一种与弥漫大B细胞淋巴瘤微环境相关的免疫相关预后分类器

摘要

背景。弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一种危及生命的恶性肿瘤，其特征是异质临床，表型和分子表现形式。鉴于免疫和肿瘤之间的关联，鉴定合适的免疫生物标志物可以改善DLBCL诊断。方法。我们从GEO数据库中系统搜索DLBCL基因表达微阵列数据集。免疫相关基因(IRGs)从import数据库中获得，癌组织中318个转录因子(TF)靶基因从cisstrome cancer数据库中获得。采用Cox回归和LASSO分析构建DLBCL预后的免疫相关分类器。为了评估低危组和高危组总生存率的差异，我们使用ESTIMATE和CIBERSORT算法分析了DLBCL中的肿瘤微环境(TME)和免疫浸润。应用WGCNA研究分子机制，解释我们的免疫相关分类器和TFs的临床意义。结果。选取18个IRGs构建分类器。多irg分类器具有较强的预测能力。高风险评分的患者生存期较差。基于3年和5年生存率的AUC，分类器显示出比临床数据更好的预测能力。低、高危评分组之间总生存率的差异可能是由于免疫浸润、TME和转录调节的差异造成的。结论。我们的研究描述了一种新型预测IRG分类器，具有在DLBCL中具有强大预测力的预测力。我们的研究结果为进一步分析DLBCL发病机制和临床治疗提供了有价值的指导。

1.介绍

弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)占所有确诊的非霍奇金淋巴瘤的30-58%。DLBCL在欧洲的发病率约为每年3.8/10万[1- - - - - -3.］.DLBCL是一种复杂且激进的肿瘤，具有异质表型，临床和分子表现[4- - - - - -6］.采用现有化疗方法后，DLBCL患者的生存率已提高到50-60%;然而，由于这种恶性肿瘤的异质性，近40%的患者没有充分受益[7］.因此，有强烈需要鉴定待应用于直接临床疗法的新生物标志物，并改善DLBCL预后[8，9］.基于基因测序技术的进步和许多基因表达谱，DLBCL患者的预后与肿瘤微环境（TME）密切相关[10- - - - - -12］.TME由免疫细胞、炎症介质、间充质细胞和细胞外基质分子组成[12- - - - - -17］.一小部分浸润性免疫细胞影响肿瘤的生长和进展，确定病人的预后[18，19］.同时，基因表达影响TME中浸润的多种免疫细胞[20.- - - - - -22］.近年来，一种基于靶向B细胞受体信号传导以及PD-L1和PD-1阻断剂的激酶抑制剂的新型免疫治疗方法已被证明对DLBCL有效[11，23- - - - - -26］.然而，只有少数DLBCL患者受益于这些新疗法，而其他患者则只表现出很少或没有反应。因此，分析免疫相关基因（IRG）和总存活之间的关联可能揭示IRGS和新型生物标志物的预后价值。估计算法使用基因表达签名来量化肿瘤样本中基质和免疫细胞的浸润[26］.Cibersort Deconvolulation算法使用基因表达谱，以复杂细胞类型的散装肿瘤样品中的免疫细胞表型[27］.基于DLBCL和免疫细胞之间的联系，我们的研究旨在构建能够预测DLBCL患者的预后的IRG分类。估计和CIBERSORT被雇用来评估DLBCL的TME的作用。

2。材料和方法

2.1。DLBCL数据集和预处理

我们系统地搜索DLBCL基因表达微阵列数据集从基因表达综合(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/可公开获得的临床注释）数据库。其中一个队列样本(GSE32918)使用Illumina HumanRef-8 wt - dasl v3.0获得了Illumina基因表达谱，而两个队列样本(GSE10846和GSE31312)使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (gh -U133 Plus_2.0)获得了Affymetrix基因表达谱。以下步骤应用于数据集筛选。（i）从Affymetrix公司的数据集的原始CEL文件进行鲁棒多阵列平均算法在软件AFFY [28]进行背景校正和分位数归一化。此外，用中值polish算法对每个转录本的寡核苷酸进行了总结[29］.使用Lumi软件对Illumina matrix文件进行分位数归一化处理。(ii) HG-U133 Plus_2.0探针使用hgu133plus2.db包进行注释。Illumina HumanRef-8 WG-DASL v3.0探针注释序列来源于GPL8432平台(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL8432）.(iii)对于同一基因对应的多个探针，我们使用平均值最大的基因。(iv)提供患者完整的基因表达谱和随访信息。结果，选择1022个DLBCL样品，包括从Visco等人的研究中获得的470,140和412个样品。[30.， Barrans等[31，和Lenz等[12),分别。

2.2。IRG检索

我们从Immport数据库获得了IRGS列表（https://www.immport.org/home)。保留不同的IRG，包括趋化因子、细胞因子和与免疫反应相关的基因。选择GSE31312、GSE32918和IRG之间的重叠基因进行进一步研究。选择GSE31312中的470个样本作为模型开发的训练集，而选择GSE32918和GSE10846作为验证集。

２.３.单变量Cox回归和最小绝对收缩与选择算子(LASSO)分析

为了从1170个重叠的IRG中识别与生存相关的IRG，我们对GSE31312和GSE32918队列中的连续变量进行了单变量Cox回归分析 作为生存相关的IRGs。基于来自GSE31312队列的349个候选基因和来自GSE32918队列的71个候选基因，25个重叠基因被鉴定为生存相关的IRGs。将25个IRGs的GSE31312表达数据整合到LASSO回归中以识别预后特征。具体而言，将LASSO回归模型构建为一个基于多irg的分类器(包含18个irg)，用于预测训练集中患者的OS。在R中使用“glmnet”软件包进行LASSO回归，为了估计IRG分类器的预后意义，我们在R中使用“survivvalroc”软件包，从而得到三个队列的receiver operator characteristic (ROC)曲线。计算并比较不同时间下曲线下面积(AUC)，验证分类器的性能。根据各系列的中位危险评分将患者分为低危组和高危组。采用Kaplan-Meier (KM)生存曲线分析DLBCL患者的生存情况。

2.4.DLBCL患者预后预测列线图的开发和验证

接下来，我们开发了一种临床应用方法，以预测DLBCL的个体预后。基于OS的多元COX回归分析结果，我们综合了风险评分和其他临床病理协变量，在GSE31312队列中构建了一个载体。预测因素包括风险评分，年龄，性别，亚型，阶段，eCOG性能状态以及郊外站点的数量。使用校准和ROC曲线在GSE10846队列中验证了NOM图。

2．5．低、高危组间质和免疫细胞浸润的比较

探索低和高风险群体之间的OS基本变化的潜在机制，我们使用估计以获得一个微环境分数的三组的每一个样品[26］.采用Wilcox检验分析两组间微环境的差异[32]最后，我们根据三个队列中低免疫评分组和高免疫评分组的临界值分别绘制了KM曲线。根据每个独立队列中患者OS和免疫评分之间的关系，使用R中的“survminer”软件包确定截止值。R软件包“MaxStat”迭代测试所有可能的截止点，以确定达到最大秩统计的值，用于将免疫评分二分法，并将患者分配到每个队列中的低免疫评分组和高免疫评分组，从而减少计算批量效应。

2.6。低收入和高风险群体之间的白细胞亚的比较

为了计算两组DLBCL患者中免疫细胞的比例，我们使用了LM22基因标记，它区分了22种人类免疫细胞表型，包括B细胞、自然杀伤细胞、T细胞、髓系亚群和巨噬细胞[27］.通过CiberSort分析结果，烫发值设定为1000;患者 被排除在进一步调查之外。采用Wilcox检验分析两组白细胞亚型的差异。并计算DLBCL患者22种白细胞亚型之间的相关性。只有绝对值大于0.15的相关系数被认为是显著的。

2.7。加权相关网络分析（WGCNA）和转录因子（TF）监管网络

为了揭示我们的IRG分类的临床意义相关的潜在的分子机制，我们探讨列入分类的18个IRGs的监管机制。首先，318个转录因子的GSE31312表达谱进行WGCNA。我们通过它的特征基因，这是我们视为代表课题组定义的每个基因模块的第一主成分。基因显着性（GS）表示模块成员和临床特征之间的相关性，并被定义为中值价值 （ ）每个TF。风险分数相关模块由 ，选择较高的GS值进行进一步研究。此外，要计算高度相关模块的转录因子与我们的分类器IRGs之间的相关性，只有绝对值为的基因 和 被保留下来并建成使用Cytoscape的网络。最后，功能富集分析了基于基因本体论（GO）和基因和基因组的京都百科全书进行（KEGG）通路研究这些基因的分子机理的研究。

2.8。统计分析

所有的分析都在R版本3.6.1和相应的包中进行。

3.结果

3.1。构建预后多IRG分类器

GSE31312、GSE32918与IRG数据集之间的1170个IRG重叠的单变量Cox回归分析(图1(一))鉴定出349个IRGs和71个IRGs为存活相关IRGs (图1 (b)）.在这两个队列中发现25个生存相关IRGs重叠，并将其纳入LASSO回归以确定预后生物标志物(图)1 (c)和1 (d)）.最后，选取18个irg构建多irg分类器(表1)1）.基于这18个IRGs的LASSO系数和表达水平，我们确定了训练队列中每个患者的中位风险评分，并将其分配到低或高风险组(图)1 (e)和1（f））.基于KM生存分析，我们发现高危组患者的OS明显短于低危组( ，数字2(一个)）.为了检验分类的预后意义，我们引入了ROC曲线。在训练队列AUC为0.741和0.758分别为三年和五年生存率，（图2 (b)）.

3.2。多IRG分类为生存而预测在外部同伙验证

为了验证分类器，我们对GSE32918和GSE10846队列进行了KM生存分析和ROC曲线。在GSE32918队列中，高危患者的生存期往往较短( ，数字2（c）），并在三五年AUC强调了多IRG分类（图的预测预后能力2（d））.用KM生存获得类似的结果（ ，数字2（e）)和ROC(图2（f）)曲线。此外，3年和5年的AUC显示，基于irg的分类器比其他临床特征有更好的预测能力(图)2（g）和2（h））.

3.3. DLBCL患者预后因素和OS的单变量和多变量Cox回归分析

在GSE31312队列和两个测试集，我们综合考虑临床特征，如子类型，年龄，性别和阶段，进行单因素和多因素Cox回归分析。这使我们能够确定多IRG分类对OS的意义。多IRG分类器被认为是用于DLBCL的独立预后工具（图3（a）和3（b），GSE31312;数字3（c）和3（d）GSE32918;和数字3（e）和3（f）GSE10846)。一项双尾Fisher测试显示，在低风险组和高危组之间，化疗反应显著不同。具体来说，高危组往往比低危组反应差，预后差( ，数字3（g））.

3.4。开发和验证列线图的

为了预测OS的个体概率和帮助临床医生DLBCL患者提供更好的医疗服务，是综合多IRG分类并构建其他临床特征（图列线图4（a））.生成校准曲线以评估ROM图的准确性。合并的载体表现良好，在预测GSE31312的患者的三年和五年生存率方面表现良好（图4（b）和4（c）)和GSE10846(图4（d）和4（e）)，其预测概率与观测值接近(图)4（b）和4（e））.在培训队列中，3年和5年生存率的AUC分别为0.799和0.823。在确定患者的预后时，nomogram预后评估图远优于分期、亚型、ECOG和其他临床病理特征(图)4（f）- - - - - -4(我)）.即使将GSE32918队列的年龄和亚型等有限信息与我们的多irg分类器相结合，DLBCL的预后准确性仍有显著提高(图)4 (j)和图4（k）的）.因此，多irg分类器为现有的DLBCL临床病理预测因子提供了额外的预后价值。

3.5。不同的免疫浸润评分和白细胞亚型定义低风险群体

我们推出的估计算法来确定三个同伙的免疫和间质评分（图5）.在培训队列中，高风险得分组倾向于免疫渗透得分低于低风险组（Wilcox测试 ，数字5（a））.结果与GSE32918一致（Wilcox测试 ，数字5（c）)和GSE10846（威尔科克斯试验） ，数字5 (e)）队列。基于免疫分数的截止值，我们分别对低免疫分数组进行了km生存分析（图5（b），GSE31312;数字5（d）GSE32918;和图5 (f)GSE10846)。结果证实了低免疫评分组与高免疫评分组相比生存率降低，间接证实了高危评分组预后不良。接下来，使用CIBERSORT算法评估22个白细胞亚型在三个DLBCL队列中的比例(图)6）.低和高危评分组由不同的免疫细胞类型组成。在DLBCL免疫细胞浸润中，记忆B细胞、naïve B细胞、CD4记忆激活T细胞、CD8 T细胞、滤泡辅助性T细胞、M2巨噬细胞占相当比例。

3.6。DLBCL患者TME成分的相关性

为了探讨DLBCL患者TME组分中的潜在关联，我们对DLBCL中的22例浸润免疫细胞进行了相关试验（图7）.在GSE31312和GSE10846队列中，M1巨噬细胞、记忆B细胞、静息肥大细胞、CD4记忆激活T细胞、静息NK细胞、CD8 T细胞和gamma delta T细胞处于相关网络的核心(图)7(一)和图7（c））.相关热线图表明CD4内存激活的T细胞与γδtt细胞正相关，对存储器B细胞负相关（图图7（b）和图7（d））.另外，静息肥大细胞与激活的NK细胞之间存在很强的正相关。而静息肥大细胞与记忆B细胞呈负相关(图)7(一)- - - - - -图7（d））.结合ESTIMATE和CIBERSORT算法，我们发现DLBCL高免疫细胞浸润组比低免疫细胞浸润组具有更高的免疫和基质评分，但肿瘤纯度较低(图)7 (e)）.

3.7。TF监管网络

TFS被整合到WGCNA中，探讨与多IRG分类器透露的临床意义相关的潜在调节机制。基于无缝线（ ）和平均连锁层次聚类，我们确定了软阈值能力，并确定了六个TF模块（图8（a）- - - - - -8 (c)）.含有15个TFs的黄色模块与DLBCL患者的风险评分相关性最强。绿色和蓝绿色模块，分别包含14和141个TFs，也与患者风险评分密切相关(图)8 (d)- - - - - -8 (h)）.三个模块的TFS与用于构造分类器的18个IRG相关。基于过滤标准（绝对值 和 ），我们在Cytoscape中建立了一个调控网络，它清楚地展示了这些irg之间的调控关系(图9(一个)）.中华人民共和国，PSMD14，FABP5，GDF2，STC2，S100A11， 和BTC代表了七个中心基因。功能富集分析确定了GO的以下生物学过程:造血调节、结缔组织发育和生长调节(图)9 (b)）.在癌症、Epstein-Barr病毒感染、人乳头瘤病毒感染、Th17细胞分化、甲状腺激素信号通路、炎症性肠病和卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染的转录调控异常中，KEGG通路显著富集(图)9 (c)）.

4.讨论

DLBCL是非霍奇金淋巴瘤最常见的亚型，是一种侵袭性、异质性的肿瘤。DLBCL的免疫治疗已取得重大进展[33- - - - - -35］.几项研究表明，TME会影响肿瘤细胞的生长和进展，与患者预后有关[10，11，26，36］.免疫浸润成分的识别可以改善患者预后，并产生预测DLBCL患者接受免疫治疗或其他治疗结果的生物标志物[10，37- - - - - -40］.

在此，我们开发并验证了一种新的工具，用于将DLBCL患者分为低风险组和高风险组进行预后分层。提出的风险评分为DLBCL的现有临床病理预测因子提供了额外的预后价值。这是第一项证明多重IRG信号作为预后预测因子的临床应用的研究DLBCL患者的诊断工具。此外，我们提出了一个预后诺模图，可以对患者的三年和五年OS概率进行个体化估计。多重IRG分类器和相关诺模图可以改善监测并指导辅助化疗和治疗的决策持续时间。

本研究已确定DLBCL患者中与OS相关的各种中枢性IRG。PTPRC（也称为CD45）是蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族的成员，参与致癌转化、细胞生长和分化[41］.这种蛋白质是T和B细胞抗原受体信号传导的重要调节器，并与多种癌症，包括多发性骨髓瘤，急性髓细胞性白血病相关联，并且巴雷特癌[42- - - - - -44.］.然而，对其在DLBCL中的作用研究尚不充分[45.］.本研究表明，PTPR施用DLBCL患者的保护作用，可能是通过转录调节。PSMD14编码26s蛋白酶组的组分，该组分参与细胞凋亡，细胞周期和DNA损伤修复[46.，47.］.S100A11是S100蛋白家族的一员，在细胞内钙信号传导中起重要作用。S100A11的表达改变和重排与肿瘤有关[48.，49.]Chan发现DLBCL患者抗原呈递细胞表达的S100与高存活率相关[40］.FABP5属于一种脂肪酸结合蛋白（FABPs）和结合到视黄酸。这种结合用作凋亡以及一个微分信号在转化的细胞[50.，51.］.FABP水平在癌症、肿瘤性皮肤细胞和胶质瘤中升高，这些细胞高度抵抗凋亡[52.- - - - - -54.］.已知抗凋亡(bcl -2表达)细胞可改变视黄酸诱导凋亡的能力[55.］.因此，探索FABP5和BCL-2之间的关联可能揭示BCL-2在DLBCL中的机械作用，并指向潜在的治疗生物标志物。GDF2（也称为BMP-9），转化生长因子的成员β超家族，促进癌细胞的增殖和迁移[56.］.细胞周期蛋白依赖性激酶4 (CDK4)是细胞周期进展的重要参与者，与DLBCL相关。CDK4抑制剂abemaciclib强烈抑制DLBCL细胞增殖并诱导凋亡[57.］.目前的结果表明CDK4与TFs KZF1和NCAPG之间存在很强的正相关。确定这种关系背后的机制可以加速开发一种合适的治疗方法。功能富集分析表明，这些基因可能参与了与癌症相关的多种途径，包括Epstein-Barr病毒感染、人乳头瘤病毒感染和Th17细胞分化。Th17细胞在DLBCL发生发展过程中可能影响患者预后并发挥抗肿瘤免疫作用。这些细胞及相关细胞因子与TME中的其他免疫细胞相互作用，提供直接或间接的抗肿瘤免疫[58.- - - - - -61.］.

使用ESTIMATE算法评估免疫微环境，我们发现在训练组和验证组中，免疫浸润程度影响DLBCL患者的OS。提示免疫浸润与DLBCL预后密切相关。TME的免疫细胞已被提议用于某些癌症的预后评估，如黑色素瘤、胃癌、肝癌和弥漫大b细胞淋巴瘤[10，62.- - - - - -65.］.

基于多IRG分类器，将DLBCL患者分配给低风险和高风险分数组。KM分析表明，在培训和验证队列中，低风险组在低风险组中的预后更好。Wilcox测试表明，低风险群体之间的基质和免疫分数均有显着差异。具体而言，低风险群体的分数较高，与更大的免疫浸润和更好的结果有关。因此，我们认为DLBCL患者的免疫浸润和OS可能受到这18个IRG的综合表达的影响。

根据CIBERSORT算法，记忆B细胞、naïve B细胞、CD4记忆激活T细胞、CD8 T细胞、滤泡辅助性T细胞、M2巨噬细胞是三个队列DLBCL患者的主要浸润免疫细胞。Wilcox试验表明，在DLBCL患者中，18个IRGs的合成表达可导致不同的免疫细胞浸润类型。在低风险组中，CD4记忆活化T细胞和滤泡辅助T细胞的比例相对较高。相比之下，记忆B细胞和naïve B细胞在高危组中相对丰富。这种差异表明，高危人群的OS较短可能是由于这四种免疫细胞类型之间的不平衡造成的。T细胞CD4记忆激活与记忆B细胞负相关。我们推测，高危组中记忆B细胞的浸润可能在某种程度上抑制了CD4记忆活化T细胞的浸润，从而导致了低、高危评分组预后的不同。

最后，我们集成了多个IRG，通过套索回归分析构建新的预后分类器，在DLBCL中是一个前所未有的方法。拟议的风险评分可以补充DLBCL的现有临床病理预测因子。分类器被确认在验证队列中具有良好的预测性能。值得注意的是，很少有研究应用于估计和cibersort算法，以探讨DLBCL中的免疫浸润。然而，缺乏调查免疫浸润的比例和特异性细胞类型的进一步实验是本研究的限制。

综上所述，多重IRG分类器可以有效地将DLBCL患者分为不同风险组。因此，IRG可以补充传统的临床病理风险因素，从而产生一个综合的预后工具。结合风险评分和现有临床预后预测因素的拟议列线图可能有助于DLBCL患者的个性化随访和管理。

数据可用性

在本研究中分析了公开的数据集。本研究中使用的数据集可以从NCBI基因表达综合（Geo，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，其登录号为GSE31312, GSE10846和GSE32918。其中一个队列样本(GSE32918)使用Illumina HumanRef-8 wt - dasl v3.0获得了Illumina基因表达谱，而两个队列样本(GSE10846和GSE31312)使用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (gh -U133 Plus_2.0)获得了Affymetrix基因表达谱。以下步骤应用于数据集筛选。（i）从Affymetrix公司的数据集的原始CEL文件进行鲁棒多阵列平均算法在软件AFFY [28]进行背景校正和分位数归一化。此外，用中值polish算法对每个转录本的寡核苷酸进行了总结[29］.使用Lumi软件对Illumina matrix文件进行分位数归一化处理。(ii) HG-U133 Plus_2.0探针使用hgu133plus2.db包进行注释。Illumina HumanRef-8 WG-DASL v3.0探针注释序列来源于GPL8432平台(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL8432）.(iii)对于同一基因对应的多个探针，我们使用平均值最大的基因。(iv)提供患者完整的基因表达谱和随访信息。

的利益冲突

提交人声明没有存在竞争利益。

作者的贡献

萧杰梁，瑞英福，何南王同等为这项工作贡献，并股票的第一作者。

致谢

来自中国国家自然科学基金的补助金（Grant No.81873450）和北京大数据，北京铜仁医院，北京大学和首都医科大学（Grant No.Bhtr-Kfjj-202009）到梁王。

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