文摘

背景和目的。失调的肠道微生物群中重要的肝细胞癌(HCC)的发展。然而,不知道是否和失调如何影响肝癌进展。这个横断面研究的目的是评估微生物生态失调,肠道损伤,并在肝细胞癌的不同阶段微生物易位。方法。这项研究包括74名中国男性肝癌患者。他们被分为早期( ),中间( ),和终端( )组,称为巴塞罗那临床肝癌阶段0 + A, B和C + D,分别。成对的粪便和血浆样本收集。微生物组成和配置文件被16 s rRNA基因测序分析。肠道损伤标志物的水平(再生islet-derived蛋白质3α(REG3α))和微生物易位标记(可溶性CD14 (sCD14) lipopolysaccharide-binding蛋白质(LBP),肽聚糖识别蛋白(PGRPs))测定血浆样品中通过ELISA的病人。二十血浆细胞因子和趋化因子是由Luminex决定。结果。在早期,中间,和终端组,的丰度Bifidobacteriaceae家庭显著降低(分别为3.52%、1.55%和0.56%, ),而丰富的Enterococcaceae家庭显著增加(分别为1.6%、2.9%和13.4%, )。REG3水平α,只在终端sCD14明显升高组与早期相比( 和 )和中级组( 和 )。在中间(枸杞多糖水平显著提高 )和终端( )组相比,早期组。PGRP水平升高只在终端组相比,早期组( )。的比例Enterococcaceae来Bifidobacteriaceae显著相关水平的REG3α、枸杞多糖、sCD14 PGRPs。与HCC进展、炎性细胞因子水平的提高伴随着T cell-immunosuppressive反应和微生物易位观察。结论。肠道微生物群组成和功能转变,一起提升肠道损伤和微生物易位,可能促进肝癌发展通过刺激炎症反应和抑制T细胞的反应。

1。介绍

肝细胞癌(HCC)是全球癌症死亡的第三大原因1]。然而,这种现象的潜在机制仍知之甚少。最近,越来越多的证据表明之间的关系失调,肠道微生物组和肝细胞癌发展(2- - - - - -4]。然而,只有一个报告中,大量的促炎的细菌肠杆菌科倾向于增加平行与肝癌的进展(5]。研究结果表明,微生物群失调可以调节先天免疫系统,促进肝脏疾病(6- - - - - -8]。

除了肠道菌群失调,肠道通透性也发现与肝细胞癌。最近的一项研究报道,肠道通透性明显高于肝细胞癌患者与健康人相比(9]。微生物对肝硬化易位的影响研究(10),但不是肝癌研究的。因此,该横断面研究的目的是评估微生物生态失调,肠道损伤,和微生物易位在74年男性患者在肝细胞癌的不同阶段。细胞因子的水平,这反映了炎症和免疫反应,也测量。这是推测失调一起增加微生物易位可能会影响肝癌进展通过调节系统性炎症和免疫反应。

2。材料和方法

2.1。病人的选择

肝癌患者承认北京佑安医院从2018年6月到2019年9月在本研究招募了。这项研究是由北京佑安医院伦理委员会批准,首都医科大学(2018 - 038)。所有的病人提供书面知情同意。

肝细胞癌的诊断是遵循国际准则(11]。入选标准如下:肝细胞癌; 年;男性性;和乙型肝炎病毒(HBV)病毒表面抗原阳性或anti-hepatitis C (anti-HCV)抗体阳性。排除标准如下:患有肝脏疾病的其他原因,如非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、淤胆型肝病。肠易激综合症患者或炎症性肠病;以外的其他癌症肝细胞癌;和自身免疫性疾病或严重的心脏、肾脏和呼吸道疾病也被排除在外。没有抗生素,益生菌,和免疫抑制药物前2周内样本集合。

肝癌是根据巴塞罗那临床肝癌(BCLC)分期系统(12]。阶段0指单身 和儿童被定义为单个或三个阶段 和儿童A或B阶段称为multinodules患者和儿童患者A或B阶段C由门户入侵或肝外扩散和儿童A或B D阶段包括肝癌患者和儿童C在目前的研究中,肝细胞癌患者分为早期,中间,和终端组,这称为阶段0 + A, B和C + D,分别。

2.2。粪便样本收集、DNA提取和聚合酶链反应序列

每个新鲜粪便样本分成两个管含有细菌RNA储物柜(Youkang,南京,中国)和存储在-80°C。总细菌的DNA分离粪便样本使用QIAamp快速DNA凳子迷你包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的指示和稀释后1 ng /μL使用无菌水。原核的V4-V5地区16 s rRNA基因放大使用通用引物对515 f (5 - - - - - -GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3 )和909 r (5 - - - - - -CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3 )条形码然后测序和分析13]。选择V4-V5地区的原因是我们还想检测低丰富的细菌样本(5,14]。成对的粪便样本来自20个患者测序验证结果。测序图书馆使用TruSeq生成DNA聚合酶连锁反应(PCR)免费样品制备设备(Illumina公司、美国),和索引代码添加了。放大产品在Illumina公司HiSeq 2500测序平台,和250 bp paired-end读取生成。测序数据分析使用定量见解微生物生态学(QIIME)平台1.9版本和R v3.3.1 [15]。paired-end读取DNA片段的合并使用FLASH (v1.2.7) [16]。

2.3。操作分类单元聚类和分类注释

97%以上的序列相似性被分配到相同的业务分类单元(辣子鸡)。OTU分类是由运行一个基本的局部比对搜索工具(爆炸)针对绿色煤电数据库搜索使用代表序列设置为一个查询。代表每个OTU序列筛查进一步注释。序列的注释使用RDP分类器V.2.6根据开发人员的文件(http://rdp.cme.msu.edu/classifier/class_help.jsp相依)[17]。

2.4。细菌多样性分析

细菌多样性是由sampling-based OTU分析。它提出了观察到的物种指数,Chao1指数,香农指数和辛普森指数,所有这些计算使用R素食程序包(18]。

2.5。微生物群落结构和OTU生物标志物识别

主成分分析(PCA)是由R包(http://www.R-project.org/)。的加权和不加权的UniFrac距离计算phyloseq包(19]。线性判别分析(LDA)效果(LEfSe)模型被用来确定phylotypes[微生物群组成的差异20.]。根据归一化相对丰度矩阵,类群明显不同丰度测定LEfSe利用克鲁斯卡尔-沃利斯排名和测试。

2.6。测定血浆内脏损伤的生物标记物和微生物易位

肠道损伤的等离子体标记,再生(REG3 islet-derived蛋白质α),确定了使用酶联免疫试剂盒(研发系统、在加拿大)。可溶性CD14 (sCD14) lipopolysaccharide-binding蛋白质(LBP),和肽聚糖识别蛋白(PGRPs)被选为微生物易位标记。ELISA试剂盒是人类CD14 Quantikine酶联免疫试剂盒(Bio-Techne有限公司,阿宾顿、英国),人类枸杞多糖DuoSet酶联免疫试剂盒(Bio-Techne有限公司),和人类PGRPs酶联免疫试剂盒(热费希尔,Merelbeke,比利时)。所有分析都在重复执行制造商的协议。

2.7。测定血浆细胞因子和趋化因子

炎症20-Plex人类ProcartaPlex面板(epx200 - 12185 - 901, Affymetrix eBioscience,维也纳,奥地利)是用于检测20个细胞因子和趋化因子的表达。粒细胞集落刺激因子(gm - csf)、细胞间细胞粘附molecule-1 (ICAM-1)、干扰素-α(IFN -α),干扰素-γ,interleukin-1α(il - 1α),il - 1βil - 10、il - 4、il - 6,引发,IL-12p70, IL-13, IL-17A,干扰素诱导protein-10 (IP-10)、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白- 1α(MIP-1α),MIP-1β、sE-selectin sP-selectin,肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)。

2.8。统计分析

单向方差分析被用来评估三组之间的差异。连续变量使用Wilcoxon排名和比较两组之间的测试。确切概率法相比,分类变量。使用非参数的相关性进行了斯皮尔曼测试。一个双边值< 0.05显示显著差异。区别的特性的阈值对数LDA得分是2。统计分析进行了使用GraphPad Prism 6.0 (La Jolla、钙、美国)。使用SPSS 24.0进行多变量分析(IBM SPSS)。相关性分析是由R i386软件(v.4.0.5)。

此外,介绍了指数来衡量生态失调的程度。这个指数基于计算的相对丰度的比值Enterococcaceae家庭的Bifidobacteriaceae家庭。比例计算如下:

3所示。结果

3.1。病人的特点

总之,74名男性肝癌患者包括在内。平均年龄为61.00岁(53.00 - -65.00)年。患者,早期组包括7期0和12期肝癌;中间组包括37个阶段B肝细胞癌患者;和终端组包括8阶段患者C与D阶段肝细胞癌和10。其中,37患者乙肝病毒和其他的丙肝病毒。人口统计资料和实验室结果列在表中1和补充表1。

3.2。肠道微生物多样性下降与HCC进展

月初OTU数量、中间和终端组 , ,和 ,分别。观察到的物种和Chao1指标显著降低从早期到中期和终端组(观察到的物种, 和0.038;Chao1, 和0.042;数据1(一)和1 (b)),而均匀度下降(香农, 和0.039;辛普森, 和0.028;数据1 (c)和1 (d))。结果表明,辣子鸡是均匀变化的贡献与HCC进展。

3.3。肠道微生物的概要文件和作品与HCC进展转移

的主成分分析β多样性指数允许任意两组之间的分离,这表明每组的细菌谱是杰出的(图1 (e))。三组之间的不同类群被LDA分析总结在图1 (f)。和的比值Enterococcaceae来Bifidobacteriaceae家庭从早期组到终端组显著增加(1.5和9.6, ;图1 (g))。丰富的放线菌门(4.46%比0.88%, ;图2(一个)),Bifidobacteriaceae家庭(3.52%比0.56%, ;图2 (b)),双歧杆菌属属(3.51%比0.56%, ;图2 (c))显著降低终端组相比,早期组。与此同时,大量的Enterococcaceae(1.6%比13.4%, ),肠球菌属(1.6%比13.4%, ),和肠杆菌科家庭(7.7%比10.3%, )与疾病进展明显增加。Lachnospiraceae,Peptostreptococcaceae,不明梭菌属的,Coriobacteriaceae,Christensenellaceae家庭被浓缩在早期组;然而,他们明显减少或甚至在终端组(所有检测不到值< 0.05)。相应地,在属级,五属属于Lachnospiraceae家庭(Blautia,Fusicatenibacter,Agathobacter,Anaerostipes,Dorea),属属于之一梭菌属的家庭(不明梭菌属的)和两个属Peptostreptococcaceae家庭(Romboutsia和Intestinibacter)也被浓缩在早期组和减少或甚至检测不到终端组。所有的短链脂肪酸的变化——(SCFA)生产细菌前面提到的导致丰富的减少以及肝癌进展。

3.4。肠道损伤增加终端组的病人

REG3α是一个著名的肠道损伤的标志(21]。等离子体的REG3水平α在患者显著增加终端组( )比早期的( , )和中级组( , ;图3(一个))。

3.5。等离子体的微生物水平易位标记终端组患者中升高

等离子体sCD14终端组升高( )与早期相比 , )和中级组( , ;图3 (b))。枸杞多糖水平升高在中间( )和终端组( )与早期相比集团( , 和0.025;图3 (c))。PGRP水平显著增加终端组( )与早期相比集团( , ;图3 (d))。

3.6。细胞因子和趋化因子水平

T细胞免疫与响应相关的细胞因子和趋化因子,包括干扰素-γ、il - 4、IL-12p70 IL-13 IL-17A,显示下降趋势从早期到中间和终端组,但无显著差异。MCP-1水平显著降低终端组(74.69 ng / mL)与早期相比(108.26 ng / mL, )和中级组(90.70 ng / mL, ;图4(一))。趋化因子的水平,包括gm - csf, sE-selectin sP-selectin,倾向于减少终端组没有显著差异。其他促炎细胞因子的水平,包括il - 1α、il - 6、il - 10、IP-10 MIP-1α,MIP-1β,增加终端组,但无显著差异。引发水平显著增加终端组(16.31 ng / mL)与早期相比(7.42 ng / mL, )和中级组(6.80 ng / mL, ;图4 (b))。这些结果表明HCC进展是高架炎症反应和抑制T细胞免疫反应。20个细胞因子和趋化因子的血浆水平补充表中进行了总结2。

3.7。肝癌进展之间的关系,肠道损伤,微生物易位,炎性细胞因子在肝细胞癌患者

il - 6和引发水平呈正相关的标记微生物易位,但没有与REG3α或细菌的变化。il - 6水平与sCD14水平呈正相关( , )和枸杞多糖水平( , ;数据5(一个)和5 (b))。他们标记的革兰氏阴性细菌易位。引发水平与sCD14 ( , )和PGRP ( , ;数据5 (c)和5 (d))的水平,这是一个标志的革兰氏阳性细菌易位。MCP-1水平负相关与枸杞多糖( , )和PGRP水平( , ;数据5 (e)和5 (f))。之间不存在相关性血浆TNF -α水平和任何上述索引。

3.8。的比例Enterococcaceae来Bifidobacteriaceae与REG3的水平α和细菌易位的标志

这两个α多样性和β多样性可以区分终端肝癌组与其他两组,肠道损伤和微生物易位标记。因此,内脏相关微生物群变化是否与肠道屏障完整性的丧失和循环微生物易位在HCC进展评估。LDA水平显示大量的减少Bifidobacteriaceae家庭和大量的增加Enterococcaceae家庭与HCC进展。的比例Enterococcaceae来Bifidobacteriaceae与肠道损伤标志物的表达REG3吗α( , )和细菌易位标记,sCD14 ( , ),枸杞多糖( , ),和PGRP ( , ;表2)。然而,比没有与il - 6水平和引发的。

4所示。讨论

本研究第一次表明,改变肠道微生物群,提高肠道损伤,和细菌易位与HCC进展有关。肠道失调HCC的特点是大量的增加Enterococcaceae和肠杆菌科和减少大量的Bifidobacteriaceae和SCFA-producing细菌。海拔引起的炎症反应和抑制T细胞免疫微生物产品可能是肝癌进展的机制之一。

本研究中的数据表明,肠道微生物丰富度显著降低终端组相比,早期组。丰富的减少主要是由于减少SCFA-producing细菌的丰度。与以前的研究结果是一致的。研究表明,α多样性显著降低患者BCLC阶段C和D阶段肝细胞癌(HCC与病人5]。另一个类似的研究显示,大量的SCFA-producing HCC患者的家庭成员大幅下降,而乙型肝炎患者(4]。SCFA-producing已知细菌参与发酵过程中饮食纤维SCFAs [22]。SCFAs肠肠上皮细胞的主要能量来源,是至关重要的维持紧密连接和肠道屏障的完整性(23]。然而,在这项研究中,大量的SCFA-producing细菌没有与肠道损伤的血清标记物的表达和微生物易位。这是猜测,多个机制可能参与SCFA生产和并不一定只取决于SCFA-producing细菌的丰度的变化。

除了前面提到的肠道微生物群的变化,另一个主要变化是丰富的Bifidobacteriaceae减少与HCC进展伴随着大量的增加Enterococcaceae。双歧杆菌可以加强肠道屏障功能,减少粘膜炎症,保护肝脏免受损伤(24]。管理双歧杆菌可以减轻diethylnitrosamine——(DEN)诱导hepatocarcinogenesis在小鼠模型25]。肠球菌被认为是致病菌。的过快增长肠球菌导致释放大量的多糖和有限合伙人,而反过来,增加肠道通透性,促进微生物易位。在这项研究中,这一比率Enterococcaceae来Bifidobacteriaceae显著相关的肠道损伤的血清标记物的表达,微生物易位,HCC进展。因此,比率被认为是理想的定量HCC患者肠道失调状态的标志。大量的比率厚壁菌门来拟杆菌门(26]或丰富的属的比例双歧杆菌属对家庭肠杆菌科与慢性肝脏疾病的进展27]。然而,三组之间的比率是相似的。在未来应该进行更多的研究来证实这些结果。

肠道损伤的变化和微生物易位生物标志物随后被发现由于肠道失调之间的密切关系和微生物易位。REG3α是一个c型凝集素抗菌肽分泌到肠道流明Paneth细胞(28]。REG3α侵入到血液中当肠道屏障的完整性受损(29日]。因此,REG3的循环水平α接受肠道损伤的标志。以前的研究报道,增加REG3α水平总是观察患者的肠病,如克罗恩氏和腹腔疾病,溃疡性结肠炎,移植物抗宿主病(29日- - - - - -31日]。这项研究的结果表明,肠道损伤逐渐恶化以及肝癌进展和推动更多的微生物产品的转移到血液中(32,33]。这项研究是第一个显示肠道损伤和肝细胞癌进展之间的关系。

这项研究还发现,与HCC进展增加肠道细菌易位。枸杞多糖是一个著名的[肠道细菌易位的标志34]。sCD14标记的革兰氏阴性细菌易位,LPS刺激后激活的骨髓细胞分泌的(35]。PGRP是肽聚糖识别蛋白和革兰氏阳性细菌易位的标志(10]。本研究结果显示海拔在上述标记与HCC进展的水平。此外,枸杞多糖和sCD14水平与il - 6水平增加,同时增加sCD14和PGRP水平与引发的水平。理论上,sCD14和枸杞多糖水平升高表示增加有限合伙人的循环。有限合伙人导致促炎细胞因子的释放,如il - 6和引发,T细胞。慢性炎症导致肝损伤和肝细胞癌进展(36,37]。因此,它是合理的,细菌易位与HCC进展相关。但是,没有关系被发现肠道渗透性和微生物之间的易位。这可能是由于细菌易位通过不同的机制除了肠道的完整性。相反,肠道屏障的损害可能还不足以引起细菌易位,除非额外机制复杂的主机和肠道微生物之间的相互作用失败了。类似的结果也被酒精使用障碍患者中观察到。在这项研究中,没有观察到相关性与肠道通透性标记,虽然这三个标记的水平明显升高(10]。

本研究的另一个发现是炎症反应的高程剖面在HCC进展,由il - 6和引发。引发嗜中性粒细胞招募和激活的关键因素,也促进了血管生成和转移(38,39]。之前的一项研究发现,高血清引发的一个有意义的预测乙肝病毒,与丙肝肝细胞癌患者细胞因子(40]。此外,T cell-attracting趋化因子,终端组MCP-1水平显著降低,表明T细胞免疫反应的减少。其他细胞因子的水平,如干扰素-γ,签名Th1细胞的细胞因子;il - 4和IL-13签名Th2细胞的细胞因子;和签名IL-17 Th17细胞的细胞因子,同时减少但没有显著差异。这些结果反映了全面的免疫抑制肝癌晚期。结果是符合的体外研究。研究表明,细菌提取物HCC患者微生物群引起T cell-immunosuppressive表型(41]。众所周知,SCFAs可以促进和调节Treg细胞的分化和凋亡42]。根据一项研究,这项研究的结果,一种独特的微生物,以减少大量的SCFA-producing细菌,可以调节外周免疫反应,导致HCC进展。

本研究的一个限制是,没有可以推导出因果关系。肠道微生物的变化是否资料、肠道通透性,或者细菌易位是肝癌进展的原因或结果需要进一步验证在动物模型。本研究的其他限制缺乏地理研究群体的代表。在一个大医院在北京,大多数病人来自中国北方。第三个限制是缺乏与健康对照组。然而,这项研究的目的是评估和比较肠道菌群失调在肝细胞癌的不同阶段与肠道损伤和细菌易位和他们的关系。考虑到性别的影响肠道微生物群,只有男性患者包括在内。肝癌的原因只是乙肝病毒和丙肝病毒,所以结果需要进一步验证的其他原因。最后,T细胞功能应该直接检测证实本研究的结果。

5。结论

本研究表明,肠道微生物群的生态失调,肠道通透性增加和微生物易位,与高循环炎症反应在HCC进展和降低T细胞反应。这一研究获得的结果也表明,肠道微生物群可能是一个潜在的肝细胞癌的治疗和干预的目标,尤其是在晚期肝癌。

缩写

乙肝病毒:	乙型肝炎病毒
肝细胞癌:	肝细胞癌
丙肝病毒:	丙型肝炎病毒
腰痛:	Lipopolysaccharide-binding蛋白质
有限合伙人:	脂多糖
MT:	微生物易位
辣子鸡:	操作分类单位
PGRPs:	肽聚糖识别蛋白
REG3α:	再生islet-derived蛋白3α
sCD14:	可溶性CD14
SCFAs:	短链脂肪酸。

数据可用性

临床特征的数据,相对丰富的肠道微生物群,和等离子体的REG3水平α枸杞多糖,sCD14 PGRPs、细胞因子和趋化因子的个人包括用于支持本研究的发现在补充表。

附加分

摘要/要点。这项研究显示,肠道微生物群组成和功能变化与肝细胞癌(HCC)进展,尤其是在末期。机制可能包括肠道通透性升高和微生物易位与失调有关。伴随增加系统性炎症和免疫抑制似乎促进肝癌进展。增加的比例Enterococcaceae来Bifidobacteriaceae可以作为生物标志物肝癌发展的失调。

信息披露

资助机构没有参与研究设计、数据收集、数据分析和解释,或写报告的。

的利益冲突

所有作者报告任何与本研究相关的利益冲突。

作者的贡献

Q.H.,N.Z.,和J.Z. conceptualized and designed the study. Y.G., N.Z., H.Y., S.L., N.C., Y.L., and J.Z. performed sample collection and data acquisition. N.Z., Y.G., J.Z., and Q.H. analyzed and interpreted the data. N.Z., Y.G., Q.H., and J.Z. prepared the original draft. Q.H. and J.Z. wrote and reviewed the manuscript. All authors read and agreed to the published version of the manuscript. Nan Zhang and Yusong Gou contributed equally to this study.

确认

感谢所有作者同意参与本研究的患者。本研究在一定程度上支持的开放资金转化研究的重点实验室乙型肝炎和肝癌北京佑安医院(BJYAHKF2018002);北京佑安医院的临床研究基金,卡耐基-梅隆(YNKTTS20180108);和微生物资源中心(没有国家的基金。病原体nmrc - 2021 - 2)和国家资源中心(NPRC-32)。

补充材料

补充1。补充表1:研究对象的详细信息。

补充2。补充表2:20早期血浆细胞因子和趋化因子的浓度,作为中介,和终端组肝癌患者。