期间可能会影响后代的发展中免疫系统(13]。例如,一些研究表明,产妇VD3从孕期食物摄入量减少基于“增大化现实”技术的风险小于5岁的儿童(14,15]。然而,其他报告显示,孕妇摄入VD3没有任何影响儿童发病率的基于“增大化现实”技术(16),甚至在成年期(增加AR的发病率17,18]。显然,VD3产妇在怀孕期间摄入之间的关系及其后代的基于“增大化现实”技术的发病率应该得到进一步的实验证实。

CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群细胞已被证明是至关重要的在维护免疫反应和T细胞内稳态,而抑制Th2反应过敏的条件(19]。低剂量VD3可以促进CD4细胞的增殖⁺CD25⁺FoxP3⁺亚诱导抗原宽容在免疫介导的条件20.]。正如我们所知,幼稚T细胞可以改变成不同的亚型Th1、Th2, Th17, Treg在不同的培养条件(21,22]。Th1、Th2 Th17, Treg描述特定的转录因子和细胞因子,T-bet和干扰素-γTh1、Th2 GATA-3和il - 4, RoRγt和白介素对Th17 Foxp3 CD25 Treg。因此,VD3补充可能会扰乱这些T淋巴细胞亚型之间的平衡。

基于这些先前的研究,我们假设低剂量VD3可能抑制Th2反应在基于“增大化现实”技术的提升CD4过敏原⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群。在这项研究中,怀孕的雌性老鼠补充低剂量的不同VD3第一;Th1、Th2和Th17过敏原在后代小鼠评估的反应;和CD4的数量和能力⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群在后代小鼠。本研究的目的是调查的最佳剂量VD3作为成功怀孕的老鼠的饮食补充减少后代的过敏性鼻炎发病率通过调节T淋巴细胞功能。

2。方法

2.1。动物和试剂

总共25八周大的雌性BALB / c小鼠购买动物资源中心(中国南京)。动物生长在一个恒温的环境 ,与常规12小时光/暗周期。卵清蛋白(OVA)和VD3从σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒对鼠标VD3, il - 4、il - 10,干扰素-γ、IL-17 TGF -β,OVA-IgE获得Abcam(美国Cambridge, MA)。鼠标Treg流工具包(FOXP3 Alexa萤石®488 / CD4 APC / CD25 PE)从BioLegend购买,圣地亚哥,CA。

2.2。交配、分娩、后代、动物模型的制备

与雄性交配的雌性老鼠被允许2:1比例,交配是证实通过观察阴道涂片。雌性老鼠在涂片显示精子分离检测,那天,这被认为是妊娠期天(GD) 0。的那一天下午4点以前出生的老鼠被指定为产后一天(PND) 0。后代老鼠仍在患产后抑郁症的母亲,直到断奶21。25怀孕的雌性老鼠被随机分为5组( )。对照组接受皮下注射1毫升0.9%生理盐水;50,100 ng, 150 ng和200 ng VD3组相应给50 ng, 100 ng, 150 ng, 200 ng(1毫升0.9%生理盐水稀释,等于100,200,300,和400 IU /公斤/每天)VD3怀孕期间每天皮下注射一次。血从怀孕的雌性老鼠测试获得的水平在GD VD3 0, 1, 12, 25岁。

2.3。对后代小鼠致敏和挑战

建立过敏性鼻炎小鼠模型,六个孩子第一次致敏的腹腔内注射50μg卵子和5毫克氢氧化铝凝胶在无菌生理盐水从0到2。系统性的敏化后,老鼠在本地受到鼻内滴注法与50μg卵子和50μL磷酸盐(PBS)到他们的鼻孔从7天12。最后的挑战后,打喷嚏和鼻子摩擦行为的频率记录至少15分钟。

2.4。鼻灌洗液中嗜酸性粒细胞计数

鼻灌洗液体(NLF)最后24小时后收集鼻内挑战用无菌盐水通过肺灌洗技术与卵子。细胞总数在NLF测定重复血细胞计数器。嗜酸性粒细胞是沾Wright-Giemsa和500个细胞数在总从每个样本的放大×200(油浸)。

2.5。血清OVA-Specific IgE和细胞因子检测外周血和鼻粘膜组织

血液(0.1毫升),鼻粘膜组织收集的老鼠的后代。血清得到从血液通过在每分钟3000转离心(rpm) 10分钟4°C。鼻粘膜匀浆、离心10分钟每分钟3000转4°C,和收集上层的细胞因子检测。水平的il - 4、il - 10,干扰素-γ,OVA-IgE外周血和鼻粘膜组织由酶联免疫试剂盒进行评估。

2.6。CD4的分析⁺CD25⁺FoxP3⁺亚通过流式细胞术

流式细胞术分析是根据制造商的指导方针。简而言之,脾脏从后代处理脾细胞做准备。鼠标Treg流工具被用来收集和丰富CD4双染色⁺T细胞与fluorescence-conjugated抗体(CD25-phycoerythrin和CD4-allophycocyanin);然后,这些细胞被沾Alexa萤石488 -共轭FoxP3抗体。CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚被流式细胞术分析。

2.7。CD4细胞的过继转移⁺CD25⁺FoxP3⁺亚成OVA-Sensitized外源的后代

简单地说,CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚从后代在每组和净化 细胞resuspended 0.2毫升0.9%生理盐水,然后通过尾静脉过继转移相应的群OVA-sensitized外源的后代。24小时后,同样的结果评估外源的后代。

2.8。统计分析

所有统计分析使用GraphPad Prism 5.0(美国圣地亚哥,CA)和SPSS 21.0版(美国芝加哥,IBM Inc .)。数据表示为 。统计学意义的妊娠期补充天和血清水平VD3政府与Bonferroni事后计算使用双向方差分析测试。独立样本测试是用来比较每个VD3组和对照组之间。皮尔森相关分析是用于确定上述参数之间的相关性。 , ,和 被认为是具有统计学意义。

2.9。伦理批准和同意参与

所有动物保健和实验协议机构批准的动物保健和使用委员会(韩国仁荷150309-351-2)。这项研究是经当地伦理委员会批准的杭州第一人民医院,中国(批准ID: 201710701)。

3所示。结果

3.1。血清水平VD3怀孕的老鼠

怀孕小鼠血清VD3水平VD3注入不同剂量后如图1。我们发现怀孕的老鼠的VD3水平基线GD0和GD1相同。怀孕期间,对照组VD3浓度持续下降;然而,它在所有VD3群体稳定增加。与对照组相比,血清VD3水平VD3 GD0和GD1组没有显著差异。然而,在GD12和GD25显著差异被发现。此外,VD3的水平在怀孕的老鼠增加补充时间和浓度VD3-dependent的方式。

3.2。VD3产妇补充影响免疫反应的后代在基于“增大化现实”技术

探讨VD3产妇补充对免疫反应的影响,我们测量外周血免疫细胞概要文件的老鼠的后代。结果如图2(一个)- - - - - -2 (f)。总白细胞、中性粒细胞,嗜酸性粒细胞,嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞显著减少VD3剂量依赖性的方式。我们进一步发现干扰素-的水平γ、il - 4、il - 10、IL-17 TGF -β在外周血,IgE ELISA(图3)。发现干扰素-的水平γ、il - 10和TGF -β在后代小鼠的外周血和VD3管理局(数据显著升高3(一个),3 (c),3 (e))。相比之下,il - 4和IL-17水平明显下降VD3剂量依赖性的方式(数字3 (b)和3 (d))。我们还发现有IgE之间的正相关和外周血il - 4水平VD3补充剂量(图3 (f))。

3.3。CD4细胞的比例⁺CD25⁺FoxP3⁺亚VD3治疗组的后代通过流式细胞术

此外,我们还分析了CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺通过流式细胞术亚群。与对照组相比,CD4细胞的比例⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群是升高(数据4(一)- - - - - -4 (e))。也有CD4之间的正相关关系⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群比例和VD3补充剂量(图4 (f))。

3.4。过继转移CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群的后代VD3组降低血清IgE, Th2和IL-17细胞因子和增加Th1细胞因子在OVA-Sensitized外源的后代

调查是否补充维生素D3孕产妇对免疫调节的影响取决于Treg细胞,我们CD4转移⁺CD25⁺FoxP3⁺亚从VD3团体OVA-sensitized外源的后代。后CD4细胞的过继转移⁺CD25⁺FoxP3⁺亚他生的后代,有一个积极的亚群的数量之间的相关性和干扰素-γil - 10或TGF -β在外周血(数字5(一个),5 (d),5 (e))或独立(数字5 (f),5(我),5 (j))从VD3组与对照组相比。相比之下,在外周血il - 4水平和IL-17(数字5 (b)和5 (c))和国家(数据5 (g)和5 (h))有负相关过继转移Treg细胞数量增加VD3-treated组与对照组相比。我们进一步探讨干扰素-之间的关系γ、il - 4、il - 10, IL-17 TGF -β细胞因子在Treg细胞过继转移(图6)。结果表明,il - 4和干扰素- IL-17水平γ有负相关(数据6(一)和6 (c))Treg VD3-treated小鼠细胞过继转移组。相比之下,干扰素-之间的正相关关系γ和il - 10或TGF -β(数据6 (b)和6 (d))。我们还发现,il - 4和il - 10(图之间的负相关6 (e))、il - 4和TGF -β(图6 (g)),il - 10和IL-17(图6 (h)),TGF -β和IL-17(图6 (j))Treg-transferred老鼠。有一个积极的il - 4和IL-17(图之间的相关性6 (f))和il - 10和TGF -β(图6(我))。结果表明,Treg细胞转移提升Th1,但抑制Th2和Th17细胞的发展。

4所示。讨论

尽管VD3之间的关系和临床结果已确定,有更少的阐明底层的进展在活的有机体内这种关联的生物机制。在这项研究中,我们发现,对照组孕期VD3逐渐减少,而VD3逐渐增加在所有VD3组。这种现象在补充摄入量有关时间和VD3的浓度。因此,产妇在怀孕期间补充VD3可以显著提高血清VD3水平。

几项研究在体外发现VD3可以直接促进成熟b细胞凋亡(7]。此外,VD3也可能抑制抗原b细胞增殖和分泌抗体。Milovanovic等人证明VD3抑制IgE生产由b细胞(23]。另一项研究也报道了VD3补充在断奶显著降低血清IgE水平(13]。在我们的研究中,我们还证实,在外周血血清IgE水平显著下降的后代VD3组与对照组相比。相反,Matheu等人报道,IgE生产增加小鼠过敏性呼吸道疾病,治疗早期VD3 [24]。有趣的是,Drozdenko等人发现,没有明显差异的频率抗体分泌浆细胞和血清免疫球蛋白浓度在人类VD3摄入量(25]。同样,我们的研究结果还发现,母亲怀孕期间VD3供应水平显著降低血清IgE后代的剂量依赖性的方式。此外,血清IgE水平与il - 4和IL-17水平正相关和负相关,il - 10, TGF -β和干扰素-γ水平的后代。正如我们所知,干扰素-γ分泌il - 4,和IL-17 Th1、Th2, Th17,分别26,27]。我们的结果显示,VD3可能促进Th1,但抑制Th2和Th17细胞的发展。

据报道,VD3可能检测不到发炎招募嗜酸性粒细胞迹象网站通过调节C-X-C趋化因子受体类型4表达[28]。El-Shazly和Lefebvre证明VD3调制一种新型炎症相声NK细胞和嗜酸性粒细胞之间通过IL-15 /引发轴(29日]。犬吠等人也证实VD3监管肥大细胞功能和发挥了抗炎效果在体外和在活的有机体内(30.]。与VD3 Matheu等人报道,早期治疗显著改善嗜酸性粒细胞浸润在支气管肺泡灌洗液和肺组织水平低劣的IL-5 [24]。另一项研究也报道了VD3供应(断奶显著降低的肺嗜酸细胞增多症13]。在我们的研究中,我们还证实,怀孕期间产妇VD3供应明显减少嗜酸性粒细胞,中性粒细胞,嗜碱粒细胞、淋巴细胞和单核细胞在外周血和NLF后代的方式存在剂量依赖的相关性有统计学差异。这个结果表明,VD3管理可以显著减少IgE分泌细胞。

研究显示一个明确的功效的食物补充VD3救援的季节性过敏性鼻炎的症状和体征,减少抗过敏药药物的消费(31日]。与致敏小鼠相比没有特定免疫疗法或特定免疫疗法,il - 4的水平减少VD3 +特定的免疫疗法(32]。围产期VD3缺乏单独促进Th2扭曲和减少IL-10-secreting T调节细胞。此外,围产期VD3不足导致哮喘严重程度较差在新生儿嗜酸性炎症和气道重塑。重要的是,补充以VD3改善这两种病理异常(13]。在我们的研究中,发现了相同的结果在怀孕期间产妇VD3供应明显增加Th1细胞因子干扰素-γ水平和减少Th2细胞因子il - 4和IL-17 Th17细胞因子水平的后代剂量依赖性的方式。Ozkara等人报告了类似的结果,与il - 4水平VD3水平呈负相关和正相关与干扰素-γ水平与过敏性鼻炎鼻息肉病病人在一起(33]。CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚已确认扮演一个关键角色在过敏性疾病,如哮喘、花粉热、过敏性鼻炎(34]。CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群能够抑制Th2反应过敏原过敏状况(35]。VD3和Foxp3之间的正相关关系⁺亚群的航空公司在一次严重的小儿哮喘组。同样,在体外VD3可以选择性地扩大Foxp3⁺亚[20.]。另一方面,VD3-induced il - 10生产T细胞和il - 10一起VD3也充当了一个积极的自分泌因子进一步il - 10的生产(36]。VD3也促进监管通过代耐受性抗原呈递细胞免疫途径和具体⁺亚群或il - 1037]。在我们的研究中,我们证实在活的有机体内绝对的CD4细胞数量⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群后代从怀孕小鼠不同剂量的VD3非常高剂量依赖性的方式。此外,CD4细胞的比例⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群有正相关,il - 10, TGF -β和干扰素-γ与il - 4水平,和一个负相关,IL-17, IgE水平的后代。此外,我们研究了细胞因子的表达外源的后代过继转移CD4之后⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群细胞VD3补充的后代。我们的研究结果表明,VD3加强CD4细胞的能力⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群抑制Th2和Th17反应,增强Th1反应。这些结果进一步澄清说,孕妇在怀孕期间补充VD3的影响依赖于CD4免疫调节⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群。我们的结果与戈尔曼和Vijayendra报告的结果一致在体外和在活的有机体内(38]。目前的研究表明,低剂量VD3补充怀孕期间可能会抑制Th2反应,提高Th1反应OVA-induced基于“增大化现实”技术的提升CD4的绝对数量和加强的能力⁺CD25⁺FoxP3⁺亚群的后代。建议有浓度过敏原特异性CD4 VD3补充或扩张⁺CD25⁺FoxP3⁺亚有可能基于“增大化现实”技术是一种新的治疗策略。

5。结论

我们的研究结果显示,VD3和免疫系统之间的关系;VD3和过敏性疾病在活的有机体内不符合这些在体外。补充的能力VD3导致临床改善可能随药物剂量或对不同人群有不同的影响。VD3可以显著提高Treg细胞数量和可能促进Th1但抑制Th2和Th17细胞生产。

数据可用性

所有数据进行了收集和分析在双盲,他们支持的附属杭州第一人民医院、浙江大学医学院。我们将提供原始数据在任何时候,如果必要的。海丰倪博士和李勇负责数据。

伦理批准

我们要感谢杭州第一人民医院的机构审查委员会协助获取知情同意在这项研究中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

张液体和海丰倪了同样的工作。

确认

本研究是医疗卫生基金会赠款支持项目浙江,中国(格兰特数字:2015 kyb294, 2020 ky689, 2021 ky870)。