文摘

CD47是一种细胞表面糖蛋白分子,属于免疫球蛋白超家族,绑定到各种蛋白质包括整合蛋白、血小板反应蛋白- 1和信号调节蛋白α(SIRPα)。CD47发展是一个重要的肿瘤抗原和各种癌症的发展。本研究设计了嵌合抗原受体t细胞(CAR-T)绑定到CD47抑制CD47的表达。我们使用了complementarity-determining地区(CDRs) B6H12鼠抗体嫁接到IgG1框架创建人性化的单链可变片段(scFv)和链接器(G4S x3)。scFv被用来设计的嵌合抗原受体结构CD8signal-CD47scFv-CD8a hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3ζ然后转化为T淋巴细胞的CAR-T创建第三代慢病毒。结果显示,新CAR-T有效杀死肿瘤细胞A549细胞。CAR-T参与转移抑制基因的表达和入侵细胞A549包括β-肌动蛋白、calreticulin,环氧酶2在mRNA水平。

1。介绍

目前的免疫球蛋白实验证据表明一个重要的角色在恶性肿瘤的形成。CD47是一个常见的细胞表面immunoglobulin-like糖蛋白中发现白血病或其他癌症如卵巢癌、胰腺癌,神经胶质瘤等1- - - - - -6]。除了功能如整合蛋白和血小板反应蛋白- 1的蛋白相互作用,CD47被认为是巨噬细胞免疫检查点与信号调节蛋白交互时α(SIRPα)[7]。这激活SIRPα,磷酸化immunoreceptor tyrosine-based抑制主题(ITIM),新兵SHP-1磷酸酶细胞膜,然后限制积累肌凝蛋白表面的细胞,进而防止吞噬作用。CD47的表达与肿瘤的生长和提出了一个关键的临床预后因子和死亡率(6,8]。CD47的存在被发现在转移患者,免疫逃避,或细胞迁移8,9]。

之前的文献中发现,成功的使用动物和人源化抗体CD47通路阻塞,导致肿瘤生长的抑制和阻断5,10]。中,使用嵌合抗原受体t细胞(CAR-T)对白血病和固体癌症治疗是前提。先前的研究显示,cd47抗体CAR-T被有效的胰腺癌细胞(11]。汽车结构由一个细胞外antigen-binding域叫做scFv铰链域融合,跨膜域,细胞外的间隔,胞内信号域,负责激活t细胞,costimulatory域(CD28、4-1BB CD27,或其他领域),和CD3ζ激活域(12]。人性化的汽车结构的潜在延长耐久性CAR-T细胞,可增强抗菌持续时间响应CAR-T细胞致病细胞的活动。因此,重要的是要选择一个人文的scFv结构。

选择适当的铰链域也很重要,这是由于焊接位置的连接和亲和力。铰链域曾被忽视,但临床前实验证明了铰链区中发挥着重要作用亲和力、信号的规定(13]。文献显示,CD8的铰链域α是更有效的比CD28的因为它能降低细胞因子释放浓度和细胞死亡14]。同样,选择跨膜域至关重要时,在连接铰链中发挥作用域和胞内域。使用跨膜域CD8 -α表现出低水平的T细胞CD28 activation-induced死亡相比,[14]。

努力改善CAR-T细胞通过改变胞内域最近实现的。在文学,4-1BB跨膜表现好于CD28跨膜在临床和实验室设置,因为4-1BB聚集有关可能达到一个更高的层次和更长的持续时间比与CD28聚集有关(15,16]。然而,CAR-T疗法的局限性无法解决单个域聚集有关。因此,第三代CAR-T细胞设计有两个聚集有关的领域。临床试验表明,这种策略增加耐力、增殖和抗肿瘤活动(17- - - - - -19]。在这项研究中,我们设计了CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3结构ζ创建CAR-T细胞破坏CD47 +癌细胞,更具体地说,肺癌细胞株A549。nonsmall是A549细胞肺癌细胞系(NSCLC),占85%的肺癌。A549表现出高CD47表达式和CD47-related转移研究中使用的是(20.]。在这项研究中,我们测试了毒性水平,决定细胞因子含量,调节细胞转移的能力通过减少活动相关的基因。

2。材料和方法

2.1。材料准备

2.1.1。细胞系

HEK293FT(表达载体)和A549细胞株由Inserm U 853实验室,法国卫生和医学研究所。人外周血单核细胞(PBMC)从捐赠者的全血分离。

2.1.2。化学和生物制品

化学和生物产品包括以下:(我)质粒:pcDNA 3.1 +车基因(genscript),矢量pFUGW(从addgen,代码14883),pCMV-dR8.2dvpr(从addgen,代码8455),和pCMV-VSV-G(从addgen,代码8454)(2)细胞培养基DMEM的边后卫,Opti-MEM (Gibco);青霉素、链霉素、胰蛋白酶、台盼蓝(Pan生物技术),Ficoll-PaqueTM(通用电气医疗集团)(3)T-CD3细胞分离器设备;TexMAXS介质- 2;从Miltenyi T细胞进行了研究(iv)人类干扰素γ酶联免疫试剂盒;人类- 2酶联免疫试剂盒(Abcam)(v)这种酶T4 DNA连接酶;EcoRI和BamHI(生物学实验室);DNA标记(热);质粒DNA MIDI设备(试剂盒);凝胶萃取设备(试剂盒);Lipofectamine™3000转染试剂,P3000™试剂(表达载体)。(vi)弹出的蓝色™总RNA提取工具包(内含子),实时Luna普遍一步RT-qPCR工具包(生物学实验室);总DNA提取工具包(试剂盒);PCR反应混合液(Promega)(七)基因检测引物序列展示在表1

2.2。汽车结构设计

从小鼠抗体CDR B6H12.2嫁接到VH和六世IgG1框架创建人性化scFv发电机3 xggggs链接器。汽车基因结构包括CD8a引导序列,细胞外的一部分CD8a域和CD4和CD28跨膜域;胞内域4-1BB CD3zeta。结构被放在genescript合成和基因序列的优化。汽车结构与向量慢病毒pFUGW (addgene)通过两个酶BamHI EcoRI。汽车结构和两种酶切BamHI pFUGW EcoRI和转移到向量,选择转化到大肠杆菌菌落PCR、克隆和分离重组质粒DNA midi设备(试剂盒)。质粒及其浓度检查通过琼脂糖凝胶电泳和nanodrop测量,分别。

2.3。准备慢病毒

汽车慢病毒是由使用HEK 293英尺的细胞(英杰公司)根据指令德克萨斯大学的,与一些修改(MD安德森癌症中心26]。 HEK细胞种植在6-well板(10厘米²在不需抗生素的DMEM培养基);和细胞覆盖90%的板表面后一天。这时,一个10μg三个向量同时转移包括FUGW /车,pCMV-dR8.2dvpr,和pCMV-VSV-G 5: 5: 1比例成HEK 293英尺细胞。板的介质体积达到0.5毫升opti-MEM。的支持下Lipofectamine 3000转染试剂和P3000试剂,根据制造商的手册(27),细胞板孵化在37°C, 5%二氧化碳大约6个小时。然后,转染了3毫升10%的边后卫和1%的DMEM培养基P / S抗生素添加为每个。细胞板在37°C,孵化后5%的二氧化碳,收集到的慢病毒的解决方案是72小时。这个解决方案是过滤0.45μm过滤器;然后,它是集中的五倍Microsep™提前列。病毒滴定是由定量rt - pcr试剂盒实时机器上使用生物学实验室试剂。

2.4。确定数量的慢病毒实时PCR方法

一个100μL慢病毒被用来提取,获得40μL RNA通过使用试剂盒弹出的蓝色™总RNA提取工具包(内含子)。DNA被RcoRI和DnaseI(生物学实验室)和1.55μL RNA为模板用于实时PCR反应与Sybr绿色和TestCar底漆。以下程序设置:逆转录:55°C 10分钟;初始变性:95°C 1分钟然后运行45周期与变性95°C,持续10秒,30秒60°C;和融化曲线分析与温度范围60 - 95°C。校准曲线是由pcDNA3.1携带汽车基因相同的引物对如上所述。

2.5。早期分离过程

T淋巴细胞分离过程是根据Miltenyi的协议(28,29日]。具体来说,10毫升的外周血在20毫升的PBS稀释1 x(表达载体)然后添加到15毫升的聚蔗糖(锅技术)。这是离心机与3000 rpm 30分钟为了获得单细胞层。单核细胞被洗用5毫升的PBS 1 x和使离心后收集细胞200 rpm 15分钟20°C。

获得的PBMCs混合在PBS 1 x的浓度为10⁷细胞/ 100μl . microbead CD8和CD4混合1:1比例(100μL microbead CD8 + 100μL microbead CD4, 20μL 10⁷细胞)。混合解决方案microbead CD8和CD4细胞逐渐补充。然后,样品在4°C孵化15分钟。细胞用PBS 1 x + 0.5% BSA + EDTA 2毫米缓冲区(10⁷细胞需要1 - 2毫升的缓冲区,或7毫升 细胞)。管离心机在300转10分钟;然后,收集细胞沉积物。细胞溶解在500年μL (PBS缓冲+ 1 x BSA 0.5% + EDTA 2毫米。

女士列在磁机。这一列被与500年的两倍μL (PBS缓冲+ 1 x BSA 0.5% + EDTA 2毫米。流体流动让完全通过列。然后,整个计算单元是在列,让液体流经列。列被500年的三倍μL (PBS缓冲+ 0.5% BSA + EDTA 1 x 2毫米,和消极的碎片收集在一个单独的管。然后,列被撤机,1毫升的PBS 1 x + 0.5% BSA + EDTA 2毫米缓冲打击细胞的列。活塞和附加到列用于完全把细胞的列。获得了积极的片段在一个单独的管。提取的T细胞被清点,离心机1000转10分钟收集细胞。细胞溶解在培养基和添加率(100 T细胞进行交易μL / 10⁷细胞)。细胞培养在37°C, 5%的二氧化碳。

2.6。细胞培养和转让

细胞是引起胞液吸管,吸到猎鹰1000 rpm管和离心5分钟收集细胞。细胞溶解在TexMACS介质和补充了300国际单位/毫升IL2, 100 t细胞比例的交易μL / 10⁷细胞。细胞培养在37°C,二氧化碳的5%。

2.7。慢病毒感染到t淋巴球

慢病毒感染的过程中t细胞进行了根据Genemedi公司的指令30.),感染性的50多个(MOI) opti-MEM介质,和200克的离心1小时使用Sorvall传奇RT离心机。第二天,感染中完全删除和细胞在TexMAXS重组,300 U / mL - 2中。3 - 5天后,细胞收集的一部分,取代了新TexMAXS中与300 U / mL - 2型、事务型维持细胞密度 细胞/毫升。

2.8。流式细胞术

BD MultitestTM CD3 / CD8 / CD45 / CD4工具包(美国Becton, Dickinson)是根据制造商的指示31日]。首先,用吸管吸20μL BD Multitest CD3 / CD8 / CD45 / CD4细胞成管的底部。一个50μL培养的T细胞和CAR-T细胞被转移到试管底部和混合。管是限制和旋风轻轻搅拌。管是在黑暗中孵化15分钟在室温(20 - 25°C);然后,450年μL 1 x BD流式细胞仪的沉积物被加入到管。管是限制和旋风轻轻搅拌。接下来,管是在黑暗中孵化15分钟在室温(20°C-25°C)。细胞利用BD流式细胞仪分析第二章设备。

2.9。确定相对定量PCR基因转移效率

T淋巴细胞和CAR-T细胞被用来使用试剂盒提取总DNA提取工具。然后,实时PCR进行实时掌握混合Luna普遍RT-qPCR工具包(生物学实验室)汽车基因和GADPH基因。1.55μL RNA为模板用于实时PCR反应Sybr绿色和TestCar引物。实时PCR仪的项目设置如下:逆转录:55°C 10分钟;初始变性:95°C 1分钟然后运行45周期与变性95°C,持续10秒,30秒60°C;和融化曲线分析与温度范围60 - 95°C。通过使用Livak 2-DDCt方法、转换效率计算通过检查汽车的存在基因片段在靶细胞基因组中,相比之下,参考GAPDH基因。计算公式如下:

2.10。决定基因表达参与A549细胞转移

A549细胞在DMEM培养基培养补充的边后卫和抗生素P / S。细胞被分为24-well盘子(Nunc) 每口井的细胞和培养过夜。在第二天,被删除,取而代之的是媒介 T细胞和CAR-T TexMAXS中包含300 U / mL - 2和T细胞办理™。这个过程重复三次。24小时后,CAR-T和T细胞被完全除去培养基与PBS 1 x再洗。细胞A549通过胰蛋白酶化,RNA提取试剂盒。β-肌动蛋白的表达,卡尔,cox - 2中列出的基因与引物分析了双材料与GAPDH基因通过实时PCR方法参考。每个基因的表达效率在细胞A549的公式计算出在不同样本: (我)Ct (T / Tg)目标基因的循环阈值(Tg)样品(T)(2)Ct (T / Ref)的循环阈值参考样本(T)基因(Ref)(3)Ct (C / Tg)目标基因的循环阈值(Tg)控制(C)(iv)Ct (C / Ref)循环阈值的参考基因(Ref)控制(C)

基于这些参数,目标基因的循环阈值对样本(T)和控制(C)被计算归一化目标的DCt的差异基因的参考基因:

示例:

控制:

样本归一化的DCt计算DCt的区别(T)和DCt (C): 。从那里,目标基因的表达率的样品相比,控制计算。

2.11。用MTT细胞毒性测试

细胞毒性测试执行与默克公司公司建议的过程32]。目标A549细胞分裂的96孔板(Nunc) 每口井的细胞培养过夜。在第二天,被删除,取而代之的是媒介 T或TexMAXS CAR-T细胞培养介质包含300 U / mL - 2和T细胞办理™。这个过程重复了三次。细胞被监控的一个额外的2天。生存/ MTT比色死亡率(3 - (4 5-Dimethyl-2-thiazolyl) -2.5 diphenyltetrazolium bromide-sigma)。获得的数据然后使用Excel软件进行分析,以确定细胞生存能力(%细胞生存能力)。

控制样品:样品只有细胞和细胞培养基。

分析样本:试剂样品相应的浓度在细胞培养基。

空白:细胞培养基。

2.12。细胞因子通过ELISA试验

目标在48-well A549细胞培养板的数量 每口井的细胞,在一夜之间在37°C, 5%二氧化碳在DMEM F12培养基中含有10%的边后卫,1% P / S。24小时后,培养基是完全删除和添加 效应细胞(CAR-T细胞或nontransgenic T细胞)包含A549细胞200井μL TexMAXS。这个过程重复了三次。24小时后,150年μL中被转移到离心管,离心1000 rpm 5分钟,以消除剩余的细胞。上层清液用于细胞因子分析(干扰素γ- 2)根据Abcam细胞因子工具包(人类酶联免疫试剂盒- 2;人类干扰素γ酶联免疫试剂盒)。

2.13。统计分析

两组之间的数据进行了分析和比较,t细胞和CAR-T学生 - - - - - -测试。统计上的显著差异决定的值< 0.05。

3所示。结果

3.1。设计人性化CD47抗体B6H12 scFv从老鼠

CDR域B6H12鼠抗体序列的确定根据卡巴特理论。CDR域鼠标抗体被嫁接到人类VH和六世IgG1框架,使用链接器(G4S) x3创建人性化scFv抗体(图1)。人性化cd47抗体scFv在phagemid pHEN2;然后,重组phagemid被转移到大肠杆菌号菌株,利用辅助噬菌体M13噬菌体形式携带CD47 scFv噬菌体的gIII。的CD47 scFv噬菌体被ELISA检测绑定CD47重组抗原和A549细胞来源的抗原。结果表明,人性化CD47 scFv CD47有高度的亲和力。

3.2。设计嵌合抗原受体(汽车)携带cd47抗体人源化scFv并产生慢病毒

人性化cd47抗体scFv被用来设计的结构CD8signal-scFv anti-CD47-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3ζ受体(图1)。传导区域的传导地区CD8a (aa) 21日,紧随其后的是人性化scFv (240 aa),铰链CD8a域(119 aa),跨膜域CD4 (aa) 22日,CD28聚集有关域(41 aa)和41 bb (42 aa)和CD3ζ(113 aa)激活域。这个结构是用来推断人类细胞的DNA序列,并优化表达式由软件通过提高CAI值从0.80到0.95。两端的基因连接到两个EcoRI和BamHI酶切割位置的。汽车被Genscript合成基因结构(美国)附加到向量pcDNA3.1。汽车被切断的基因编码酶EcoRI BamHI和附加到向量pFUGW (14883)。pFUGW /车(CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3ζ)一起壳向量pCMV-dR8.2dvpr(8455)和pCMV-VSV-G(8454)使用midiprep提取质粒提取工具包(试剂盒)。这些质粒被用于生成慢病毒通过HEK 293英尺的细胞(图2)。

慢病毒是量化实时PCR方法与标准曲线由向量pFUGW /车(CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3ζ)和TestCarF / R引物。慢病毒的数量 cfu /毫升。

3.3。T淋巴细胞的分离和创建CAR-T细胞

使用10毫升的外周血单核乳沟使用聚蔗糖(Pan科技)和Milltenyi CD4和CD8 t淋巴球分离设备。TexMAXS培养基中获得的T淋巴细胞融合与300 U / mL - 2;以比100 T细胞进行补充μL / 10⁷细胞。细胞培养在37°C, 5%的二氧化碳。慢病毒包含CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3结构ζ被感染的T淋巴细胞 在OptiMEM媒介。24小时后,旧的媒介是移除和替换新媒介TexMAXS, 300 U / mL - 2, t细胞进行交易的1%。创建的影响CAR-T被实时PCR方法量化评价汽车基因和流式细胞术。结果表明,在为期18天的文化,CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3细胞携带DNA编码的数量ζ(图达到70 - 85%3(图)和超过25%的CAR-expressing细胞4)。CAR-T细胞治疗、基因转移过程后,T细胞的混合物和CAR-T细胞用于治疗没有乳沟。因此,转基因细胞混合物将用于后续研究nontransgenic t细胞作为对照。

3.4。CAR-T细胞释放细胞因子的能力

通过使用ELISA细胞因子(Abcam)装备,结果CAR-T细胞释放细胞因子的能力- 2和IFNg表明CAR-T细胞能够释放这些细胞因子与肿瘤细胞A549交互。具体来说,CAR-T细胞A549肿瘤细胞之间的相互作用产生1.36 ng / mL IFNg;与此同时,T细胞之间的相互作用与肿瘤细胞A549没有产生任何IFNg。2,T细胞与肿瘤细胞A549交互时可以秘密206.8 ng / mL - 2,这是低于2当CAR-T细胞分泌的量与A549细胞(433.2 ng / mL)。差异具有统计学意义 (图5)。

3.5。评估杀死肿瘤细胞A549的效果

结果表明,CAR-T细胞A549细胞死亡超过60%,这是优于T细胞(54.41%)。该数据具有统计上的显著差异 (图6)。从理论上讲,CD47 CAR-T细胞杀死癌细胞CD47 +。在这项研究中,我们的研究结果还表明,CD47 CAR-T A549细胞株的细胞毒性MTT试验。

3.6。评价所涉及的抑制性影响基因的表达细胞系A549肿瘤转移

分析基因的表达的实时PCR表明,在暴露于cd47抗体CAR-T细胞A549细胞减少β肌动蛋白的表达,calreticulin,环氧酶2 (cox - 2)基因相比,对照组A549细胞和早期暴露组。具体来说,接触CAR-T细胞和T细胞后,β-肌动蛋白基因表达的A549细胞只有6%和32%的价格相比对照组,分别。calreticulin基因,在暴露于CD47 CAR-T细胞和T细胞A549细胞表达该基因只有21%和67%的控制,分别。特别是对cox - 2的基因,T淋巴细胞激活cox - 2的表达基因在细胞A549(表达与对照组相比增加了333% );同时,CAR-T细胞cox - 2表达下降15%相比,控制(图7)。

4所示。讨论

在这项研究中,人性化CD47-CAR-T细胞显示潜力杀死癌症细胞系A549。这是因为癌症细胞系A549细胞CD47-overexpressing之一(20.]。虽然CD47-CAR-T展览有效破坏A549细胞,细胞因子分泌的量与靶细胞接触后并不高。这可能是由于CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3的结构ζ。这个结构CD8α铰链域,在以前的研究中显示,这个铰链域释放细胞因子浓度低(例如,IFNg和肿瘤坏死因子),减少activation-induced细胞死亡和细胞与CD28-derived域并不是表面那样容易上市(14]。我们选择细胞因子- 2和IFNg后指的是以前的研究(33),确定2、TNF和IFNg CAR-T的细胞因子。事实上,细胞因子风暴似乎是特异性的t细胞活化的结果,通常发生后立即CAR-T细胞输注。细胞因子风暴期间的主要细胞因子TNF和IFNg34]。因此,CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3ζ设计、CD47 CAR-T细胞可以降低IFNg分泌。

此外,在这项研究中,我们使用了跨膜域CD4 (35,信号通过CD4 T细胞激活和保障发展,以及刺激T细胞识别目标抗原和延长T细胞与抗原相互作用[36]。最后,CAR-T细胞被设计有两个4-1BB和CD28聚集有关的域。临床试验表明,CAR-T细胞有两个聚集有关领域最好的耐力,扩散,和抗肿瘤活性37]。

CD47参与癌细胞转移和在内皮迁移有重要的作用38]。CD47增加之间的关系表达和肿瘤细胞侵袭性和转移也澄清了之前的研究。高表达CD47 nonsmall细胞肺癌中发现(39),而这些癌症很容易逃脱免疫系统。CD47表面表达显著增加内皮后胶粘剂。这种现象有助于他们成长在间质性肺40),形成转移。CD47调节上皮细胞的肌动蛋白,参与adhesing和调制下的迁移细胞cox - 2蛋白(41]。使用特定cd47抗体抗体或核cox - 2的表达与对照组相比降低(42]。微rna - 133 a能够目标CD47蛋白抑制增殖,迁移,和喉癌细胞的渗透43]。CAR-T CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3ζ本研究细胞减少的同时表达这三个基因已经被证明参与转移包括β-肌动蛋白、calreticulin, cox - 2。因此,CAR-T CD47细胞在这项研究中,除了杀死目标肿瘤细胞A549的影响,也在转移抑制基因的表达。这一现象可能的解释是,细胞负责CD47-expressing转移被CD47 CAR-T细胞。同时,剩下的细胞的细胞不表达CD47,也表达了更少的β肌动蛋白,calreticulin, cox - 2的基因。

5。结论

这是第一代CD47scFv-hinge-CD4TM-CD28-41BB-CD3报告ζCAR-T细胞,证明CD47-CAR-T对肿瘤细胞A549细胞的有效性。此外,A549细胞,接触CAR-T后,减少了多个基因的表达,参与A549细胞粘附和转移。未来的研究在动物模型需要进一步检测β-肌动蛋白的表达,calreticulin, cox - 2在蛋白质水平。解决方案来优化CD47-CAR-T细胞疗法应该保证不同类型的癌症。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们想感谢越南科学技术学院提供金融支持(代码VAST02.03/18-19)这篇文章。