文摘

perfringens梭状芽胞杆菌(CP)是鸡坏死性肠炎的主要致病细菌(NE),全球家禽中造成巨大的经济损失。尽管众所周知,益生菌提供多个优点,所知甚少的潜在影响枯草芽孢杆菌(B。细小在预防CP-induced坏死性肠炎)应用程序。在这项研究中,450名男性阿伯英亩肉鸡被分成5实验治疗:答:基底饮食(对照组);B:基底饮食和CP挑战(模型组);C: CP挑战+ 10毫克/公斤enramycin(阳性对照组);D: CP +挑战 饲料B。细小PB6 (PB6低剂量组);和E: CP +挑战 饲料B。细小PB6 (PB6高剂量组)。有6笔复制/治疗每笔15肉鸡。目前的研究检查的影响枯草芽孢杆菌PB6 (B。细小PB6)对生长性能、肠道细胞因子mRNA的表达和紧密连接,并与CP在肉鸡肠道菌群构成挑战。整个实验分为两个阶段:non-CP挑战阶段(d0-18)和CP (d18-26)挑战阶段。PB6没有提高生长性能在第一阶段,但PB6高剂量组发现有大的身体体重增加和ADFI CP挑战阶段。饲料补充与PB6挑战小鸡的病变评分降低,增加紧junction-related基因表达(occludin和佐薇- - - - - -1)和减少肿瘤坏死因子- - - - - -α表达与CP-infected鸟类。大量的减少习梭状芽胞杆菌,Streptococcu年代,葡萄球菌观察后CP感染( ),而补充PB6恢复回肠微生物组成。总之,政府的B。细小PB6改善生长性能、增强肠道屏障功能,和减轻肠道炎症/损伤,这可能是由于其恢复影响回肠微生物组成CP-challenged肉鸡。

1。介绍

坏死性肠炎(NE)是一种严重的细菌性疾病在家禽中导致毁灭性的经济损失。perfringens梭状芽胞杆菌(CP)、厌氧的革兰氏阳性细菌,是东北的主要病原体。事实上,CP是肠道共生菌的鸟类之一,和健康的鸟类通常港10⁴CP / g的CFU digesta肠。CP是一个投机取巧的病原体在某些情况下,如膳食营养风险(不平衡的饮食配方,营养因子和质量的原材料),疾病挑战(球虫病、传染性法氏囊病毒)和管理(高温)不足,增加扩散~ 10⁷到10⁹CFU / g digesta [1),导致临床NE的迹象。家禽生产中,亚临床不导致重大经济损失由于小肠病变,进而减少体重增加(伯明翰线规)和削弱了饲料转化率(货代)2]。鸡鸡是CP的水库和受污染的产品也代表一个潜在的公共食品安全威胁(3]。在人类医学,梭菌属的受污染的食物可以治疗与外科清创术和口服抗生素治疗。然而,抗生素耐药性在厌氧细菌,如梭菌属的全世界的物种,增加(4]。因此,一个有效的和自然的方法来克服NE的鸡肉生产postantibiotic年龄是必要的。

补充益生菌已被证明是一种有效的自然方法调节肠道菌群在人类和家畜,可以采取如下:(a)的支撑的肠道微生物区系的生态系统维持有益微生物区系殖民和抑制病原体扩散,(b)增加内源性消化酶的消化助推器活动和消化不良和降低消化营养发酵抑制细菌酶的活性,以及(c)积极的免疫调制器通过维持肠道的完整性(5]。同时,合格的益生菌有能力克服不稳定的元素,如胃酸、胆汁酸、内源性蛋白酶,与其他微生物和竞争。因此,枯草芽孢杆菌(B。细小)是一种广泛采用的益生菌菌种有许多优势。孢子形成的兼性厌氧菌,它具有较强的耐热性,可以持续8分钟高温113°C,从而增加其生存在饲料加工的可能性。与此同时,芽孢杆菌孢子有很强的抗压力和可以在胃肠道中生存环境恶劣的条件下,如低pH值和胆汁盐(6]。共生细菌,B。细小PB6 (ATCC-PTA 6737)已被证明产生抗菌物质,对众多压力范围广泛的活动在体外,包括弯曲杆菌种虫害和梭状芽胞杆菌spp。7]。此外,研究表明补充B。细小PB6减轻CP-induced肠道病变并加强肠道屏障功能在肉鸡8]。然而,潜在的影响B。细小PB6管理肠道微生物群组成及肠道炎症损伤CP-challenged鸟仍然是难以捉摸的。在这里,我们试图确定的影响B。细小PB6政府对经济增长的表现,病变分数,肠道紧密连接(套)、促炎细胞因子,并与CP在肉鸡肠道微生物群构成挑战。

2。材料和方法

2.1。动物、饮食和住房

总共450名男性阿伯英亩肉鸡被分为5个实验小组,每一个都是复制6乘以15肉鸡/复制。实验伦理批准的动物保健和使用委员会中国农业大学。所有的治疗方法如下:答:基底饮食;B:基底饮食+ CP的挑战;C: CP + 10毫克/公斤enramycin挑战;D: CP +挑战 的B。细小PB6;和E: CP +挑战 的B。细小PB6。最初的应变B。细小PB6从Kemin获得中国技术有限公司有限公司,珠海,中国。肉鸡生长在一个受控环境和允许的随意获得水和饲料。重复的不同治疗方式均分布在笼子里尽可能减少变异在笼子里级别。整个实验分为两个阶段:non-CP挑战阶段(d0-18)和CP挑战阶段(d18-26)。

所有指令后的饮食设计NRC(1994)和中国鸡喂养标准(NY / t - 33 - 2004)(表1)。CP的挑战是执行的基础上研究刘et al。9]。

CP类型的现场应变tryptone-sulfite-cycloserine琼脂(CVCC2030)培养,和一个菌落接种到一个煮熟的肉中,随后在孵化器培养37°C 8个小时。感染组、鸡与1毫升口服接种细菌的解决方案包含10⁸CFU /毫升CP从19到25天每天一次。鸡在基底饮食组受到上述相同填喂法过程但灭菌介质。

2.2。生长性能

死亡率记录整个实验。鸡的身体重量测量0天,18天,最后一天(26天)。采食量(FI)、身体体重增加(伯明翰线规),饲料转化率(货代)计算和记录进行进一步分析。

2.3。病变评分

在26天肠道评分评估。每个重复的随机选择鸡被颈椎脱位,然后接受肠道得分。肠道被切开,得分为NE病变。具体地说,观察肠道后,肠道病变被评为从0到4点的方法Dahiya et al。10]。

2.4。促炎细胞因子和紧密连接蛋白基因的表达

空肠样本收集的肉鸡随机选择从每26天复制并存储在-80°C RNA提取。提取RNA,反转录和量化方法进行根据王et al。11]。简而言之,总RNA提取试剂盒试剂,执行和RNA质量和浓度检测到NanoDrop分光光度计(nd - 2000紫外可见;热科学Inc .)。RNA逆转录和实时荧光定量进行与豆类试剂后,制造商的指示(豆类生物技术有限公司)。ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统公司)是用于实时荧光定量检测。β肌动蛋白被用作参考基因规范化相对RNA表达。的引物序列β肌动蛋白、occludin ZO-1、TLR4、il - 1β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ表中列出2。每个样本以一式三份,平均价值计算。2^{- - - - - -ΔΔ}Ct方法用于计算相对目标基因的mRNA表达(12]。

2.5。焦磷酸测序的回肠微生物群

26天,肉用鸡回肠digesta取样。DNA提取回肠digesta使用QIAamp®快速DNA凳子迷你包(试剂盒有限公司、德国)根据指导方针。根据Illumina公司列出的规范,所有MiSeq创作测序DNA样本进行预处理。V3-V4地区16 s rRNA基因放大,和Illumina公司指数在两个单独的pcr引物被附加。

FLASH软件(v1.2.7)是用于生成原始标签(13]。有效UCHIME算法获得的标签(14[]和QIIME (v1.7.0)分析15]。UPARSE软件(v7.0.1001)被用来分析序列,序列是聚集在97%相似性作为操作类群(辣子鸡)。GreenGene数据库被用来比较序列和分类这些序列的不同分类水平。微生物多样性检测通过QIIME软件和Python脚本。

2.6。统计分析

数据,包括增长表现,病变分数,和肠道紧密连接和促炎细胞因子的基因表达定量参数的收集,分析了使用方差分析(方差分析)在一个完全随机设计。治疗之间的显著差异测量时使用邓肯的多重比较和被宣布 。

3所示。结果

3.1。的影响枯草芽孢杆菌PB6在肉鸡生长性能与挑战perfringens梭状芽胞杆菌

如表所示3之前,鸟类的人受到CP(天队),未发现差异治疗组( )。然而,在CP挑战时期,CP感染显著降低伯明翰线规和ADFI ( )和倾向于增加货物收据( )与对照组相比。然而,添加enramycin数值增加了伯明翰线规CP-infected小鸡( )。此外,添加低剂量的B。细小PB6增加了伯明翰线规( )并倾向于增加ADFI ( )CP-challenged小鸡,添加高剂量的B。细小PB6显著增加的伯明翰线规和ADIF CP-challenged小鸡( )。

3.2。的影响枯草芽孢杆菌PB6在肉鸡肠道损伤和基因表达的挑战perfringens梭状芽胞杆菌

如表所示4,CP感染显著增加肠道病变评分较对照组( )。然而,饮食增加enramycin和低和高剂量的B。细小PB6显著降低肠道病变的CP-infected肉鸡( )。

与对照组相比,CP的挑战导致显著降低空肠occludin的mRNA表达( )和倾向于移植肿瘤坏死因子-α表达式( )。然而,补充与enramycin调节occludin的表达和表达下调TNF -α表达式的空肠CP-infected鸟类( )。此外,美联储感染肉鸡与低剂量的饮食B。细小PB6显示最高ZO-1 mRNA表达在所有组( )occludin的表情,相对高于CP-infected鸟类( )。受感染的鸟类美联储与高剂量的饮食B。细小PB6 TNF的表达较低α( )和相对较高的occludin表达式( )受感染的鸟类比美联储基底的饮食。

3.3。肠道微生物群测序数据的质量

辣子鸡是分配和嵌合体被移除后,1965036年取得了有效的序列从30回肠样本,和56143序列共享的一个示例。读取长度范围从220到500碱基对(bp),和读取长度中值为427个基点。OTU人数确定。如图1(一)109辣子鸡被共享的五组,112年,32岁,111年,24岁,在每组93辣子鸡是专属。

3.4。的影响枯草芽孢杆菌PB6在肉鸡肠道细菌结构和多样性的挑战perfringens梭状芽胞杆菌

Phylum-level微生物群分析显示厚壁菌门(89.97%),变形菌门(7.67%)和拟杆菌门(1.78%)(图1 (b))是最主要的三个类群,占99.42%的所有序列组。补充与enramycin减少厚壁菌门回肠的丰度。如图1 (c)的分析回肠社区在属级显示乳酸菌(69.63%),习梭状芽胞杆菌(11.70%),埃希氏杆菌属(4.24%),链球菌(1.92%)和Brevundimonas(1.44%)的五个主要属。

进一步的统计数据进行了识别差异回肠社区在属级的组,如图1 (d)。CP显著减少大量的挑战习梭状芽胞杆菌,Streptococcu年代,葡萄球菌与对照组相比,( ),而补充enramycin和低剂量B。细小PB6提出这些细菌丰度水平类似nonchallenge鸟类( )。鸟儿喂食高剂量B。细小PB6有更多习梭状芽胞杆菌比其他组( )。LEfSe分析表明,18个不同的丰富的细菌演化支分布到所有分类(LDA的水平 )(图5中治疗2(一个))。相对丰度最高习梭状芽胞杆菌,Peptostreptococcaceae,Desulfovibrionaceae,葡萄球菌显示在所有治疗对照组(LDA吗 )。此外,补充enramycin增加的相对丰度Bosea和Xanthomonadaceae(LDA )。与低剂量的补充B。细小PB6增加链球菌丰富(LDA ),而与高剂量的补充B。细小PB6增加梭状芽胞杆菌丰富(LDA )。图2 (b)显示了回肠微生物α多样性。没有明显差异的多样性指数(Shannon)在所有组( )。β多样性通过PCoA图了2 (c),没有区分集群的回肠样品在不同的治疗方法。

4所示。讨论

致病菌,如perfringens梭状芽胞杆菌(CP),可导致动物体内平衡和不平衡对身体损害和严重影响动物生长性能(16]。大量的证据表明,益生菌有利于提高动物的生长性能在pathogen-infected和未感染的情况下,这可能是由于由益生菌分泌的化合物,如消化酶、抗菌物质,和/或其他刺激因素,如短链脂肪酸(17,18]。作为一个广泛使用的益生菌,枯草芽孢杆菌PB6已经证明改善肉用鸡/动物饲料摄入量,增加体重,减少货物收据(19,20.]。在目前的研究中,我们还发现添加 和 B。细小PB6的饮食可以减轻负面影响CP感染肉用鸡伯明翰线规和货代,特别添加高剂量。此外,我们发现B。细小CP-infected PB6施加一个更好的促生长效应比enramycin肉鸡,常用在CP预防,最终确认的促生长作用B。细小PB6。然而,其他研究表明,刺激经济的效果B。细小PB6不显著(21),这些不一致的结果在研究可能是由于养殖环境、动物种类、添加剂用量,或操作程序。

CP能产生各种毒素、细菌素和溶胶原的酶后殖民(22]。这些活性物质影响紧密连接和他们的组件,如occludin和结粘附分子(堵塞),通过改变肠细胞的跨膜孔和细胞外基质,从而破坏完整性的固有层23]。上述变化都伴随着粘膜免疫反应的激活;随后,许多促炎细胞因子分泌,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β(24]。这些细胞因子可以引起肠道屏障紧密连接的重排和损害,造成一个恶性循环的主机,甚至全身感染(22]。与其他研究[25- - - - - -27),我们的研究结果指出,CP感染导致严重的身体损伤肉鸡小肠,显著提高肠道病变评分,抑制肠道TJ蛋白occludin的基因表达和调节促炎细胞因子TNF的表达α。这些异常生理变化可能是重要的因素在增长的减少肉鸡感染CP的性能。此外,我们发现enramycin和B。细小PB6各种可能增加TJ蛋白occludin的表达和ZO-1 CP-infected肉鸡,减少炎症因子TNF的表达α。这表明enramycin和B。细小PB6可以恢复肠道的物理屏障,减少肠道炎症,从而帮助减少肠道损伤分数和恢复受损的肠道的生理功能。同意我们的发现,Jayaraman等人,Belote等人报道,补充B。细小PB6 enramycin阻止CP-induced NE和减少损伤分数也在挑战肉鸡(改善肠道健康8,28]。Enramycin可以杀死病原菌通过直接抑制细胞壁的形成,从而减少病原体对身体造成的损害(28]。然而,除了竞争排斥,益生菌还可以通过免疫调节,发挥他们的促生长效果抗菌分子的分泌,增强人体的抗氧化能力。在这项研究中,B。细小PB6施加其表达下调TNF的表达,免疫调节效应α肠的CP-infected肉鸡,同时上调occludin的表达和ZO-1。肿瘤坏死因子-α是由激活单核细胞/巨噬细胞和大量合成在细菌感染的急性期,随后促进下游免疫细胞的激活,如T细胞,从而加剧炎症反应和伤害宿主29日]。同样,最近的研究表明,B。细小通过修改可以减少肠道炎症巨噬细胞的极化,抑制TNF的表达-α,因此,保护人体免受细菌感染(30.]。上皮紧密连接的主要部件,改进occludin的mRNA表达和ZO-1能增强肠道屏障功能和保护肠道健康31日,32]。研究还发现,文化的上层清液B。细小可以移植紧密连接蛋白的表达和粘蛋白2在HT-29细胞在体外,但目前还不知道具体代谢物,和需要进一步的探索33]。

肠道微生物群落,这是由许多因素,如食品(34)、年龄(35)和添加剂(36),对肉鸡的生长和健康很重要因为它能够促进营养消化和调节免疫系统(37]。一般来说,肠道微生物群的多样性病原体耐药性密切相关。肠道微生物会受到许多因素的影响,如病理条件下,抗生素治疗,饮食补充,和住房环境(38]。最近,Fasina et al。39和李et al。40)报道,CP感染显著减少了α肉鸡肠道微生物群落的多样性指数。然而,徐et al。41和Zhang et al。42表示相反的结果,这表明CP感染显著增加α肠道微生物群落的多样性指数。此外,一些研究发现,CP感染并没有影响α——或者β多样性指数(43,44),这是符合当前的结果。这些作者认为这种差异可能归因于以下:(a)的不同部分的回肠digesta收集,(b)不同CP菌株和饮食类型,和(c)不同持续时间的CP的挑战。相关参考文献是有限的,需要进一步的试验。

研究表明,大量的肠道习梭状芽胞杆菌显著增加,伴随着基因表达降低TNF -α和减少在结肠炎症指数与益生菌治疗结肠炎小鼠模型(45]。一致,我们发现大量的更高习梭状芽胞杆菌回肠的肉鸡在对照组,enramycin补充组和低收入和高剂量B。细小PB6补充组,伴随着降低TNF -α表达和减少肠道病变。因此,我们推测,丰度高习梭状芽胞杆菌可以抑制肠道炎症。LEfSe分析表明,链球菌在低剂量明显丰富B。细小PB6补充组。链球菌包含很多益生菌菌株,如乳酸链球菌。最近的研究发现乳酸链球菌可以增加紧密连接蛋白的表达ZO-1和ZO-2高脂肪饮食的老鼠和维护ZO-1的表达在人类肠道上皮细胞感染E。杆菌(46- - - - - -48]。因此,在这个实验中,表达的增加ZO-1肉鸡肠道的低剂量B。细小PB6补充组可能与丰度的增加有关链球菌。以前的研究表明Bosea包含株能分泌多种纤维素分解酶(49]。在这个实验中,enramycin治疗明显增加了丰富的Bosea肠的CP-infected肉鸡。因此,的能力Bosea分解纤维素和改善饲料营养物质的利用率可能的原因之一enramycin组肉鸡的体重增加。葡萄球菌作为一个有条件的病原体,主机通常被认为是有害的,但其丰度降低的原因的回肠CP-infected肉鸡仍不清楚。这可能是由于占据CP的生殖抑制的效果葡萄球菌。Desulfovibrionaceae和Xanthomonadaceae目前研究较少。然而,一项研究发现,Xanthomonadales是中国蜂胶富含小鼠接种(50),但其功能尚不清楚。

5。结论

总之,政府的B。细小PB6可以改善生长性能,提高肠道屏障功能,减轻肠道炎症/损伤和重塑CP-challenged回肠微生物组成的鸟类。

缩写

伯明翰线规:	身体体重增加
ADFI:	平均日采食量
ZO-1:	Zonula occludens-1
TRL4:	toll样receptor-4
il - 1β:	Interleukin-1β
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
干扰素-γ:	干扰素-γ。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由山东省重点研发项目(2019 jzzy020602)和中国国家重点研发项目13五年计划时期(批准号2017 yfe0129900)。