DGAT1表达促进卵巢癌进展和与不良预后相关

文摘

背景。卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最致命的。由于其隐性发病,发展迅速,预后不良,卵巢癌是第五个女性最常见的死因。虽然immunotherapy-related药物,如Olaparib,可以减轻卵巢癌进展,没有显著的突破为其有效的治疗方法。认为正常细胞癌变的变换的某些代谢途径包括“重新编码”。二酰基甘油O-acyltransferase 1 (DGAT1)可以通过转移酰coa甘油二酯,合成甘油三酯在脂质合成中发挥着关键作用。然而,DGAT1在卵巢癌中的作用尚未阐明。材料和方法。我们分析DGAT1之间的相关性和卵巢癌分期,分级、血管侵犯,卵巢癌预后的信息整理标本癌症基因组图谱(TCGA)数据库。此外,DGAT1表情扩散的影响,移民,入侵,肿瘤的生长进行了研究使用卵巢癌细胞系。GSEA被用来分析KEGG通路和生物功能丰富,因为DGAT1表达在卵巢癌。结果。发达(DGAT1的表达升高 ),低分化( ),和血管入侵( )卵巢癌的标本。患者预后之间的高表达DGAT1较差。DGAT1表达干扰后,增殖,迁移,侵略,卵巢癌细胞的集落形成,肿瘤生长被抑制了。此外,GSEA表明DGAT1可能参与免疫过程。结论。DGAT1表达与卵巢癌的临床表型相关。我们建议DGAT1在卵巢癌的治疗中具有潜在的影响。

1。背景

卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤1]。因为大多数患者被诊断为卵巢癌晚期的疾病,死亡率仍然很高。据估计,全世界每年有超过100000妇女死于卵巢癌。由于其隐性发病,发展迅速,预后不良,这是第五次妇女死亡的最常见原因(2]。假设,正常细胞转变为癌细胞涉及代谢途径的“重新编码”(3,4),包括但不限于调节糖酵解(5,6]。目前,假设说明癌症细胞促进从头合成的脂质或发展成“胖表型”(7),在肿瘤发展发挥重要作用。此外,卵巢激素的生产是一个重要的器官,其中脂质分子前体。卵巢激素的生产,和脂质合成密切彼此纠缠。因此,阐明脂质代谢障碍的作用和机制在卵巢癌可能提供新的见解对卵巢癌的诊断和治疗。二酰基甘油o-acyltransferase 1 (DGAT1)是一种跨膜蛋白表达在内质网。它由酰coa转移到二酰基甘油合成甘油三酯,在脂质合成通路中发挥着关键作用8,9]。然而,DGAT1在卵巢癌的作用仍然知之甚少。

2。材料和方法

2.1。生物信息数据挖掘

我们使用基因组数据共享(环球数码创意)软件下载卵巢癌(OV) RNA-Seq癌症基因组图谱的数据(TCGA) FPKM格式的数据集。OV患者的临床信息检索,其次是提取信息的临床分期,病理等级、血管侵犯的癌症,和生存的病人信息。术后死亡时间或持续随访时间被认为是病人的生存时间。基因集富集分析(GSEA)是使用程序的执行Java软件可以在网站(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)。GEPIA网站被用来评估DGAT1的表达在卵巢癌和正常组织(http://gepia.cancer-pku.cn/)。计时器网站利用DGAT1之间的相关性分析和免疫细胞(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)。

2.2。细胞培养

卵巢癌细胞系(PEO4、PEO1 OVCAR-5, IGROV1, OVCAR-8, ES2, SKOV3, mca,和OVCAR3)被适当维护上海癌症研究所,上海交通大学。在rpmi - 1640细胞培养中含有10%的边后卫,青霉素(100单位/毫升),和链霉素(100μg / ml)。所有细胞都保持在一个湿润有限公司₂(5%)孵化器在37°C。

2.3。实时聚合酶链反应

RNA提取使用试剂盒(豆类、日本)和反向转录cDNA使用PrimeScript rt - pcr试剂盒(豆类、日本)。然后,实时PCR进行使用SYBR预混料Taq交货(豆类、日本)通过应用生物系统公司7500实时PCR。相对表达DGAT1对规范化GAPDH是评估。引物序列用于此试验显示在表中1。

2.4。免疫印迹分析

从DGAT1和PEO4细胞总蛋白提取使用缓冲区和蛋白酶抑制剂鸡尾酒和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。然后,蛋白质在10% SDS /页面凝胶电泳和转移到聚偏二氟乙烯膜。与BSA 2 h,阻塞后与DGAT1或孵化β肌动蛋白抗体主要在1:1000年在4°C一夜之间,与T-BST洗涤三次,和孵化HRP-conjugated二级抗体2 h在室温下,细胞膜与ECL可视化免疫印迹检测试剂(皮尔斯生物技术,罗克福德)。

2.5。DGAT1击倒和细胞转染

慢病毒结构(sh-Ctrl和sh-DGAT1)从OBiO购买技术Corp .)有限公司(上海,中国)。OVCAR-5 PEO4细胞转染和sh-Ctrl或sh-DGAT1 6的补充μ克/毫升聚凝胺。转染细胞培养rpmi - 1640中补充了2μg / ml嘌呤霉素筛选稳定细胞。

2.6。CCK-8细胞生存能力分析

OVCAR-5 PEO4细胞转染和sh-Ctrl sh-DGAT1被播种在96 -孔板的密度2000细胞/。然后,CCK-8 (Dojindo分子技术、日本)添加0,1,2,3,4天postseeding根据制造商的协议。板块在湿润孵化有限公司₂在37°C(5%)孵化器1小时。细胞生存能力是决定通过测量吸光度在450 nm使用功率波XS标仪(美国BioTek)。

2.7。集落形成实验

转染OVCAR-5和PEO4细胞培养在6-well板块在1000个细胞/。2周后孵化,克隆是固定的,沾0.1% ( )结晶紫的解决方案,并使用惠普扫描仪扫描。

2.8。肿瘤细胞迁移(Transwell)测定

OVCAR-5 PEO4细胞转染和sh-Ctrl sh-DGAT1被播种在参议院的密度 200年μl无血清rpmi - 1640中,而700年μl中包含的边后卫在众议院增加了20%。孵化24小时后,细胞被固定和沾0.1% ( )结晶紫的解决方案。图像(s)被捕和细胞数在三个随机区域。

2.9。异种移植物模型

无胸腺的雌性老鼠ν/ν(6)购买和华东师范大学。OVCAR-5细胞转染sh-Ctrl sh-DGAT1注射裸体小鼠的皮下组织。四十天后,老鼠安乐死和肿瘤称重。

2.10。统计分析

统计分析使用GraphPad 7.0。两组之间的差异被双尾学生的估计 - - - - - -测试。kaplan meier绘图机是用于生存分析;一个小于0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。DGAT1超表达与穷人生存在卵巢癌相关

TCGA DGAT1表达水平得到的数据库分析其表达在不同的表型。DGAT1明显在第四期癌症组织相比III期标本(图1(一))。此外,DGAT1高度表达的组织学分级3/4癌症组织相比,在组织学分级1/2(图1 (b))。此外,其表达水平更高的患者比那些没有静脉静脉入侵入侵(图1 (c))。有趣的是,患者在第四阶段的高表达DGAT1有不利预后比那些较低的表达DGAT1(图1 (d))。这些结果给我们暗示DGAT1可能作为一个至关重要的基因在卵巢癌的发展。然后,我们测试DGAT1癌组织和正常组织之间的表达;此外,如补充图所示1,DGAT1表达式有下降的趋势,但这些组之间没有统计学差异。

3.2。DGAT1促进增殖、殖民和卵巢癌的转移

根据定量rt - pcr分析结果,DGAT1 OVCAR-5中高度表达,PEO4细胞(图2(一个))。此外,rt - pcr和免疫印迹分析表明,DGAT1稳定撞倒了在这两种细胞系(数字2 (b)- - - - - -2 (d))。由于生物信息学分析显示DGAT1与卵巢癌表型有密切的关系,而且我们测试DGAT1函数在卵巢癌细胞株增殖和转移。如图3、核扩散、殖民能力和迁移能力的细胞与撞倒DGAT1显著降低体外(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。为了进一步阐明DGAT1在卵巢癌的作用,皮下肿瘤模型建立。如数据所示3 (d)- - - - - -3(e),肿瘤重量和体积明显减少DGAT1表达被抑制。因此,我们的研究表明,DGAT1参与卵巢癌的发展和转移。

3.3。DGAT1表达改变细胞周期,Adherens结,在卵巢癌免疫过程

GSEA进行确定KEGG通路和生物在卵巢癌DGAT1的函数表达式。基于DGAT1卵巢癌中的表达水平,TCGA的样本数据集被分为两组,即DGAT1-low组(< 11.36)和DGAT1-high组(≥11.36)。如图4,细胞周期,TGF adherens结β信号通路,Wnt信号途径,肿瘤细胞的免疫反应,引发的负面监管生产改变了。随着免疫系统癌症的发展中发挥着不可替代的重要作用,因此,计时器网站被用来探索DGAT1之间的相关性和免疫细胞在卵巢癌。我们发现,与B细胞(DGAT1有重大关系 )。

4所示。讨论

我们发现DGAT1表达与卵巢癌相关。发达(DGAT1较高的表达 ),低分化( ),和血管入侵( )卵巢癌的标本。卵巢癌患者的预后DGAT1很穷的高表达。DGAT1表达的干扰后,扩散,迁移,侵略,卵巢癌细胞的集落形成,肿瘤生长被抑制了。

正常细胞癌细胞的转换涉及代谢途径的“重新编码”(3,4),包括糖酵解的规定(5,6],补充谷氨酰胺依赖[10- - - - - -12),和脂质生产(7,11]。尽管代谢失调是假设是癌症的特点,发生代谢失调和失调的产品在癌症的发生和发展中发挥作用尚不清楚。目前,人们认为肿瘤细胞促进从头合成的脂质功能失调的代谢途径。它已经发展成“胖显型”(7),其中脂质合成肿瘤进展中起着重要的作用。之前的研究表明,脂肪酸合酶(FAS),一种合成脂肪酸的酶醋酸和malonyl-CoA与乳腺癌患者预后不良。此外,抑制FAS可以显著降低细胞增殖和细胞存活率,从而抑制体内肿瘤生长(7,13,14]。这表明,FAS可以促进肿瘤的生长通过为能源生产提供代谢底物(15- - - - - -17]。同样,monoacylglycerol脂肪酶(MAGL)能促进生存,移民和致瘤性的肿瘤细胞通过调节游离脂肪酸(18]。此外,其他功能的脂类物质在肿瘤进展和发展支持他们的作用。例如,大多数的细胞膜脂质组成的;脂类的合成增加可以加速细胞膜的合成适应快速增殖的肿瘤细胞(11]。此外,脂质构成的细胞器膜参与细胞信号转导和运输(19- - - - - -21]。例如,π(3、4、5)P3,由phosphatidylinositol-3激酶合成,促进细胞存活和增殖通过激活蛋白激酶B / Akt通路(22,23];lysophosphatidic酸(LPA),通过g蛋白耦合传输信号的受体,从而促进癌细胞的入侵24,25];此外,环前列腺素的催化环氧酶促进肿瘤迁移(26,27]。

DGAT1 multimembrane蛋白质在内质网。它可以通过转移酰coa甘油二酯,合成甘油三酯,在脂质合成中扮演着重要角色8,9]。体外,DGAT1 mannosyl (alpha - 3)糖蛋白beta 1, 2-N-acetylglucosaminyltransferase (MGAT)可以催化单甘酯的直接转化甘油三酸酯(28]。甘油三酯发挥重要作用在能源存储和利用,以及膜脂质合成。尽管甘油三酯正常生理功能是至关重要的,他们可以有负面影响如果过度合成,这可能会导致肥胖(脂肪组织)和器官功能障碍(nonadipose组织)。建议DGAT1参与合成的低密度蛋白质(VLDL)和参与肥胖和胰岛素抵抗[29日,30.]。DGAT1 MBOAT家族的一员,在这个家庭的其他成员发挥重要作用在脂类代谢,信号转导,激素治疗(31日]。然而,很少有研究报告DGAT1的生物功能。据报道,DGAT1的活动可以增加葡萄糖的浓度显著增加的媒介,而DGAT1的活动时可以明显抑制葡萄糖的浓度降低,表明DGAT1的活动是由葡萄糖浓度(32]。

此外,GSEA结果表明DGAT1参与引发的负调节生产。之前,它已经表明,引发的表达显著增加在卵巢癌33),强调的重要性这趋化因子在卵巢癌的发展。此外,引发可以促进人类卵巢癌细胞的迁移通过Wnt /β连环蛋白pathway-mediated EMT (34]。趋化因子可以影响肿瘤生物学在几个方面。一方面,一些趋化因子可以刺激肿瘤细胞的生长,促进血管生成,从而促进肿瘤的生长和转移。另一方面,一些趋化因子能抑制肿瘤的生长和转移趋化免疫细胞的激活和抑制肿瘤血管生成。最近,许多研究已经报道的影响趋化因子在肿瘤生物学。肿瘤细胞及其相关炎症细胞可以分泌多种趋化因子,它主要是通过自分泌或旁分泌分泌信号。这些趋化因子可以形成一个复杂的网络,可能影响肿瘤微环境。趋化因子及其受体在肿瘤生长的生物学行为中扮演着重要的角色,转移和入侵。因此,他们被认为是肿瘤治疗的热点之一,可能是癌症治疗的新靶点。

GSEA表明DGAT1 Wnt信号通路可能参与。已经证明,Wnt信号通路在胚胎发育中起着重要作用的卵巢组织,以及增殖、分化、和卵巢细胞的恶性转化。此外,改变细胞膜,细胞质,细胞核,和蛋白质影响Wnt信号通路发挥重要作用在卵巢癌的发病机制。

因此,DGAT1推定是一种新颖的目标治疗卵巢癌。然而,DGAT1调节的机制需要进一步研究卵巢癌的发展。

5。结论

DGAT1与卵巢癌的临床表现型密切相关。因此,我们假设DGAT1卵巢癌治疗的潜在影响。

数据可用性

https://portal.gdc.cancer.gov/

的利益冲突

不存在利益冲突。

作者的贡献

雷雷夏王,你们同样做出了贡献,这项工作。

确认

这项研究是国家重点支持的研究和发展项目(2016 yfc1303101和2016 yfc1303102号),中国国家自然科学基金(81702543),234 -攀登计划长海医院(2019号yxk014),和计划生育项目(19 jsz05)。

补充材料

补充1。补充图1:DGAT1表达式没有统计上的显著差异在卵巢癌组织和正常组织之间。

补充2。补充图2:DGAT1表达卵巢癌与B细胞有显著相关性。

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