外膜蛋白F IgY抗体对烧伤小鼠的免疫治疗铜绿假单胞菌感染

摘要

烧伤患者耐多药铜绿假单胞菌感染通常具有高发病率和高死亡率，是世界卫生系统面临的重大挑战。外膜蛋白F (Outer membrane protein F, OprF)作为一种主要的外膜孔蛋白，是致病力完全表达所必需的铜绿假单胞菌．本研究旨在评价卵黄特异性抗体(IgY)对重组OprF (r-OprF)蛋白的保护作用。用r-OprF免疫鸡，用盐沉淀法纯化抗r-OprF卵黄抗体。各组小鼠分别注射抗oprf IgY和对照IgY (C-IgY)。感染是由皮下注射铜绿假单胞菌在烧伤部位发现PAO1菌株。小鼠死亡率监测5 d。测定抗oprf IgY的功能活性在体外入侵检测。抗oprf IgY免疫治疗可显著提高感染小鼠的存活率铜绿假单胞菌与C-IgY和PBS相比，igy增加了25%至87.5%。抗oprf IgY抑制了细胞的侵袭铜绿假单胞菌pa1进入A549。采用抗oprf IgY被动免疫可有效地预防铜绿假单胞菌烧伤模型中的烧伤感染。

1.介绍

铜绿假单胞菌已成为一种可怕的病原体，在很大程度上导致烧伤患者的致命感染，主要是因为它们对广泛的抗菌药物具有臭名昭著的耐药性，这些抗菌剂迅速在世界各地的烧伤单位传播[1- - - - - -3.］．此外，院内获得的多药耐药(MDR)菌株铜绿假单胞菌可从烧伤伤口感染部位全身扩散到远处的器官，部分原因是烧伤创伤的免疫抑制作用，此外还产生毒性因子，赋予侵袭性，可能导致危及生命的全身感染[4］．全球烧伤患者的发病率呈上升趋势，同时治疗多药耐药的有效治疗选择越来越少铜绿假单胞菌在严重烧伤伤口感染的治疗中，主动免疫疗法和被动免疫疗法的优点迫使研究人员进行调查。

大多数临床分离的铜绿假单胞菌具有外膜蛋白F (OprF)，由oprF通过将肽聚糖固定在外膜上来维持细胞形状的基因，它参与宿主和病原体的相互作用，也需要完全毒性的表达[5，6］．例如，研究表明非oprf铜绿假单胞菌突变体通过III型分泌系统(T3SS)、喹诺酮假单胞菌信号(PQS)合成、群体感测依赖的毒力因子的产生以及生物膜的形成，在ExoT和ExoS毒素中具有较低的毒性[7，8］．越来越多的证据表明在体外和在活的有机体内研究支持这一观点，即OprF是表面暴露的，在抗原上是保守的，可以作为一种有希望的疫苗抗原铜绿假单胞菌在各种急性和慢性感染模型中[9- - - - - -13］．此外，针对OprF产生的抗体已被证明具有强大的抗原结合、抗体依赖和补体介导的调理吞噬细胞杀伤活性铜绿假单胞菌PAO1 [14，其抗oprf IgG活性水平与抗oprf IgG抗体的保护水平相关铜绿假单胞菌在实验动物和人类中[15，16］．此外，表达OprF的腺病毒载体诱导抗OprF的体液和细胞免疫，并提供对致命肺部挑战的保护铜绿假单胞菌［12］．

鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)被认为是一种极其丰富和经济的多克隆抗体来源，它与哺乳动物补体系统和IgG不发生免疫交叉反应[17］．此外，IgY的高特异性抗体的产量以及简单和无创的收集方法揭示了与哺乳动物IgG抗体相比在控制传染病方面的一些优势[18］．IgY已被证明可以预防胃肠道[19]及人类及动物感染流感病毒而无副作用[20.，21］．口服免疫治疗用抗铜绿假单胞菌IgY抗体能有效地抑制慢性定植铜绿假单胞菌CF患者[22，23］．

本研究评价IgY抗oprf抗体的保护作用铜绿假单胞菌在烧伤小鼠模型中感染并确定在体外诱导抗体的保护活性。

2.材料和方法

2．1.菌株和生长培养基

铜绿假单胞菌PAO1用于OprF蛋白的纯化和攻毒。Luria-Bertani (LB)培养基、胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)和胰蛋白酶大豆肉汤(TSB;均来自德国默克)，用于所有菌株的常规培养。

2．2．动物

雄性6 - 8周龄BALB/C小鼠购自伊朗德黑兰Royan研究所。25周龄的剃须蛋鸡购自伊朗阿尔伯兹的一家养鸡场。所有的动物实验都是按照Shahed大学动物伦理委员会的指导方针进行的。

2．3.重组蛋白的制备

重组OprF蛋白如前所述纯化。简单地说，OprF基因(GenBank Accession No. No.)NC_002516.2)，之前克隆到pET-28a载体，转化成大肠杆菌BL21。重组基因构建用异丙基b-D硫代半乳糖苷(IPTG, 1 mM)表达，蛋白通过Ni-NTA琼脂糖柱变性纯化(Qiagen, Hilden, Germany)。重组蛋白经小鼠抗his标签单克隆抗体Western blotting鉴定。

２.４.抗oprf IgY抗体的制备

对2只鸡注射150毫克免疫μg的r-OprF在完全弗氏佐剂(1:1;(Sigma-Aldrich，美国)，肌肉注射，3次增强，每次150次μg的不完全弗氏佐剂(1:1;对照组母鸡每隔2周给予佐剂。末次注射后2周，每天取卵，4℃保存5 ~ 6个月。如前所述进行抗oprf IgY抗体的分离[24］．将分离出来的蛋黄用蒸馏水(pH 5)稀释7倍，在-70°C孵育过夜，然后用Whatman纤维素滤纸(Sigma-Aldrich)过滤。滤液与8.8% ( ）氯化钠在pH为4的条件下离心2 h, 3380 × g离心20 min。用PBS溶解颗粒，最终IgY保存在-20℃。9% SDS-PAGE检测IgY纯度，考马斯亮蓝G-250染色。采用Bradford法定量测定卵黄抗体的总量。通过免疫印迹r-OprF分析IgY抗体对r-OprF的反应性。用湿转移印迹仪将r-OprF从SDS-PAGE上转移到硝化纤维素膜上。用PBS冲洗膜，用含5% ( ）脱脂牛奶。冲洗膜，用1 mg抗oprf IgY孵育2 h，以识别r-OprF。加入1:10000稀释后的HRP标记的兔抗鸡IgY (Sigma-Aldrich)作为二抗，37℃孵育2 h, 0.05% Tween PBS (T-PBS)洗涤。将纸张浸入含有50 mM Tris (pH 7.8)和0.6 mg/mL 3,3的溶液中 -diaminobenzidine衬底(DAB)。显色后用蒸馏水终止反应。

2．5．抗oprf IgY滴度的评估

针对全细胞的抗原特异性IgY滴度铜绿假单胞菌PAO1和r-OprF通过ELISA进行评估，如前所述[25］．简单地说，每个ELISA板孔(美国Nunc)涂10⁸CFU的铜绿假单胞菌PAO1或2.5μg r-OprF在15mm Na₂有限公司_3.35mm NaHCO_3.(pH 9.6)， 4°C孵育过夜，0.05% T-PBS洗涤，PBS+5%脱脂牛奶阻断。100年μL 50μg/mL IgY抗体37℃每孔孵育90 min, T-PBS洗涤3次，100μL: 1000稀释酶标兔抗igy抗体(HRP;Sigma-Aldrich)补充道。37℃孵育1 h后，用T-PBS冲洗3次。接下来,100年μ每孔加入L的TMB液底物。室温显色20 min后，用3n H停止反应₂所以₄450nm (OD)的吸光度₄₅₀)测量。

2.6。入侵检测

目的:检测抗oprf IgY抗体对小鼠免疫功能的抑制作用铜绿假单胞菌对A549细胞系进行庆大霉素保护试验，我们遵循Ranjbar等人的方法[25］．简单地说，抗oprf IgY抗体与PAO1株混合，然后加入到24孔板(Nunc)的融合A549细胞中。将庆大霉素加入平板，孵育1 h;然后，用PBS洗涤细胞，用0.5% Triton X-100裂解细胞，连续稀释并在TSA板上生长(3个重复)。16h后菌落计数显示PAO1菌株从裂解细胞中释放的数量。

2.7。小鼠烧伤感染模型

按照Neely等人之前的描述，小鼠被烧伤和挑战[26］．BALB / C小鼠( ）被随机分为7组。简单地，用乙醇火焰(0.5 mL乙醇)制作10-15%的总体表面积(TBSA)烧伤创面。所有小鼠烧伤后立即腹腔注射0.3 mL无菌生理盐水。对乙酰氨基酚(0.25 mg/mL)用于烧伤后镇痛。小鼠烧伤部位皮下注射铜绿假单胞菌用0.1和10 mg抗oprf IgY抗体预孵育中和。在其他组,铜绿假单胞菌用1 mg抗oprf IgY抗体预孵育小鼠，感染12 h后静脉注射0.5 mg抗oprf IgY抗体。另外，在感染前2 h给予抗oprf IgY抗体1 mg，感染后12、24 h给予抗oprf IgY抗体0.5 mg。IgY对照组小鼠皮下注射IgY铜绿假单胞菌用1 mg对照IgY (C-IgY)预孵育1 h。pbs治疗组监测无治疗的生存情况。烧伤对照组由未受感染的未处理的烧伤创面小鼠组成。实验小鼠的存活率每天监测2次，最长5天，使用Mantel-Cox log-rank检验分析[25］．

2.8。统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc.， USA)进行。采用单因素方差分析，采用Tukey多重比较检验。采用Kaplan Meier生存曲线及Mantel-Cox log-rank检验对各组小鼠进行生存分析[25］．所有结果表示为 (SD)。的小于0.05的值被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．r-OprF的表达和纯化

的蛋白表达大肠杆菌携带重组载体的BL21 (DE3)用IPTG (1 mM)诱导。基于SDS-PAGE, r-OprF蛋白表达产物约为48 kDa。Ni-NTA亲和层析在变性过程中成功纯化了OprF(图)1(一)）．如图所示1 (b)根据Western blot分析，anti-His单克隆抗体与一个~ 48kda纯化的蛋白特异性反应，对应于r-OprF。

３.２．抗OprF的IgY抗体的反应性和特异性

采用OprF免疫印迹法评价IgY抗体的反应性和特异性。用NaCl沉淀抗r-OprF的卵黄抗体，每只鸡蛋可获得50 mg抗oprf的卵黄抗体(图)2(一个)）．免疫蛋黄产生的IgY抗体与~ 48kda r-OprF蛋白反应(图)2 (b)）．通过间接ELISA分析全细胞裂解液和r-OprF，进一步验证了抗r-OprF的IgY抗体的特异性。如图所示2 (c)和2 (d)， r- oprf免疫母鸡的全活细胞的IgY水平铜绿假单胞菌PAO1菌株或重组蛋白显著( ）高于C-IgY。

３．３．抗oprf IgY抗体减少铜绿假单胞菌的侵袭

抗oprf IgY抗体降低A549细胞的侵袭能力铜绿假单胞菌．PAO1在PBS存在下的侵袭效率为100%。而在1和2 mg/mL抗oprf IgY抗体存在下，PAO1的侵袭效率分别为33.72%和35.08%，显著高于对照( ，数字3.）．抗oprf IgY 1 mg/mL与2 mg/mL无显著性差异( ）．在C-IgY抗体存在的情况下，PAO1的侵袭效率为58.02%，显著高于PBS ( ）(图3.）．

3．4．抗oprf IgY抗体可提高铜绿假单胞菌感染小鼠的存活率

目的:评价抗oprf IgY对小鼠免疫功能的保护作用铜绿假单胞菌感染后，我们比较了被动免疫抗oprf IgY小鼠与C-PBS-和c -IgY感染小鼠的存活率(表)1）．用中和剂处理感染小鼠的存活率铜绿假单胞菌0.1和10 mg抗oprf IgY组的卵黄抗体均为25%(图)4(一)）．同时，用中和剂处理感染小鼠的存活率铜绿假单胞菌感染后12小时静脉滴注0.5 mg抗oprf IgY者占50%(见表1)1,图4 (b)）．另外，感染前2 h皮下注射1 mg抗oprf IgY作为预防，感染后12 h和24 h静脉注射0.5 mg抗oprf IgY治疗的小鼠存活率为87.5%。C-PBS和C-IgY小鼠均未存活铜绿假单胞菌伤口感染(表1,图4 (c)）．所有未感染的烧伤小鼠均存活。

4.讨论

控制的最大挑战铜绿假单胞菌由于耐多药菌株的出现，烧伤伤口感染是抗菌治疗的有限成功，这些菌株对几乎所有可用的抗菌药物都具有高度耐药性。此外,铜绿假单胞菌通常会避开免疫反应并产生一系列的毒性因子，从而进一步损害病人的器官系统。这进一步使患者治疗复杂化，并导致排斥基于抗体的免疫治疗。尽管几铜绿假单胞菌OprF被认为是一种可行的靶抗原，因为它在临床分离株中具有表达和保守的抗原，并且在感染过程中具有重要的功能和提供保护性抗体应答。在目前的研究中，烧伤小鼠模型已经证明抗oprf IgY抗体对致命的保护铜绿假单胞菌感染。我们的结果表明，烧伤小鼠受到保护，他们的存活率高于对照组。烧伤小鼠模型的实验结果表明，中药的预防作用是有效的铜绿假单胞菌与对照组相比，感染抗oprf IgY抗体和静脉注射抗oprf IgY抗体可使小鼠存活率提高87.5%。我们的发现与Matthews-Greer和Gilleland一致[5，发现从细胞包膜中分离出的OprF进行主动免疫后，小鼠攻毒后存活率提高了83%铜绿假单胞菌．此外，Worgall等人证实了腺病毒表达的主动免疫铜绿假单胞菌OprF将感染小鼠急性肺炎模型的存活率提高到80% [12］．这也符合我们的早期观察，在同一预孵育组中，铜绿假单胞菌与抗PcrV IgY预孵育将烧伤小鼠的存活率提高到33%，而我们的25% [25］．考虑这一说法是至关重要的，特别是在耐药细菌数量和主要的MDR-的时代铜绿假单胞菌许多医院，主要是烧伤科的紧张局势。此外，成功根除烧伤患者体内的剧毒和高耐药菌株的复杂问题，随着新批准的针对这些菌株的抗菌药物数量的减少而进一步加剧。幸运的是，越来越多的证据表明，免疫治疗是一种很有前途的治疗选择，有潜力作为一种独立的治疗策略，单独或联合抗菌治疗[27，28］．以抗体为基础的免疫治疗可以预防MDR-似乎是合理的铜绿假单胞菌烧伤患者的负担正在形成感染，最终导致高发病率和死亡率。然而,抑制铜绿假单胞菌毒力因子OprF通过IgY抗体表现出特异性的抗菌作用，而不触发耐药菌株的产生。

在本研究中，我们发现抗oprf IgY抗体抑制了细菌对A549细胞的侵袭，这在减少A549细胞局部和全身分布方面起着关键作用铜绿假单胞菌．此前研究发现，抗oprf IgY抗体的高疏水性会聚集细菌，从而促进宿主免疫细胞的清除[29］．目前的研究结果与我们之前报道的25%的侵袭是一致的铜绿假单胞菌在1mg抗pcrv IgY存在下的A549细胞[25］．IgY免疫治疗所观察到的实质性临床疗效可能与病原体和宿主上皮细胞之间的干扰相互作用有关[30.，31］．此外，抗oprf igg表现出强大的抗体依赖补体介导的杀伤铜绿假单胞菌应变PAO1 [14，而抗体的水平与对病毒的保护程度相关铜绿假单胞菌在烧伤的老鼠中[16］．此外，IgY抗体对细菌发病有抑制作用，可作为提高抗生素作用的辅助治疗手段。因此，抗oprf IgY抗体表现出较强的抗铜绿假单胞菌干扰了铜绿假单胞菌抑制细胞入侵的毒力因子。C-IgY中度抑制活性，侵袭性无显著降低铜绿假单胞菌与抗oprf IgY相比，感染小鼠存活率的提高可能是由于鸡的暴露铜绿假单胞菌，是一种普遍存在的环境细菌，也是IgY的多克隆性质。这些发现与以前的研究一致[25，29，32- - - - - -37］．

5.结论

总之，这些结果为抗oprf IgY抗体对烧伤创面感染具有保护作用提供了证据铜绿假单胞菌通过抑制细菌入侵宿主细胞和组织。我们的数据显示铜绿假单胞菌-感染的小鼠对烧伤创面脓毒症有保护作用，进一步支持IgY对OprF的保护作用为开发保护性治疗提供了途径的结论。据推测，抗oprf IgY抗体可能与抗生素治疗结合使用，作为一种辅助方法来预防铜绿假单胞菌感染。

数据可用性

没有数据支持本研究。

的利益冲突

没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了Shahed大学的支持。

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