文摘

不同胶囊(WB)是一种传统的中药配方,适用于类风湿性关节炎(RA)治疗多年。然而,其内在的分子机制仍不清楚。在这项研究中,胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠被用来观察世行的疗效在不同的时间点,使用和滑膜组织的蛋白质组学分析应用于揭示其基本分子机制。结果表明,世行不仅有效改善症状和滑膜炎,但也表达下调血清炎性细胞因子/趋化因子在CIA大鼠。此外,滑膜组织的蛋白质组学分析表明,世行可以调节几个信号通路与炎症或细胞迁移有关,如“il - 1信号”,“引发信号,”和“趋化因子受体CXCR4信号。“蛋白质的表达水平包括基质金属蛋白酶3 (MMP3) MMP19, lipopolysaccharide-binding蛋白质(LBP),丝氨酸/苏氨酸激酶interleukin-1 receptor-associated激酶4 (IRAK4)和actin-related蛋白质2/3复杂的亚基5 (ARPC5)这些通路显著下调了世行与模型组相比。总之,本研究表明,世行在CIA大鼠滑膜炎有明显的抑制影响,以及可能的机制参与表达下调几个关键蛋白质的表达水平,包括MMP3 MMP19,枸杞多糖,IRAK4, ARPC5。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性炎症性疾病发病率和伤残率高,其中一个主要的病理特征是滑膜的炎症(1,2]。滑膜细胞释放多种炎症介质,如interleukin-1β(il - 1β),肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)、活性氧(ROS),这都是炎症反应的发起者和重要监管介质在疾病的发展3]。炎症也会导致滑膜细胞的过度增生(4]。此外,滑膜纤维母细胞(FLS)滑膜组织可以促进核因子受体激活剂的生产κB配体(RANKL)和基质金属蛋白酶(MMPs),关节损伤加重。RANKL能激活巨噬细胞分化为破骨细胞,介导骨通过促进骨吸收破坏。基质金属蛋白酶是软骨退化的重要酶。因此,它是一个重要的治疗策略,抑制RA滑膜炎。众所周知,滑膜炎主要结果白细胞迁移和滑液舱的渗透,这是由丰富的粘附分子和趋化因子(5,6]。大量的渗透细胞包括粒细胞、单核细胞/巨噬细胞,B细胞和T细胞的滑膜组织中发现了RA患者(7- - - - - -10]。这些渗透细胞分泌大量的促炎细胞因子可进一步加剧滑膜的炎症反应。因此,重要的是要抑制免疫细胞的迁移到滑膜。

虽然目前类风湿性关节炎是一种不能治愈的疾病,许多有效的治疗方法已经在过去的20年(11]。病人受益于一些非甾体类抗炎药物,疾病修饰治疗风湿病的药物,和一些生物制剂(12,13]。但是,这些仍不能满足所有患者治疗选项,因为反应不足或不良事件14,15]。

不同胶囊(WB),中国食品药品监督管理局批准(批准ID: Z20080096),是一种传统的中药配方组成的十七草药。作为补充和替代药物,世行一直用于RA治疗多年,取得了一个好注意的疗效和安全性。世行可以下调促炎细胞因子的生产包括TNF -α、il - 6和IL-17α和移植抗炎细胞因子il - 10在胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠的血清16,17]。在我们之前的研究中,我们发现在CIA小鼠白平衡可以改善关节炎症状。此外,它可以减轻滑膜炎症和骨破坏通过调制功能/ RANKL系统的激活和抑制NF -κB (18]。淫羊藿,浓度同时,世行的活性成分之一,被证明是抑制细胞迁移或入侵通过调节MMP1/3表达式(19]。芍药醇也是世行的有效成分,从而减少MMP1/3的表达水平与CIA大鼠(20.]。芍药苷是世行的一个成分,改善炎症细胞浸润包括巨噬细胞和中性粒细胞通过抑制RhoA /岩石信号(21,22]。然而,世行的确切疗效和药理机制在RA,尤其是关于炎症和细胞迁移,还需要进一步调查。最近,等压标记相对和绝对量化(iTRAQ)已成为一个重要的研究方法的作用机制复杂的草药配方。同时,生物信息学分析也成为一个好的工具去探索药物的潜在机制和信号通路/网络从组学所产生的大量的数据23,24]。因此,在这项研究中,我们不仅观察到世行管理的治疗效果在CIA大鼠不同时间点,但也探讨其分子机制利用蛋白质组学分析滑膜组织,希望提供基础研究证据的合理使用白平衡。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性Wistar鼠(6 - 8周)是至关重要的河流提供的实验动物科技有限公司有限公司(中国,北京)和位于特定病原体免费条件( °C,湿度: %,12 h: 12 h黑暗)免费消毒过的水和食物。这项研究是符合指南进行护理和使用实验动物和研究伦理委员会批准的中医基础理论研究所、中国中医科学院。

2.2。CIA模型的建立

CIA模型建立了根据先前的报道(22]。牛II型胶原蛋白(Chondrex,雷蒙德,佤邦,美国)与相同体积乳化不完全弗氏佐剂(美国Chondrex,雷蒙德,佤邦)在4°C;然后,200年的老鼠接受了皮下注射μl乳液之前准备的底部的尾巴,和另一个100年μl乳液注射7天以同样的方式对提高免疫。

2.3。分组和治疗

世行购买来自中国辽宁本溪市资源Sanyao有限公司有限公司(中国辽宁,20180205)。药品样本以高效液相色谱(HPLC)指纹图谱分析(补充图。1)。药物溶解在重蒸馏的水又完全混合之前使用。老鼠被随机分为五组成功诱导后CIA模型:正常组,模型组,第一个治疗组(T1组),第二个治疗组(T2组),第三个治疗组(T3组)。每个治疗组的大鼠被填喂法与世行管理(0.74 g / kg / d,剂量相应的RA患者)每日开始十天或一天23天36第一次免疫后,分别。在正常组和模型组大鼠进行相应的重蒸馏的水的体积。治疗的方案图描述1(一)。所有的动物都牺牲了第一次免疫后65天。血清收获了多因素检测试验。膝盖关节被进行组织学分析。滑膜组织分开膝盖关节被用于蛋白质组学分析和免疫印迹。

2.4。关节炎的评估分数

在CIA大鼠关节炎的严重程度得分每三天,和后肢的关节炎评分是肿胀和发红的严重程度分级使用宏观评分系统:0点没有红肿,轻微的肿胀和/或红斑,1点为中度水肿2分,3分明显水肿有限的联合使用,和4点多余的水肿与关节刚度。的最大每鼠关节炎评分8 [22]。

2.5。多因素分析

细胞因子和趋化因子在大鼠的血清样本测量使用22-plex工具包(EBIO Procarta获得丛面板中,美国),分析是根据协议执行。所有样品都是在重复和分析化验Luminex 200 Labmap系统(美国Luminex)。

2.6。组织病理学分析

老鼠的膝关节固定在10%磷酸缓冲福尔马林3天然后在10% EDTA脱钙。组织部分被苏木精和伊红染色())。滑膜功能评分的得分0 ~ 9的规模(包括滑膜衬里细胞层增生,炎症细胞的浸润,血管翳形成)(25]。

2.7。蛋白质组学分析

iTRAQ蛋白质组学应用于分析滑膜组织的膝关节正常组,模型组,T1组。蛋白质提取、质量控制和蛋白水解作用是根据协议执行。的iTRAQ®试剂8丛(美国AB Sciex Pte . Ltd .)用于标签肽。岛津制作所的LC-20AB液相系统(日本岛津公司、日本)是用于肽分离,和肽样本分离3000年热终极UHPLC(美国圣何塞热费希尔科学)。肽分离的液相色谱法被电离,然后传递给串联质谱仪Q-Exactive高频X(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)视数据采集(DDA)模式检测。

原始质谱(MS)数据转换成吉祥物通用格式(MGF)格式,然后搜索当地吉祥物服务器。此外,执行质量控制,IQuant软应用于蛋白质的量化(26]。评估肽的信心,专业的Scrum Master™水平(psm)预滤器在PSM-level错误发现率(罗斯福)的1%。罗斯福的蛋白质也设定在1% ( )。

2.8。创新路径分析(异丙醇)

蛋白质与1.2折变化(平均值的对比组)值( - - - - - -测试的对比组)小于0.05 (DEPs)被定义为差异表达蛋白质。创新路径分析(IPA)软件被用来评估蛋白质浓缩的趋势变化。DEPs褶皱变化被输入到音标的软件,然后,函数注释,聪明才智规范化路径和通路网络生成算法根据蛋白质-蛋白质之间的关系。

2.9。免疫印迹

滑膜组织中提取蛋白质的细胞溶解根据标准方法,和15μg总蛋白质的12%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离和转移到免疫印迹聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔,德国)。膜被孵化Tris-buffered盐水Tween-20 0.1%含有5%脱脂牛奶在室温下为0.5 h。墨迹与初级抗体探测MMP3 (CST 1: 1000年,美国),MMP19(1: 1000年,Proteintech集团公司,美国),lipopolysaccharide-binding蛋白质(LBP) (Abcam 1: 1000年,美国),Arp2/3复杂5 (ARPC5)(表达载体1:1000年,美国),interleukin-1 receptor-associated激酶4 (IRAK4) (CST 1: 1000年,美国)β肌动蛋白(Beyotime生物技术1:1000年,中国)一夜之间在4°C。广泛的洗后,探讨了膜与适当的HRP-conjugated二级抗体(Beyotime生物技术1:1000年,中国),与Tris-buffered盐水洗广泛。信号检测使用Luminata干白西方合衬底(微孔、德国)和使用化学成像成像系统(美国Bio-Rad)医生联系。

2.10。统计分析

GraphPad棱镜v。6(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) was used for the statistical analyses. The Student - - - - - -测试是用于分析两组之间的差异,以及方差分析各组之间进行了比较。提出了本研究中的数据 ,在接受和统计意义值< 0.05。

3所示。结果

3.1。世行有效改善CIA大鼠的症状

确定世行在CIA大鼠的影响,世行管理开始在第十天或第一次免疫后23天或36天,分别为(图1(一))。后爪功能包括肿胀和畸形明显观察到大鼠模型组,但事件的严重性免去一些学位WB治疗组(T1、T2和T3组)与模型组相比在64天(图1 (b))。一致,关节炎评分也显著降低WB治疗后较模型组(图1 (c))。此外,没有明显的肝毒性和肾毒性WB(补充图。2)。

3.2。世行抑制CIA大鼠的关节炎症

进一步评估世行的影响在CIA大鼠,观察膝关节的组织病理学特征。与正常组相比,模型组显示积极扩张的滑膜炎症细胞的浸润。世行(T1、T2和T3组)治疗可以抑制滑膜的扩张,减轻炎症细胞的浸润在不同程度较模型组(图2)。

3.3。世行减少的水平在CIA大鼠血清炎性细胞因子/趋化因子

进一步调查世行在CIA大鼠的疗效,血清中炎性细胞因子和趋化因子的浓度是由多因素测量检测设备。肿瘤坏死因子等炎性细胞因子-αil - 1、il - 6、IL-17Aα,il - 1β2、IL-12P70干扰素-γ,g - csf以及某些趋化因子如MIP-2 IP-10显著调节与正常组相比,模型组。然而,这些介质的水平显示在T1组差别有显著的对这些(在T2组或T3组,一些但不是所有介质都显著下调)相比,模型组(图3)。

3.4。功能取决于分析的浓缩

膝关节滑膜组织的正常组,模型组,T1组处理进行蛋白质组学分析。1383 DEPs模型中发现与正常,539年世行与DEPs检测模型,和373年共享DEPs被发现在两个配对组( , 值≤0.05)(图4(一))。评估的一般特性DEPs改变由世行在滑膜组织,1383年DEPs模型和正常,539年世行与DEPs模型,分别输入到音标软件,浓缩的函数 )列表输出。炎症和白细胞浸润在RA滑膜炎扮演中心角色的进展,与炎症相关的最高浓缩功能注释和细胞迁移在这项研究进一步关注。高级函数浓缩炎症的注释是“异常数量的细胞因子”,“关节炎症”,“一氧化氮的合成”“炎症反应,”和“中性粒细胞的脱粒。“和顶级功能浓缩细胞迁移的注释是“巨噬细胞的细胞运动,”“粘附的细胞相关矩阵,”“细胞渗透,”“免疫细胞粘附,”“白细胞的细胞运动,”和“白细胞游走”(图4 (b))。

3.5。路径/网络分析

进一步探索如何白平衡调节炎症和细胞迁移,聪明才智规范的途径进行了分析和阈值被设置为 。前炎症通路是“IL-3信号”、“il - 1信号”,“抑制矩阵metalloproteases,”“据信号”,“伊诺信号,”和“引发信号”(图5(a))。顶细胞迁移途径是“嗜酸性粒细胞CCR3信号”,“趋化因子受体CXCR4信号”“白细胞溢出信号,”“RhoA信号”,“信号转导,”和“信号由ρ家庭gtpase”(图5(d))。分别两个网络生成的两个部分DEPs:炎症网络第1部分(DEP)和细胞迁移网络DEP第2部分),在炎症网络(图5(b))、DEPs包括MMP3 MMP19,枸杞多糖,IRAK4调节模式与正常但世行与模型中表达下调。列出的这些DEPs褶皱的变化(图5(c))。在细胞迁移网络(图5(e))、DEPs包括MMP3 MMP19, ARPC5调节模型与正常但世行与模型中表达下调。列出的这些DEPs褶皱的变化(图5(f))。

3.6。验证DEPs

共享DEPs(模型和正常,世行与模型) 在炎症细胞迁移网络和选择通过免疫印迹试验验证。蛋白质的表达水平(MMP3 MMP19,枸杞多糖,IRAK4 ARPC5)模型组与正常组相比有显著调节,而这些蛋白质的水平显著下调在世行组相比,模型组(图6和补充图。3)。

4所示。讨论

虽然早期诊断和治疗可以有效地缓慢进展的障碍,许多RA患者不能及时得到合适的药物,因为nonresponse或不良反应(1]。在这项研究中,我们发现,管理世行在不同时间点可以提高CIA大鼠关节炎的症状。组织病理学分析和多因素检测表明,世行管理在不同的时间点可以显著减轻滑膜炎,降低炎症因子的水平在CIA大鼠外周血。此外,世行管理,越早CIA大鼠会得到更多的利益。

众所周知,RA的标志是永存的滑膜炎症。的滑膜RA病理过程中起着核心作用。在我们之前的研究中,我们发现世行可以有效地减轻滑膜炎在CIA小鼠18),但确切机制尚未彻底调查。因此,膝关节滑液膜的正常组,模型组,第一个治疗组(T1组)收集进一步的蛋白质组学分析在这项研究。和DEPs显著富集两个类别的函数(“炎症”和“细胞迁移”)滑膜炎症方面的注意。

DEPs导致“炎症”或“细胞迁移”的类别功能复杂,所以途径分析。我们发现DEPs有助于“炎症”类信号通路包括“伊诺信号”,“il - 1信号”,“引发信号”,“抑制矩阵metalloproteases,”“IL-3信号,”和“据信号。“伊诺信号介导许多炎症或免疫反应。生产过剩的由于伊诺信号激活导致T细胞或血管内皮细胞功能障碍,在RA的发病机制中扮演着重要角色2,27,28]。il - 1在炎症反应中扮演着关键角色在RA和骨破坏29日]。阻滞剂抑制il - 1信号可以显著改善RA患者的疾病的临床和组织学参数(30.]。引发信号有助于anticitrullinated蛋白抗体(ACPA)介导的骨丢失(31日]。此外,引发信号也应该促进ACPA-induced关节炎症通过chemokine-dependent方式(32]。此外,引发能促进滑膜tissue-derived成纤维细胞迁移和入侵骨(33]。基质金属蛋白酶在RA的特点。抑制基质金属蛋白酶有助于RA治疗(34]。IL-3信号慢性炎症的病理中发挥了重要的作用35]。和睫状神经营养因子(据)是白介素家族细胞因子之一,导致滑膜炎(36]。因此,直接抑制炎症反应可能WB治疗RA的机制之一。此外,世行控制细胞迁移(如巨噬细胞和白细胞)可能提高其抗炎作用。DEPs有助于“细胞迁移”类别路径包括“嗜酸性粒细胞CCR3信号”,“趋化因子受体CXCR4信号”“白细胞溢出信号”,“RhoA信号”,“信号转导,”和“信号由家庭gtpaseρ。“这些路径由一个错综复杂的网络参与炎症细胞迁移。CCR3信号对CXCL10监管很重要通过激活和招募白细胞炎症反应,如T细胞和单核细胞(37,38]。趋化因子受体CXCR4信号作为CXCL12-CXCR4轴,可以促进细胞迁移和入侵39]。抑制趋化因子受体CXCR4信号显著抑制入侵FLS的(40]。激活白细胞溢出或整合素信号可以直接导致滑膜的炎症细胞浸润。RhoA信号和信号ρ家族gtpase参与细胞迁移或入侵41- - - - - -43]。

进一步研究蛋白质的目标,世行调节炎症和细胞迁移,产生的蛋白质相互作用网络。结果表明,世行可以抑制蛋白质的表达包括MMP3 MMP19,枸杞多糖,IRAK4, ARPC5。MMP3,被称为一个可靠的RA活动和关节破坏的标志(44),是由滑膜成纤维细胞和刺激血管渗透性,使白细胞和单核细胞从血管外渗发炎网站(45,46]。领域的中性粒细胞积聚在MMP-3下降^−−/小鼠与野生型小鼠相比,认为MMP3可以直接破坏结缔组织血管壁(47]。MMP19促进中性粒细胞迁移也在许多研究详细日期(48]。枸杞多糖,生物标志物来评估RA疾病活动(49),可能诱发巨噬细胞激活50,51]。系统和本地枸杞多糖负担与大量的活跃在关节囊、滑膜巨噬细胞52]。IRAK4调节IL-1/8信号,是一个重要的节点异常激活的可能引发炎症级联,进一步导致自身免疫反应在滑膜组织(53- - - - - -56]。Arp2/3白细胞需要迅速和有效地移动57,58]。Arp2/3-deficient细胞表现出明显慢的迁移与控制(59]。ARPC5 Arp2/3复杂的一部分,被确认为细胞迁移和入侵在许多癌(60]。虽然在RA ARPC5的功能没有被详细描述到目前为止,我们的研究表明,ARPC5可能的潜在目标之一华纳治疗。这些研究结果也提供了发展的新目标小说类风湿性关节炎药物。

总之,本研究表明,世行可以有效地抑制CIA大鼠滑膜炎症;的分子机制在一定程度上通过下调几个关键蛋白质的表达水平(MMP3 MMP19、枸杞多糖、IRAK4和ARPC5)。这项研究可能会提供一个基础研究证据合理使用世行在诊所。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

海阳蜀、英杰史进行平等的主要研究的贡献。陆Li Li Ning赵,程提供了技术支持。航Lu和小娟他设计研究和修订后的手稿。海阳蜀、英杰施正荣同样贡献了这项工作。

确认

这项研究由中国国家重点研发项目支持(2018 yfc1705205)。

补充材料

补充图1:高效液相色谱法的世行在235海里。补充图2:浓度血清AST、ALT,克雷亚,尿素在CIA大鼠。数据 , 。注意:NS:无显著差异。补充图3:原始免疫印迹图像。(补充材料)