转录分析揭示了肾脏健康人群和ccRCC患者中性粒细胞的异质性

文摘

中性粒细胞是严重影响肾脏疾病的发展(例如,透明细胞肾细胞癌(ccRCC)),而中性粒细胞的异质性ccRCC仍不清楚。在目前的研究中,肾活检从健康的捐赠者和ccRCC组织收集单细胞RNA序列(scRNA-seq)。此外,中性粒细胞的亚种群在一个健康的肾脏和肿瘤微环境(时差)ccRCC被表达,然后分析。以前报道的基因都映射到亚种群鉴定。生物主题在此基础上,比较和基因集富集分析(GSEA)是用来揭示和比较相关的生物功能。在一个健康的肾脏,中性粒细胞展览两个亚种群:一个是更多的与肾脏自身免疫有关,可能作为治疗目标;另一种是建议抵抗传染性微生物。值得注意的是六个亚种群在ccRCC活检确定,和两个更与自身免疫有关,而其他四个更与肿瘤病理相关。此外,ccRCC中性粒细胞可以抵抗抗癌免疫疗法ipilimumab和pembrolizumab CTLA-4的低/无表情,PD-1, PD-L1。因此,本研究可以帮助理解异质性和中性粒细胞在肾脏疾病的病理意义。

1。介绍

中性粒细胞的异质性是指一个新兴的话题。从最近的研究显示,从组织和中性粒细胞是高度异构的不同病理条件(1,2]。此外,中性粒细胞已知肿瘤发展表现出不同的功能,这可能影响抗癌治疗效率(3,4]。识别中性白细胞亚种群和相关功能,尤其是在各种肿瘤,还需要进一步的努力。

从最近的研究显示,中性粒细胞严重影响肾癌的发展(例如,ccRCC) [5- - - - - -7]。然而,所展现出来的不同的角色不同的亚种都进行了广泛的低估,主要是因为肾脏中性粒细胞的频率极低,阻碍了识别的亚种群(8]。scRNA-seq的现有优势促进了高通量分析成千上万的基因在单细胞水平上,所以探索肾脏嗜中性粒细胞异质性在健康状况或ccRCC活检是实际在一个非常具体的方式。

在这项研究中,scRNA-seq数据从健康的肾脏和ccRCC活检获得的调查,和肾的转录组中性粒细胞是异形。在一个健康的肾脏,2个亚种群被确定。从丰富基因概要文件显示,一种更相关的自身免疫性疾病(如IgA肾小球肾炎、皮炎、类风湿性关节炎),而另一种类型更相关的传染病(如eb病毒感染、登革热、和沙门氏菌感染)。然而在ccRCC活检,观察大量的中性粒细胞。在此基础上,总共有6个子类。注意生理/病理效应由中性粒细胞子类中被识别ccRCC活检相互重叠,所以他们很难对疾病的一系列有争议的贡献(如各种肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病)。

2。方法

2.1。scRNA-Seq分析

原始数据的健康肾脏活检(GSE131685)提供从廖et al。9]。此外,原始数据ccRCC活检(GSE121636)从NCBI GEO数据库检索。虽然提到了两个数据集来自不同的机器/平台,均获得10倍基因组学技术。R包修(版本3.2.1)是用来处理scRNA-seq数据(9- - - - - -11]。SCTransform包装采用删除技术变化和混杂线粒体基因在数据规范化。此外,细胞周期阶段分数决心减轻细胞周期非均匀性的影响。R包scCATCH(版本2.1)被用来标注细胞集群由遵守NCBI基因符号(12]。健康的肾脏和ccRCC数据进行了分析,分别,然后结合互惠PCA基于守恒的两组基因表达。接下来,所有的集群提出了统一的歧管近似和投影(UMAP)分辨率为0.6。此外,小提琴情节和功能块采用展示基因表达模式的研究项目。

2.2。功能富集分析(13]

基因集富集分析(GSEA)进行识别基因集过多在各自的集群。R包clusterProfiler(4.0版)是用于分析和可视化功能配置(去KEGG)的基因集富集(14]。一个值< 0.05显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。中性粒细胞的异质性在健康肾脏

健康的肾活检被根除性肾脏切除手术后3例(捐赠9,13),与10倍基因组学和转录组数据获得铬技术(9]。进行了聚类分析和细胞表达PTPRC基因编码CD45(图1(一))。通过聚类分析,5细胞生成。修改基因符号后遵守NCBI基因符号,提到5细胞集群被注解为NK细胞(细胞类型得分0.58),中性粒细胞(细胞类型得分0.67),Th细胞(细胞类型得分0.63),肾元上皮细胞(细胞类型得分0.71),和B细胞(细胞类型得分0.86),分别。此外,NK细胞和中性粒细胞被报道是最丰富的,占用了39%和32%,总CD45 +细胞(图1 (b)),分别。注意,肾元上皮细胞也表示为这个标志是积极的。测试细胞注释结果,提到细胞类型的标记基因特性图(图显示1 (c)),即。,KLRD1 and NKG7 for NK cells, MNDA and BCL2A1 for neutrophils, IL7R and TRAC for Th cells, SLC22A8 and SLC13A3 for nephron epithelial cells, and MS4A1 and IGHM for B cells [15,16]。值得注意的是MNDA和BCL2A1表示“补偿”的方式在中性粒细胞的集群,这证明了亚种群的存在。检验本研究的假说,整个人口的中性粒细胞是孤立的,(即有丝分裂和细胞表达基因。,TOP2A或KI67)退化减少细胞周期影响中性粒细胞异质性(补充图的识别。1)。选择后,中性粒细胞接受subclustering,被发现(图2的细胞亚群1 (d))。以一个简单的方式解决这个问题,提到2中性白细胞亚种群与中性粒细胞注释(S100A8)和中性粒细胞(LYPD2),分别。进一步分析表明,这两个中性粒细胞亚种群不同水平的基因表达(如S100A8, LYZ LYPD2, LST1)(图1 (e)),这表明这两个亚种群可以在各种基因的表达是不同的。

为了表明这些差异基因表达的,20个基因进行比较。值得注意的是,提到2亚种群不同的基因档案(图显示2(一个)),这表明他们可能表现出不同的免疫功能。事实上,基因简介从第一个分组人口表示更相关抗原表达,在协助B细胞/浆细胞IgA生产;基因概要文件从第二个分组人口据报道,更与BCR信号和Fcγ介导的吞噬作用(例如,在援助NK细胞介导细胞毒性)(图2 (b))。此外,这两个亚种群表现出不同的病理特征。第一个分组人口是表示更相关的自身免疫性疾病(如IgA肾小球肾炎、幼年型慢性关节炎,风湿性关节炎,和结节病);第二个更相关的传染病(如eb病毒感染,沙门氏菌感染,和登革热)(数据2 (c)和2 (d)和补充图。2)。

3.2。中性粒细胞的异质性ccRCC活检

ccRCC基于细胞中性粒细胞是抽象注释的R包scCATCH [12]。ccRCC中性粒细胞的异质性是探索之前,细胞表达TOP2A或KI67删除(补充图。3)。总的来说,6 subclusters被确定,即。,neutrophil (SEPP1), neutrophil (CCL4), neutrophil (S100A6), neutrophil (COLT1), neutrophil (FN1), and neutrophil (LINC01272) (Figure3(一个))。具体而言,最大的一部分是由中性粒细胞(SEPP1),而最小的部分是中性粒细胞(LINC01272)(图3 (b))。接下来,从每个subcluster前2基因的表达进行了测试,然后对比(图3 (c)和补充图。4)。从分析显示前10名的差距从每个分组人口基因选择,ccRCC中性粒细胞subclusters施加重叠一些基因的表达(图3 (d)),证明所提到的亚种群可能会分享一些免疫/病理特征。前两个ccRCC中性白细胞亚种群在免疫过程中表现出极大的相似性(如抗原表达、溶酶体、吞噬体);第三个分组人口提出严重影响COVID-19注入和核糖体;最后三个亚种群是沙门氏菌感染(图更相关4(一))。此外,前两个亚种群被明显更相关的自身免疫性疾病(如IgA肾小球肾炎,阿尔茨海默病、结节病、过敏,和关节炎)。这种病理特性这两个种群与第一个发现中性粒细胞群在一个健康的肾脏。然而,这两个亚种群也建议在一定程度上与微生物感染(数字4 (b)和4 (c)和补充图。5)。最后四人群,然而,据报道主要是相关肿瘤发展:嗜中性粒细胞(S100A6)乳腺肿瘤;中性粒细胞(COTL1)伯基特淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤;中性粒细胞(FN1)侵袭性肿瘤,乳头状癌、未分化癌,等;中性粒细胞(LINC01272)涌泉+间变性大细胞淋巴瘤和未分化癌(数据4 (b)和4 (c)和补充图。5)。注意,第四和第六亚种群与传染病,确认符合第二个中性粒细胞群在一个健康的肾脏。

3.3。比较肾脏嗜中性粒细胞亚种群之间健康ccRCC活检

比较健康的肾脏中性粒细胞和ccRCC中性粒细胞,中性粒细胞是第一个“合并”(图5(一个)),与修包将评估所有的基因。UMAP情节显示这些中性粒细胞显著不同的差别,证明ccRCC中性粒细胞高度异构。之后,这些中性粒细胞被“集成”基于这些保守的基因表达的。其次,确定了6个亚种群(图5 (b))。更大量的中性粒细胞数量被观察到在ccRCC比在一个健康的肾脏。从比较显示,大多数度,在ccRCC中性粒细胞中表达水平远高于在健康的(图5 (c),补充图6),揭示ccRCC中性粒细胞肿瘤微环境的更活跃。验证这一发现,上述丰富的基因被集群放在KEGG去分析。在集群中0和1,中性粒细胞激活凋亡信号以一种积极的监管,程序性细胞死亡和更强的炎症反应,在转移酶和抑制活动,线粒体膜的维护,证明了所提到的亚种群可能是抗肿瘤的。集群2、3、4和5显示upregulation代谢,分解,溶解液泡;细胞通讯;与生物体相互作用;被确认差别和细胞生物合成的过程,而对这些基因在ATP合成和proton-transporting ATP合酶复杂。一个免疫学特性表明,这样可以更多的肿瘤细胞和更有效的调制肿瘤环境(图5 (d))。

3.4。ccRCC中性粒细胞可能对免疫疗法

Ipilimumab和pembrolizumab被广泛地用作免疫疗法对肿瘤诊所,分别针对CTLA-4和PD-1信号(17,18]。他们用于先进的肾细胞癌(19,20.]。然而,如何ccRCC中性粒细胞反应这两个药物尚不清楚。因此,CTLA4的表达水平(编码CTLA-4) PDCD1(编码PD-1)和PDCD1LG2(编码PD-L1)进行了测试。失望地,几乎整个ccRCC中性粒细胞不表达这三个基因(图5 (e)和补充图。7),证明这些细胞能“逃避”的免疫疗法ipilimumab或pembrolizumab。

4所示。讨论

中性粒细胞的异质性和相关免疫/病理特征的肾脏疾病的发展最近引起广泛关注(21]。众所周知,中性粒细胞具有高度不同的表型和功能主要取决于组织和个人条件(22- - - - - -25]。尽管研究报告/中性粒细胞群异质性的血液、骨髓、脾脏、甚至在大脑、肺、肠道(26- - - - - -28),肾脏嗜中性粒细胞已经很少研究其极低的频率在这个组织。本研究报告中性粒细胞在ccRCC异质性,与健康状况,在单细胞水平。在此基础上,肾脏嗜中性粒细胞的亚种在健康状况和ccRCC,连同他们的度和离散免疫/病理特性,是描述。

现有的研究只是中性粒细胞分为抗肿瘤或protumor亚种群(29日,30.),而这个初步命名的阴影多功能免疫/中性粒细胞的病理特征。为了弥补这个缺陷,转录组scRNA-seq技术提供高通量基因的结果在单细胞水平上,从而使其实际表达和成千上万的细胞之间的相似性和差异进行比较,并提供一个更好的方法对种群以一种优雅的方式进行分类。在这项研究中,两个中性粒细胞被发现在一个健康的肾脏,即。,one was involved in autoimmunity, and the other was more relevant to the resistant to infectious diseases. The first subpopulation might act as a therapeutic target against autoimmune renal diseases. In ccRCC biopsy, neutrophil exhibited much higher heterogeneity, and 6 subpopulations were finally identified. Besides, since abundant genes were upregulated, immunological/pathological features were overlapped among some subpopulations. Nevertheless, the first two populations were suggested to be more relevant to autoimmune diseases, and the last four subpopulations could potentially participate in the development of cancers and act as therapeutic targets against cancer.

限制这个研究包括消耗的缺乏技术具体的中性粒细胞亚种群,这应该在不久的将来解决系统地评估每个嗜中性粒细胞族群的贡献肾癌的发展。此外,可以执行一些其他技术与健康的肾脏或ccRCC活检(例如,immunofluorescent染色和免疫印迹)来验证这些发现。

数据可用性

生成的数据和代码或分析研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者声明,这个调查是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

作者的贡献

Yiliang孟、Kai Cai和Jingjie赵本研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

本研究从广西自然科学基金资助(2020 # 2020 gxnsfaa259050 gxnsfaa297141),从“右江民族医科大学研究项目(# yy2019bsky001),从中国的国家自然科学基金(# 81460143,# 31970745),广西自筹经费项目的健康部门(# 2102005)。

补充材料

补充图1:表达水平TOP2A和KI67的健康肾脏中性粒细胞。功能块和小提琴情节展示TOP2A和KI67的表达水平在健康肾脏中性粒细胞。补充图2:gene-concept网络健康的肾脏嗜中性粒细胞的亚种。热量地图显示疾病相关基因在健康肾脏嗜中性粒细胞的亚种。补充图3:表达水平TOP2A和KI67 ccRCC中性粒细胞。功能块和小提琴情节的表达水平TOP2A KI67 ccRCC中性粒细胞。补充图4:gene-concept ccRCC网络中性粒细胞的亚种。热量地图显示疾病相关基因ccRCC嗜中性粒细胞的亚种。补充图5:小提琴的情节显示所选前2重要基因的表达水平从每个ccRCC中性粒细胞集群。补充图6:详细列表整合度的嗜中性粒细胞的亚种。 Supplementary Figure 7: feature plots show the expression levels of CTLA-4, PD-1 and PD-L1 in ccRCC neutrophil cluster.(补充材料)

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