文摘
干扰素诱导蛋白44-like (IFI44L)基因I型干扰素刺激基因(研究小组)中起关键作用抗病毒活性,是一种很有前途的诊断标志物。然而,其精确的角色和功能在肺结核尚未公布。这项研究表明,IFI44L作为抗菌目标和积极的调制器在人类巨噬细胞。击倒IFI44L导致增加结核分枝杆菌细胞内生存。此外,IFI44L显著调节,它限制了细胞内生存的结核分枝杆菌利福平治疗后H37Rv菌株72 h。患者皮肤结核(施)被发现有明显高于IFI44L表达经过6个月的利福平治疗后1个月。这些结果表明,IFI44L诱发积极的监管和清除结核分枝杆菌从人类巨噬细胞。的抗菌活性IFI44L使它可能对治疗的目标应用程序结核分枝杆菌。
1。介绍
结核分枝杆菌(结核分枝杆菌)是最重要的一个致病原,不断引起相当大的发病率和死亡率在全球范围内;大约有1000万人成为新病,140万年死于2019年1]。皮肤结核是一种罕见的临床表现结核分枝杆菌感染,包括大约1%的结核病例的-2%,和通常的形式呈现scrofuloderma或寻常狼疮2- - - - - -5]。巨噬细胞之间的交互和分枝杆菌被认为扮演一个关键的角色在决定感染的结果。分枝杆菌与其分子的模式,比如细菌细胞壁肽聚糖,这已被证明在培养的巨噬细胞激活细胞因子反应(6]。细菌是被巨噬细胞上的受体,这些受体包括toll样受体(通常),快速信号存在的病原体通过核factor-kB (NF-kB)和增殖蛋白激酶(MAPK)通路诱导激活促炎细胞因子和细胞内生存的极限结核分枝杆菌(7- - - - - -9]。一系列的巨噬细胞基因参与发起一个有效的免疫反应,如I型干扰素基因表达的激活程序,已多次显示在人类研究中重要的决定结核分枝杆菌感染的结果(10,11]。
先前的研究表明一个有前途的干扰素诱导蛋白的作用44-like (IFI44L)的抗病毒反应和抗肿瘤和炎症反应在先天免疫和一个关键的角色在病毒感染的有效和快速的限制。IFN-I IFN-II可以激活IFI44L发起人通过IFN-stimulated响应元素。Cotransfection IFI44L启动子的hiv - 1感染IFI44L启动子转录激活(12]。IFI44LI型干扰素刺激基因(研究小组)属于IFI44家族(13]。IFI44L适度活动针对丙肝病毒和抑制丙肝病毒复制的不到20%时表示感染后(14]。过度的IFI44或IFI44L足以限制RSV感染早期postinfection和控制RSV感染(15]。正如前面提到的,遗传转录组中发现RNA签名结核分枝杆菌不寻常和健康对照表明,研究小组能够很大程度上预测进展从感染到结核分枝杆菌疾病,有前途的敏感性和特异性16]。结核分枝杆菌可能影响的表达IFI44L,其他研究小组的基因,在巨噬细胞和细胞因子通过调控通路(17]。然而,IFI44L的精确作用及其在结核病诊断预后尚未公布。
本研究旨在确定IFI44L介导早期先天免疫和治疗预后。结果表明,结核分枝杆菌激活研究小组通路,导致IFI44L upregulation,伴有促炎细胞因子和趋化因子释放,增强结核分枝杆菌在人类巨噬细胞间隙。IFI44L也可以作为定量预测治疗反应的标志在巨噬细胞和皮肤结核患者,从而进一步支持IFI44L在清除的作用结核分枝杆菌。数据表明,IFI44L是一个积极的监管机构结核分枝杆菌间隙和潜在预后标记描述利福平治疗的疗效。
2。材料和方法
2.1。道德声明
人类健康的捐赠者的血液样本的收集和皮肤结核患者皮肤病学研究所的,中国医学科学院,是经伦理委员会批准(2019 - ky - 013)。书面知情同意了所有的参与者参与这项研究。
2.2。血液样本集合
整个血液和组织样本注册皮肤结核(施),皮肤病变和壁组织标本( ),献血者( ),和健康的捐赠者( )收集皮肤病医院,中国医学科学院。所有患者诊断有使用以前公布的标准(18]。所有收集的所有患者流行病学数据库,包括患者的年龄、性别、临床特征,发现从组织病理学,细菌学,和常规的血液和尿液测试。产后抑郁症的结果屏幕,艾滋病毒抗体分析、肝脏和肾脏功能分析,包括胸部x线摄影。患者阴性,没有其他免疫功能低的条件。利福平治疗全过程,前2个月的强化治疗与异烟肼、补充和维持治疗的4个月与乙胺丁醇补充。所有患者患者不仅收到利福平,也完成了整个课程与利福平药物治疗为主体。
2.3。PBMC隔离
全血(5毫升)收集每个参与者为EDTA管。外周血单核细胞(PBMCs)后被分离血清收集使用海曼淋巴细胞分离管(Dakewe生物技术,中国)根据产品的指令。蛋白质和RNA分离提取PBMCs使用100μL•瑞帕裂解缓冲(美国表达载体)和100μL试剂盒试剂(美国表达载体)分别根据制造商的指示。
2.4。THP-1细胞培养和结核分枝杆菌H37Rv菌株感染
人类THP-1细胞(写明ATCC 202 TIB)从皮肤病研究所获得中国医学科学院。细胞被维护在rpmi - 1640中(美国Gibco,马里兰州),这是补充10%胎牛血清和100 U /毫升每个青霉素和链霉素。细胞培养在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。这些细胞被感染之前,播种密度 使用100个每毫升细胞,分化成巨噬细胞μg / mL佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) 48 h,紧随其后的是一个24小时孵化新的rpmi - 1640年媒介。菌株的结核分枝杆菌H37Rv是生长在麦德布鲁克7 h9培养基麦德OADC浓缩为2周(σ,圣路易斯,密苏里州)。结核分枝杆菌H37Rv感染进行了6小时多样性的感染(月)(0,1,5日和10日,紧随其后的是去除细菌细胞外洗两次,然后进一步孵化rpmi - 1640表示时报10%胎牛血清(19]。
2.5。RNA隔离、序列和主机转录组的分析
获取从被感染的巨噬细胞RNA,一式三份井THP-1细胞被感染结核分枝杆菌H37Rv在5月,收获在三个时间点,即,6 h, 24 h, and 48 h, as described in the previous section. The washed cells were lysed using the reagents in the QIAamp RNA Mini Kit according to the manufacturer’s instructions (Qiagen, Venlo, The Netherlands). RNA quantity and quality were estimated with a Qubit 2.0 Fluorometer and Agilent Technology 2100 Bioanalyzer, respectively. Sequencing libraries were generated using the NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB, USA) following the manufacturer’s recommendations, and index codes were added to attribute sequences to each sample. Reference-based maps of host transcriptomes were aligned with HISAT2 [20.),而差异表达基因(度)被确定使用GFOLD(版本1.1.4)(21]。KEGG通路富集分析基于确切概率法与22810年人类蛋白质编码基因背景的clusterProfiler [22]。
2.6。的可行性结核分枝杆菌感染后THP-1
感染之前,THP-1细胞转移到24-well板块 细胞/好,使用100μg / mL佛波醇12-myristate 13-acetate 48 h诱导分化为巨噬细胞。结核分枝杆菌H37Rv感染有巨噬细胞文化一式三份井和孵化6小时多样性的感染(月)(0),5、10和20,紧随其后的是清洗和孵化细胞去除粘细菌。细胞进一步孵化rpmi - 1640年10%胎牛血清的表示。6、24和48 h, 0.05%的细胞细胞溶解渐变20(西格玛奥德里奇)和镀Lowenstein-Jensen (L-J)媒介。从感染的细胞克隆形成单位(cfu)比较与原培养液的分枝杆菌直接镀L-J介质(19]。整个实验重复三次,从而产生共九井,包括三个井每个物种,包括mock-infected细胞。
2.7。定量实时聚合酶链反应测定
使用试剂盒从THP-1细胞总RNA分离试剂(位于马里兰州Rockville表达载体,)。M-MLV第一链工具包(Taraka,大连,中国)被用来准备互补DNA。反应条件如下:95°C 10分钟,其次是40 95°C的周期为20秒,60秒56°C。基因表达水平IFI44L qPCR使用LC480仪器探测到(底漆细节表中列出1)。褶皱表达水平的差异通过2 - RNA样本计算ΔΔ正常化后ct方法β肌动蛋白。研究结果验证了重复THP-1感染实验,提取RNA,并执行qPCR面板的基因如前所述。
2.8。免疫印迹分析
THP-1分化的巨噬细胞细胞溶解与裂解缓冲(细胞信号技术,贝弗利,MA)和BCA分析工具包(Beyotime、江苏、中国)被用来量化蛋白质浓度。然后,40μ克蛋白质分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到聚乙二烯二氟化物膜(微孔、Billerica MA)。膜被封锁和孵化一夜之间在4°C主要抗体,其次是孵化HRP-conjugated二级抗体两个小时。ECL试剂(皮尔斯,切斯特,英国)是用于检测带强度的值。ImageSaver(阿、东京、日本)是用于微密度分析。主要的抗体使用兔子anti-IFI44L抗体(多克隆,Abgent,圣地亚哥,CA)和鼠标anti-GAPDH抗体(细胞信号技术)。
2.9。膜联蛋白V和π染色
THP-1细胞分化和PMA被镀成24-well的平底盘子 每口井的细胞,孵化6 h结核分枝杆菌5 H37Rv (MOI),然后彻底清洗。细胞在连续两天收获,然后与PBS和400年resuspended洗两次μL膜联蛋白V染色缓冲区(BD PharMingen,加州洛杉矶)。一百年μL细胞悬液被转移到新管,和5μL(异硫氰酸荧光素(FITC)共轭膜联蛋白V和2μL propidium碘的补充道。在黑暗中细胞孵化15分钟,然后,400μL(染色缓冲了。染色细胞立即分析使用BD FACSVerse流式细胞分析仪和FlowJo10.7软件。
2.10。克隆形成单位分析
THP-1细胞表达IFI44L成分(或争夺控制成分)被感染结核分枝杆菌H37Rv和孵化6小时37°C,之后,细胞外的分枝杆菌与PBS被洗涤。受感染的细胞培养12、24、48、72小时。之后,定量培养进行连续使用10倍稀释与OADC麦德布鲁克7 h10琼脂板补充。盘子是培养3周,菌落(cfu)统计。
2.11。趋化因子和细胞因子的检测
细胞上清液和血清收集0 h, 6 h、12小时、24小时、48小时、72 h, IL18浓度,亚兰,CXCL10, CXCL11测试使用商业ELISA包根据制造商的协议(Neobioscience,中国)。
2.12。统计分析
统计学意义是GraphPad棱镜5软件决定。数据分析使用双尾 - - - - - -测试。使用方差分析比较组间进行。数据提出了均值标准差。被分配到重要的差异 ( ), ( ),和 ( )。
3所示。结果
3.1。IFI44L调节巨噬细胞中结核分枝杆菌H37Rv感染
RNA-sequencing (RNA-seq)执行既定的关键先天免疫时间点6、24、48小时(17,23,结果表明,超过200个基因显著调节在24 h(图1(一))。路径分析来识别基因/通路引起的结核分枝杆菌H37Rv,主要丰富通路被发现是cytokine-cytokine受体相互作用,肿瘤坏死因子信号通路,NF-kB信号通路,趋化因子信号通路(图1 (b))。强化诱导促炎细胞因子(IL8和IL18),促炎趋化因子(亚兰,CXCL10, CXCL11)和抗菌分子,如TRIM22 IFIT1 IFI44L,观察巨噬细胞感染结核分枝杆菌H37Rv与巨噬细胞没有感染细菌(图1 (c))。特别是,这些免疫受体的激活导致一系列主机反结核分枝杆菌免疫力,最强的24 h和减少在48 h。antituberculous基因的表达可以理解为early-host antituberculous免疫反应,进一步结核分枝杆菌感染,逃避宿主间隙。log2褶皱的差异基因表达变化进行了分析比较感染组与未感染组( ,0.05)。所有的实验都重复了三个生物复制。
(一)
(b)
(c)
接下来,qPCR是用来测量的表达中几个重要的先天免疫记录THP-1验证RNA-seq结果。调节基因IFI44L属于IFI44家庭,这是与自己被isg一致。我们得分cfu结核分枝杆菌H37Rv THP-1细胞感染IFI44L的存在,和生存的结核分枝杆菌H37Rv在THP-1 24 h内抑制细胞。感染的持续时间,IFI44L表达下调和细菌的复制能力增加了48 h(数字2(一个)和2 (b))。这一发现表明,抗病毒基因抑制细菌增殖早期先天免疫;随着感染的发展,细菌逃避宿主的干扰。信使rna序列数据集进行分析来评估在巨噬细胞的调节因素结核分枝杆菌H37Rv感染。一种干扰素诱导基因,有趣的是,IFI44L调节巨噬细胞24 h后结核分枝杆菌H37Rv感染。事实上,rt - pcr结果表明IFI44L表达增加结核分枝杆菌H37Rv-infected THP-1细胞存在剂量依赖的相关性和时间的方式(数字2 (c)和2 (e))。免疫印迹分析强化这些结果,IFI44L峰值的水平结核分枝杆菌莫伊H37Rv剂量和时间(数字2 (d)和2 (f))。这些发现表明IFI44L upregulation调节感染的固有免疫反应结核分枝杆菌。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。Upregulation IFI44L促进巨噬细胞分化,促进炎性细胞因子的分泌
THP-1细胞转染与IFI44L特定成分(shRNA-IFI44L)及其争夺成分(Scr-shRNA)紧随其后结核分枝杆菌H37Rv感染检查IFI44L感染巨噬细胞(人物的潜在作用3(一个)和3 (b))。在这些细胞cfu得分,结果表明,生存的结核分枝杆菌H37Rv shRNA-IFI44L的存在(图增强3 (c))。M1-like巨噬细胞表面标记CD86和M2-like巨噬细胞表面标记CD206观察分析后巨噬细胞的极化类型细菌感染。流式细胞术结果显示结核分枝杆菌与shRNA-IFI44L H37Rv-infected THP-1细胞表现出显著减少细胞凋亡(数字3 (d)和3 (e)),而CD86的表达水平和CD206上涨和下调,分别为(数字4(一)和4 (b))。结果表明,巨噬细胞极化M1后炎性表型结核分枝杆菌H37Rv感染。qPCR结果显示结核分枝杆菌与shRNA-IFI44L H37Rv-infected细胞显著减少mRNA的表达亚兰,CXCL10 CXCL11, IL18相比之下结核分枝杆菌H37Rv-infected细胞转染和那些Scr-shRNA在24小时( ,数据4 (c)和4 (d))。通过使用商业ELISA试剂盒,促炎细胞因子的浓度测量THP-1细胞培养上清液中收集了6点,12和24小时。结果表明,亚兰,CXCL10, CXCL11, IL18明显下调在24小时结核分枝杆菌与shRNA-IFI44L H37Rv-infected THP-1细胞。因此,IFI44L upregulation减少细菌生存,促进了巨噬细胞的极化和炎性细胞因子分泌,并可能有助于抑制感染。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
(b)
(c)
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3.3。IFI44L过度限制的细胞内生存结核分枝杆菌H37Rv利福平治疗后
THP-1细胞被感染结核分枝杆菌在24小时H37Rv随后使用利福平治疗。然后,IFI44L表达式和细菌数进一步观察到48和72 h。IFI44L表达增加结核分枝杆菌H37Rv-infected巨噬细胞后,利福平治疗和72 h后显著增加利福平治疗相比,在24小时的水平。细胞内生存的结核分枝杆菌H37Rv限制在72 h CFU计数分析(图所示5(一个)和5 (b), )。相比之下,亚兰的表达水平,CXCL10, CXCL11, IL18明显减少在同一时间(数字5 (c)和5 (d), )。换句话说,这些基因的表达显著降低治疗72 h后相比,经过24小时的利福平治疗。这些数据表明,显著减少的亚兰,CXCL10, CXCL11, IL18表达式和提高IFI44L表达式中观察到结核分枝杆菌H37Rv-infected利福平治疗72 h后巨噬细胞可能与减少相关的风险结核分枝杆菌感染。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.4。增加皮肤结核的IFI44L表达个人利福平为主要药物治疗后(施)
折以上的基因表达变化的基因检测利福平为主要药物治疗后对患者施研究对公开的长期影响治疗和之间的关系IFI44L表达式。qPCR和ELISA分析IFI44L的相对表达水平,亚兰,CXCL10 CXCL11, IL18 mrna和蛋白在PBMC样本。结果后0天,1、3和6个月的公开疗法进行比较。IFI44L表达显著增加所有人公开3和6个月的治疗后相比,公开疗法(数据前的水平6(一)和6 (b))。干扰素-的关键分子α和干扰素-γ刺激IFN-I和IFN-II进行了分析。干扰素-γ显著调节过程中对公开治疗(图6 (c))。相比之下,亚兰,CXCL10、CXCL11 IL18表达显著降低在所有个人公开治疗1个月后,和减少明显高于同一个人公开治疗6个月后(数字6 (c)和6 (d))。IFI44L的表达的显著变化,干扰素-γ,细胞因子与所有个体的基因与先天宿主免疫力有关结核分枝杆菌。
(一)
(b)
(c)
(d)
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4所示。讨论
本研究表明,IFI44L充当一个抗菌目标和积极的调制器在人类巨噬细胞。击倒的IFI44L导致细胞内生存的增加结核分枝杆菌H37Rv和炎性细胞因子分泌减少。此外,后结核分枝杆菌H37Rv菌株感染THP-1服用利福平从24 h - 72 h, IFI44L显著调节和限制这些菌株的细胞内生存。在所有的个人,IFI44L表达式被发现显著增加经过几个月的利福平为主要药物治疗。结果表明,IFI44L诱发积极的监管和清除结核分枝杆菌从人类巨噬细胞。的抗菌活性IFI44L使它可能对目标的治疗策略结核分枝杆菌。
功能和通路富集分析结核分枝杆菌H37Rv-infected RNA-seq表明巨噬细胞的基因富集与病毒感染密切相关的基因,包括TRIM22 IFIT1, IFI44L IFI44,一致结核分枝杆菌作为细胞内病原体。这些抗病毒基因参与先天免疫反应的一部分宿主防御反应清除病毒感染是专门调节,包括IFI44L TRIM22结核分枝杆菌来华的巨噬细胞(17,19]。IFI44L家庭成员的表达是由细菌和病毒在人类THP-1-derived激活巨噬细胞(24]。IFI44L干扰素诱导蛋白质局部细胞质,和它是由干扰素调节因子通过调节绑定IFN-stimulated响应元素之一(12]。在肿瘤疾病,IFI44L激活了/ Src信号通路,并具备干细胞对癌症的影响,转移和耐药25]。然而,是否IFI44L在调节巨噬细胞的行为结核分枝杆菌感染需要进一步研究。在最近的研究中,IFI44L表达显著调节,导致THP-1公开反应细胞感染结核分枝杆菌H37Rv。
数据显示IFI44L击倒减少细胞因子和趋化因子的分泌,导致炎症反应的抑制作用,而增加IFI44L THP-1细胞株表达促进了促炎反应。IFI44L upregulation增强CD86,亚兰,CXCL10 CXCL11, IL18表达和抑制了结核分枝杆菌活动THP-1免疫细胞。最近的一项研究表明一个重要upregulation IFI44L参与结核分枝杆菌感染THP-1细胞(17]。此外,IFI44L提出了积极的抑制调制抗炎反应。亚兰、CXCL10 CXCL11, IL18表达显著减少后24 h(利福平治疗和对公开治疗1月后所有人。CXCL10被用来区分结核和潜伏性结核病(26],显著降低亚兰的表情在公开后潜伏肺结核患者的治疗与降低患活动性结核病的风险(27]。这个结果表明,6个月的利福平为主要药物治疗消极调节亚兰,CXCL10 CXCL11, IL18。这些基因表达模式中观察到个人公开治疗后可能会降低患活动性结核病的风险和可能是有用的生物标记物的治疗功效。
进一步研究发现,IFI44L THP-1细胞是调节在72 h后利福平治疗。此外,IFI44L表达显著增加相比,6个月后1个月的利福平为主要药物治疗患者施。干扰素-γ显著调节CTB-positive个体对公开的治疗。因此,刺激干扰素- IFI44L表达式γCTB-positive IFN-II的个人。一些流行的结核病患者血液中的生物特征是高表达的转录参与II型干扰素信号(28]。Carneiro等人发现干扰素-高γ移植的表达CCL7 IL8, IFI44L,摘要意思β与皮肤利什曼病(29日]。描述,各种刺激,如感染病毒或病毒和细菌的分子模式,已经被证明直接诱导转录IFIT1 / ISG56家庭(30.]。其他作者报道,IFI44L表达干扰素释放+和干扰素释放−患者显著调节异烟肼治疗6个月后(31日]。因此,分枝杆菌抗原可以不断在治疗对公开发布和诱导增加IFI44L表达式。所以,我们24小时后观察利福平治疗和药物治疗3个月的利福平为主要表明IFI44L表达式可能相关的生物标记物对公开治疗的有效性。这些结果也支持长时间的利福平的适应性为主要药物管理局。此外,IFI44L表达个人所有可能代表一个方法来监测患者对利福平为主要药物治疗。
总之,IFI44L在THP-1细胞显著增加标准的先天免疫反应的细胞几天后药物治疗和患者施莱利福平后作为主要药物治疗。IFI44L表达明显增加公开治疗3个月后,亚兰,而CXCL10, CXCL11, IL18表达式被降低了。这些结果表明,FI44L的潜在生物标志物对公开治疗的有效性。
数据可用性
(图和表)数据用于支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
作者的贡献
沪江,LT、HW和CL的构思和设计实验和分析数据。HJ和LT进行实验。HW和CL写道。所有作者回顾了手稿。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(号。41773083,91951121,41973073)。