文摘
核衣壳蛋白(NP)的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)包含免疫原性抗原表位,可以诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对病毒性感染。这使得一个合适的核衣壳蛋白开发疫苗候选人SARS-CoV-2感染。本文报道NP抗原的皮内交付使用可分解的微针贴剂可能引起显著的B细胞和T细胞反应。
1。介绍
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)引发了一场全球大流行非常迅速感染(1- - - - - -3]。候选疫苗正在测试他们防止感染/ SARS-CoV-2再感染的能力。目前,有几个有前途的spike-based疫苗从辉瑞等不同的开发人员/ BioNTech,科兴生物制品公司,但这些疫苗尚未达到消毒免疫人群中。此外,有有限的信息保护性免疫可以持续多久,尤其是变体SARS-CoV-2不断出现。Single-antigen疫苗可能容易失去保护作用由于突变。因此,我们小组的目标是调查nonspike可能引起额外的候选疫苗,长期或更完整的患者的保护性反应。除了传统的SARS-CoV-2糖蛋白(S蛋白),核衣壳蛋白(NP)已被确认为一种候选疫苗开发由于其能够诱导抗病毒细胞毒性T细胞反应(4]。NP起着至关重要的作用在病毒进入宿主细胞和调节病毒粒子装配和释放5]。值得注意的是,有许多人类白细胞抗原(HLA)绑定内肽NP,这可能主要具体CD8 +及CD4 + T细胞反应通过主要组织相容性复合体一班二班(MHC1)和主要组织相容性复合体(MHC2)途径,分别是(6]。此外,免疫印迹分析揭示了IgA的存在,IgM, N和免疫球蛋白g抗体抗原COVID-19感染病人的血清(7]。最近,Chukwudozie等人开发了一个组件(疫苗针对SARS-CoV-2核衣壳磷蛋白质的RNA结合域。这种疫苗包含抗原B细胞和T细胞抗原表位,提供足够的抗原指数和不会引起过敏的属性(8]。重要的是,彭等人透露,CD8 + T细胞反应与温和的疾病(2 - 3周恢复率),而更严重的病例SARS-CoV-2 CD8 + T细胞反应较低。通常情况下,只需要7到10天COVID-19病毒感染激活抗病毒T细胞反应的关联与温和的疾病患者所花费的时间才能恢复。这表明T细胞免疫反应中扮演重要角色的预防SARs-COV-2发病机制和可能长期保护性免疫(9]。SARS-CoV-2包括受损的树突细胞反应的发病机制以及延迟T细胞反应。这些延迟的T细胞反应表现出更强的比CD8 + T细胞CD4 + T细胞(10]。总的来说,这些初步的证据支持开发替代性nonspike候选疫苗的前景,如NP,可能引起对SARS-CoV-2特异性T细胞反应。我们小组的目标是调查microneedle-delivered NP疫苗可能引发额外的,持久的或在患者更完整的保护性反应。
存储、运输和管理SARS-CoV-2疫苗是至关重要的考虑全球流感大流行的疫苗开发和控制。绝大多数批准SARS-CoV-2疫苗,如Pfizer-BioNTech BNT162b2疫苗或现代化的信使rna - 1273疫苗,是由肌内注射(IM)。然而,这种传统的注射技术可能引起的风险有与血液相关的感染,需要训练有素的人员来执行注射(11- - - - - -15]。这些约束可以通过其他非传统技术解决。
基于微针(MN)的皮内交付提供了独特的好处,如减少生物危害废物,在室温下储存稳定,易于分布和无痛接种疫苗。抗原疫苗的背后MN交付到皮肤激活适应性免疫应答通过抗原呈递树突细胞,朗格汉斯细胞和其他细胞主要抗原免疫(16]。也的例子MN设备可以有效地交付SARS-CoV-2亚基疫苗对小鼠皮肤,如金正日和Kuwentrai的工作(17,18]。鼓励这些研究成果,我们当前的研究调查的潜在使用可分解的MNs NP的皮内交付作为替代COVID-19疫苗。独特的,我们的锰装置由NP和低分了重量(48 K)透明质酸(HA)所制定的micromolding方法(19- - - - - -23]。在小鼠模型中,NP-MNs引出重要的B细胞抗体反应和移行细胞——(IFN -γ-)基于T细胞反应相比,没有免疫控制。肺免疫组织化学分析是用于检查T细胞标记(CD4和CD8) MN接种小鼠可能发挥保护作用对呼吸道冠状病毒感染(24,25]。
2。材料和方法
2.1。核衣壳蛋白的制备
NP SARS-CoV-2(418个氨基酸)克隆和纯化大肠杆菌正如之前报道的(26]。这种蛋白质混合的比例是9:1与氢氧化铝凝胶(InvivoGen)。
2.2。MN制造
MN补丁通过micromolding生产方法。短暂,哈(分子量:48 K, 100毫克/毫升)是溶解在去离子水(100毫克/毫升)。NP (25μg)制定与氢氧化铝凝胶涡HA解决方案。接下来,50μL的混合物添加到polymethylsiloxane (PDMS)凹模和离心机在4000转3分钟,以确保所有空腔模具完全填满。在室温下干燥过夜后,额外的HA解决方案添加到表单的支持部分补丁。干燥后,补丁从micromold剥落,直到使用保存在一个干燥的盒子。
2.3。动物实验
所有BALB / c小鼠和购买实验动物获得香港大学的单位。所有动物实验委员会批准使用的动物生活在教学与研究、香港大学(# CULATR 5312 - 20)。接种疫苗是使用进行皮内交付MN-formulated NP (25μg /鼠NP(25)或皮下注射μg /老鼠)0天,3和7。血样从尾静脉获得14天,21日和28日。
2.4。干扰素-γELISPOT试验
28天,老鼠牺牲,以及脾细胞获得了IFN -γELISPOT分析。简单地说,100年μL脾细胞干扰素-孵化γELISPOT板,使用200激活30分钟μL DMEM媒体没有的边后卫。随后,5μg的肽(NP和积极的诱导物)补充道,和细胞保持了20小时37°C的5%股份2。媒体被丢弃后,细胞被洗使用洗涤缓冲和二级生物素化的抗体孵育1小时在室温下(RT)。最后,与生物素基质细胞被孵化,其次是洗涤和干燥产生可见的斑点在积极的井。
2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)
在第14天,21日和28日第一次接种疫苗,血液从尾静脉在3000转离心获得30分钟。所有小鼠血清储存在-80°C到进一步鉴定。96 - ELISA板涂有10μ克/毫升的抗原(NP)涂层介质。具体地说,100年μL的解决方案是添加到每个在4°C和停留一夜。12小时后,解决方案是丢弃,板被阻断缓冲区(5%牛奶tris-buffered盐水混合渐变20 [TBST]) 3小时rt,然后洗井和TBST六次去除牛奶沉淀。接下来,从上面收集的血清在milk-TBST连续稀释溶液在以下比例:1:3,1:12日1:48岁,1:192年,1:768年,1:1:12288年,3072年和1:49152。稀释血清添加到井和保持1小时在rt,盘子洗五次1 x TBST然后孵化老鼠免疫球蛋白,鼠标IgG1,或鼠标IgG2A milk-TBST溶液中二次抗体稀释的比例1:3000。在RT孵育1小时后,板是使用1 x TBST洗6次。接下来,100年μL (3、3 ,5、5 - - - - - -tetramethylbenzidine(三甲衬底)被添加到每个好,保持在37°C 30分钟。最后,反应了H2所以4(50μ每口井的L)和吸光度集体阅读在450海里。ELISA数据得到Varioskan闪光光谱扫描多模读者(热科学)。
2.6。Cryosectioning和共焦显微镜
老鼠牺牲后,一夜之间,肺组织被收获和修复在4% PFA在4°C温柔的颤抖。组织被洗了三次5分钟与PBS和转移到30%蔗糖溶液(每100毫升30 g蔗糖PBS)。最佳切削温度(10月)复合添加标签cryomold和嵌入组织,在15 - 20和低温恒温器部分被削减μ米使用Cryostar机器和安装在gelatine-coated组织学幻灯片。部分幻灯片服用anti-CD4(1: 50)和CD8(1: 50)鼠标主要抗体(表达载体)稀释阻断缓冲区和孵化隔夜紧随其后的Alexa488-conjugated anti-rat二级抗体。部分安装了DAPI-infused安装媒体和可视化使用荧光共焦显微镜在20×800 (LSM)。
2.7。统计分析
所有研究结果绘制在棱镜7 (GraphPad软件Inc . CA)。统计对比组未配对的ELISA分析非参数 - - - - - -测试使用棱镜7 (Mann-Whitney测试)。有关酶联免疫斑点分析的统计对比组的未配对参数 - - - - - -测试使用棱镜7。对于所有的测试, 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。皮内注射的NP MNs使用溶解
HA-based MN补丁是由一个两步micromolding方法(图1(一))[27,28]。首先,NP和HA的混合物填充MN提示在PDMS凹模腔。然后,MNs的支持使用空白HA解决方案。我们每个补丁加载( 100 MN tips) ~ 25μg NP,决心在前面研究[26]。控制补丁也没有NP。NP和控制补丁都是拇指压制成BALB / c小鼠的皮肤刮天0 3和7 ( 每组)(数据1 (b)和1 (c))。10秒postinsertion, MN脱离基础(数据的建议1 (d)和1 (e))。有MN标志应用程序之后,24小时后消失(数字1 (f)和1 (g))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.2。MN-Delivered NP诱导特定的B细胞抗体反应
具体的B细胞抗体反应后的交付NP研究通过免疫球蛋白抗体的ELISA测定血清SARS-CoV-2。有三组包括皮下注射(厘米)NP (25μMN-delivered NP (25 g /老鼠)μg /老鼠),或者MN-delivered车辆控制。没有显著区别南卡罗来纳州NP组和MN NP组(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。两组表现出强烈的免疫反应。NP抗体滴度在第14天可以看到第一次免疫后,在21天,升高,进一步增加到最大的抗体效价 在28天。28天,平均抗体效价 检测,表明MN和南卡罗来纳州的NP是非常有效的。相比之下,却没有相应的对照组免疫反应。重要的是,MN NP组表现出均衡的比例IgG1和IgG2A NP-specific抗体,这对于病毒间隙(图是至关重要的2 (e))。此外,MN NP补丁被存储在一个除湿机(25度)诱导可比NP-specific抗体对小鼠相比,刚做好的MN NP补丁在免疫后28天(图2 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。MN-Delivered NP引起特定的T细胞反应
我们调查了T细胞干扰素-γ小鼠脾细胞免疫反应的南卡罗来纳州NP, MN NP,有关酶联免疫斑点与车辆控制锰利用NP蛋白(5μg / mL)刺激器。Ionomycin作为积极的诱导物,FBS-free媒介作为消极的诱导物。如数据所示3(一个)和3 (b),重要的IFN -γ天,29日公布了T细胞的南卡罗来纳州NP和MN NP组相比,车辆和noninduced控制。干扰素-的水平升高γ生产T细胞可能产生强有力的抗病毒SARS-CoV-2防护。
(一)
(b)
3.4。小鼠肺组织内T细胞的免疫组织化学染色标记文章MN-Delivered NP的刺激
赵等人表明,委内瑞拉马脑炎经由(VRP)冠NP诱导CD4 + T细胞在肺部,在冠状和MERS-CoV保护发挥了重要作用[24]。Habel等人还显示,CD8 + T细胞反应在肺部COVID-19复苏的关键(25]。根据这些观察,我们检查CD4和CD8 T细胞标记小鼠肺邮报NPs(图的交付4)。CD4细胞染色代表辅助T细胞,而CD8细胞毒性T细胞。存在两种类型的免疫细胞在肺部MN和南卡罗来纳州交付后NP,这可能对SARS-CoV-2提供保护。
(一)
(b)
4所示。讨论和结论
本研究报告成功的皮内交付使用可分解的HA MNs NP可以诱导特定的B细胞抗体和干扰素-γ小鼠的T细胞反应。这个MN配方由NP抗原,HA和氢氧化铝凝胶辅助。
交付之前,金等人重组冠状病毒疫苗(SARS-CoV-2-S1和SARS-CoV-2-S1fRS09亚基)用羧甲基纤维素基MN交付平台(17]。此外,我们团队以前探索使用HA-based MN交付平台提供S-RBD (SARS-CoV-2-S1)在小鼠和获得相似的结果18]。在这项工作中,我们调查了使用HA-based MN交付平台交付NP在老鼠身上。背后的基本原理是说明NP作为替代抗原的免疫原性,可诱导特定B和T细胞反应以类似方式SARS-CoV-2传统突起蛋白疫苗的目标。
我们的工作支持SARS-CoV-2 NP作为替代候选疫苗。我们表明,MN NP可能引发重大的B细胞抗体反应和重要的T细胞干扰素-γ响应。值得注意的是,T细胞干扰素-γ反应对病毒抗原已报告关键抗病毒保护性因素参与根除COVID-19 [26]。T细胞反应可能至关重要的特定B细胞的诱导抗体SARS-CoV-2 [29日,30.]。赵等人此前的研究显示,CD4 + T细胞在肺部引起鼻内接种后VRP冠核衣壳蛋白,这些细胞发挥重要作用在冠状和MERS-CoV保护24]。Habel等人最近还发现CD8 + T细胞免疫病毒保护在COVID-19患者至关重要。因此,我们的肺组织进行免疫组织化学染色MN NP,南卡罗来纳州NP、和控制锰组演示CD4和CD8 T细胞标记NP免疫小鼠的肺。另一方面,王先生和他的同事发现的中和活动spike-targeting mRNA疫苗变异COVID-19应变降低,501 y。V2 (31日]。此外,最近的一项研究由李等人证明了不同的突变对飙升的影响,可能会阻碍中和抗体对抗原的影响。例如,N234Q突变对不同单克隆抗体中和灵敏度下降。是否这些突变对保护直接影响疫苗效果仍有待调查(32]。这些发现支持发展额外nonspike候选人,如NP完全消除新突变菌株。另一方面,有新兴临床研究结合不同的治疗方法。例如,洪等人管理一个14天lopinavir 400毫克和100毫克例如每12 h,利巴韦林400毫克每12 h,和三个剂量的干扰素的800万国际单位beta-1b隔天(联合治疗组)或14天lopinavir 400毫克,例如100毫克每12 h(对照组)随机分配COVID-19病人在第二阶段试验(33]。因此,另一个考虑是结合NP疫苗和疫苗,以增加疗效。有趣的是,我们还发现,有可能2蛋白结合成一个单一的微针(补充图S1)。
锰基皮内交付是一个独特的方法管理疫苗有明显益处,比如noninvasiveness,完整的生物相容性,快速接种疫苗部署,持续的药物释放,易用性和减少物流成本和浪费。在我们的工作中,我们使用可分解的HA MNs管理NP疫苗,使药物持续释放到组织层皮肤下触发适应性免疫。NP疫苗持续释放的增加药物效用降低稳态药物浓度的波动和提高药物的安全裕度活动(34]。微针贴剂( , )可能管理快速拇指按压皮肤剥落之前至少10秒钟。MN设备的快速和直接的管理过程占主导地位在传统南卡罗来纳州程序需要训练有素的人员准确皮下注射疫苗。如前所述在我们的手稿,微针穿透的小鼠皮肤导致渗透标志指示成功交付的微针组件(图1 (f))。我们发现,这些渗透标志着政府(图后一夜之间消失了1 (g))。有缺乏的小鼠皮肤疤痕还支持MN疫苗交付非侵入性的本质。50 MN设备制定使用可生物降解kDa透明质酸(HA)这是一种研究物质自然发生在皮肤上,溶解性好,缺乏报道的副作用。MN疫苗预防的可生物降解的性质要求安全针处理和浪费,不像南卡罗来纳州注射。此外,preformulated MN疫苗可以存储在室温下促进疫苗冷链有限的存储和分布在发展中国家。另外,几个因素可能会限制为NP MN交付系统的效率,如可能损失的抗原活动期间MN配方和存储。然而,我们发现特定NP MN产生的抗体的滴度方法与南卡罗来纳州注入方法(图2)。的NP-specific IgG2A和IgG1 MN NP组引起的浓度也类似,表明平衡Th2和Th1免疫力。此外,1个月的存储MN NP的除湿机似乎并不影响诱导NP特定抗体对小鼠的活动相比,刚做好的补丁(图2)。
在未来的发展阶段,MN的临床翻译疫苗技术仍然需要优化其他几个关键因素。这些因素包括确保设备不育在无菌生产实验室网站,促进具有成本效益的大规模制造,和发展中涂抹器部署MNs一致。我们希望解决这些因素在我们未来的工作优化HA MN交付人类COVID-19病人的临床测试。对于我们的未来的工作,我们还计划进行进一步的临床调查所需要的给药方案结合MN NP与MN S-RBD作为COVID-19联合疗法的病人。
数据可用性
的数据支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Chaiyaporn Kuwentrai和Jinming Yu同样这项工作。
确认
这项工作是支持的卫生和医学研究基金会(COVID190117),深圳孔雀团队项目(KQTD2015033117210153),深圳市科技创新委员会基础科学研究资助(JCYJ20170413154523577),和中国博士后科学基金会(2019 M663167) JDH。李从先承认香港城市大学的资金支持(# 9610472),一般研究基金会(平)的香港大学拨款委员会(UGC)研究资助委员会(RGC)(# 9042951),以及国家自然科学基金委/ RGC联合研究计划(N_CityU118/20)。我们愿意承认BioRender提供一个演示平台生产数据。支持JDH L & T慈善基金会。
补充材料
我们有包括一个额外的补充文件包含图形抽象和图S1。(补充材料)