从自体尿液中获得的免疫调节剂多肽的复杂混合物的特性

摘要

一种复杂的多肽混合物在免疫系统的调节中起着关键作用;据报道，提供这些提取物的原料主要来自动物和蔬菜。批与批产品的一致性取决于建立的过程控制。然而，当免疫调节剂是从同一志愿者获得的定制产品，并接受个性化治疗时，志愿者之间建立一致性的标准是不同的。从这个意义上说，尽管肽丰度的分布不同，但它的分子量范围是相同的。在这里，我们使用大小排斥色谱(SEC)和质谱(MS)对免疫调节剂的三种提取物的肽谱进行了表征，这三种提取物来自患有三种不同疾病(即过敏性鼻炎、类风湿关节炎和慢性鼻咽炎)的不同志愿者的尿液。免疫调节剂中所含的多肽在6个月后稳定，保存在冰箱中。我们的结果显示，SEC分析的所有样品的色谱谱图具有相同的低分子量范围(小于17 kDa);这些结果也得到了MS的证实，MS显示了从3到13 kDa的精确质谱。肽谱在6个月的冷藏条件下(2到8°C)被保存，保持了免疫调节剂的质量和稳定性，这一事实支持了它可能是治疗慢性高敏感疾病的一种替代方法的观点。

1.介绍

含有多肽复杂混合物的生物提取物是治疗慢性退行性疾病的一种选择。这种肽分布通过一种尚不完全了解的不同作用机制促进对免疫反应的调节，但它们已显示出治疗特性，因此代表了某些疾病的改善[1，2］．因此，为了获得预期的反应，必须证明产品的物理化学性质的一致性。先前对转移因子(Transferon®)或胶原蛋白水解物(Colagenart®)等含有肽分布的类似产品的研究表明，批次之间的理化性质具有较高的重现性。Transferon®被用作治疗慢性退行性疾病的药品，而Colagenart®被用作膳食补充剂，已被用作保持关节和皮肤健康的可行替代品[3.- - - - - -5］．

如今，个性化医疗，也被称为个体化医疗或精准医疗，正在成为肿瘤等关键领域的一种创新治疗方法。这种方法,基于接种疫苗,包括从患者自身的免疫调制剂再注入一个样本,样本处理后,获得其中的一小部分,其中包含肽分布将视为自己的抗原刺激免疫反应和作为免疫调制剂,因此,也可能对患有自身免疫性疾病或先天或适应性免疫缺陷的人有用[6- - - - - -12］．

这种用于回注的复杂多肽混合物主要从血细胞或组织(如实体肿瘤)中提取[13然后通过标准的分离生物过程提取，如沉淀、过滤或色谱，接着是配方、无菌过滤和灌装小瓶。

在过去的40年里，从尿液中提取的肽已经被用于治疗各种形式的过敏性(皮肤和粘膜过敏)患者，如哮喘和各种形式的关节炎，在最初几周的治疗中显示出显著的临床改善，持续数月甚至数年，特别是在早期诊断的患者中[7，8］．由于科学家Ruiz Castañeda开发了从尿液中获取肽的过程，它允许发明通过注射或口服给药的免疫调节剂，用于治疗各种疾病，如自身免疫和过敏性疾病。这是由于他在医学、免疫学和细菌学方面积累的经验，这是他在法国国立医学院、巴黎大学、巴斯德研究所和哈佛大学获得的[14］．

自1940年以来，从自体尿液中提取的内源性肽皮内注射已被用于慢性免疫疾病的治疗;根据6个月的重复剂量计划，结果已被证明是安全的(没有不良反应的报道)，主要在治疗皮肤和粘膜过敏、反应性关节炎和牛皮癣有效[14］．

在这项研究中，从人类尿液中提取的一种复杂的多肽混合物在3名患者中的分布被描述，其中一名是过敏性鼻炎，另一名是风湿性关节炎，第三名是慢性鼻咽炎。所有三名患者均按周剂量使用该配方(每周一次，持续六个月)。肽分析采用尖端技术，包括尺寸排阻色谱和质谱分析。此外，肽稳定性(在 °C)。

2.材料和方法

2．1．样品和试剂

来自过敏性鼻炎、类风湿关节炎和慢性鼻咽炎患者的三份免疫调节剂样本由Instituto de Alergias y Autoinmunidad Dr. Maximiliano Ruiz Castañeda A.C.(墨西哥城，墨西哥)提供。免疫调节剂是通过生物过程获得的，该生物过程包含几个步骤，包括用有机溶剂选择性沉淀低分子多肽[14］．氯化钠、二碱性磷酸钠、3-(三甲基硅基)十四烷基丙酸钠(TSP)均从J. T. Baker和(NY, USA) Sigma-Aldrich公司(MO, USA)获得。质谱级的水，甲酸和乙腈从Sigma-Aldrich (MO，美国)获得。

2．2.方法

2.2.1。尺寸排阻色谱

根据Medina-Rivero等人的研究，进行尺寸排除色谱分析(SE-UPLC) [3.］．简单地说,10μ每种免疫调节剂的L分别注入Waters®BEH 125 SEC色谱柱( ）使用Acquity UPLC h类系统(Waters;MA，美国)与紫外线检测。流动相为50 mM的磷酸盐缓冲溶液(pH 6.8)。使用Empower®软件(Waters®)获取数据并进行处理。

2.2.2。质谱(MS)

MS分析是根据我们之前对复杂分子质量属性分析的研究进行的，以证明批与批的一致性[4，5］．简而言之，肽样品使用Waters®CSH C18反相柱(1.7)进行分离和在线脱盐μ米, 以甲酸(0.1%)为流动相，以乙腈(0% ~ 25%)为梯度。分析离子通过电喷雾电离获得，并使用四极-飞行时间(MS-Q-Tof) Vion®光谱仪与Acquity UPLC H级色谱仪(Waters®)耦合进行分析。使用UNIFI®软件(Waters)获取数据并进行处理。

2.2.3。稳定性试验

为了确定免疫调节剂在冷藏条件下的6个月的保质期，进行了长期稳定性试验( )．每三个月(0、3和6个月)对样品进行外观、pH、总蛋白(280nm紫外)、SEC和无菌分析。

3.结果与讨论

这些用于治疗慢性疾病的免疫调节剂通过SEC和MS进行了分析，以证明其一致性和肽分布的稳定性，而不像标准药物那样含有单一的、明确定义的化合物作为活性药物成分(API)，符合质量规范。在生物制品中，如本文研究的免疫调节剂肽，它是从自体尿液中获得的，因此，患者之间的肽序列可能存在差异。因此，该过程的一致性是由肽分布的分子质量和总蛋白含量以及其他属性如外观和安全测试所给出的肽多分散性决定的。

3．1.大小排斥分析

从免疫调节剂中得到的混合肽分布，根据分子量标记，肽大小范围小于17.0和1.3 kDa。保留时间为5.8 min时出现主峰，与配方赋形剂对应(图)1)．我们设计了一个健壮的过程，从同一来源提取免疫调节剂，在本例中，从不同志愿者的尿液中提取免疫调节剂，用于回注治疗，以获得预期大小范围内的肽，这在SEC研究的三个独立样本的分析中显示(图)1)．在这些样品中，观察到相同的大小范围，但根据色谱谱图，肽的相对丰度不同。这种差异取决于尿液中的蛋白质浓度、相对丰度和多肽类型;众所周知，患有某些疾病的献血者的蛋白质浓度可能会升高，甚至他们的尿液也可能呈现与正常情况下不同的蛋白质[15- - - - - -17］．

３．２．质谱分析

质谱标准是基于肽的定量分子量范围在200 ~ 9000 Da。它与SEC色谱剖面的质量进行了正交确认。结果显示了样品间肽丰度的内在差异。在先前的研究中，当从尿液中筛选肽以寻找诊断和预后指标，甚至将其用作某些疾病的治疗时，志愿者之间的这种内在异质性就被发现了[7，8］．在所有的病例中，都发现了低于2000da的低分子量多肽的高频率出现(图)2)．患者样本的质谱显示了多肽丰度的差异(图)2)．这些质谱是由反卷积得到的 从反相色谱图(图S1)．这一结果表明，多肽的来源和丰度取决于供体的健康状况。免疫调节剂可能具有模仿几种抗原表位的肽序列，这可以解释为什么免疫调节剂可以作为通用免疫校正器开启或关闭先天免疫反应。个性化药物，如目前的免疫调节剂，可能包含与患者相关的肽，从中提取。这些多肽可以诱导特异性免疫反应，改善患者的病情。

3．3．稳定性试验分析

免疫调节剂的保质期为6个月，每3个月进行分析1)．结果表明，评价的关键质量属性具有一致性;在所有情况下，每个分析的预期结果都在确定的规格限制内(表2)．这项研究的结果允许建立产品的货架期稳定性。SEC检测结果显示，独立样品在开始时间和冷藏6个月后的分子尺寸分布相同，色谱剖面相似;峰下的总面积保持不变，这表明肽在溶液中没有明显的结构变化(图)3.)．此外，MS在冷冻9个月后仍然确认了尺寸分布情况(图)S2)．从志愿者处获得的免疫调节剂在大小和序列上具有高度的多肽异质性;甚至这种异质性在志愿者中也更大，因为它取决于尿液中分泌的蛋白质。因此，肽分布的守恒是一种稳定性指示分析。

4.结论

通过建立的工艺得到的复杂多肽混合物的尺寸分布轮廓的一致性在不同志愿者之间是可重复的;在治疗慢性免疫疾病(如皮肤和粘膜过敏、反应性关节炎和牛皮癣)时，预期预期的反应是关键。此外，产品表现出稳定性，在使用前存储在5 - 8°C之间保持其关键质量属性。因此，这种免疫调节剂代表了一种可行的替代治疗慢性免疫疾病。

数据可用性

没有数据支持本研究。

的利益冲突

作者Fragoso, Pedraza-Jiménez, Espinoza-González, Ceja-Mendoza, Sánchez-Mercado和Robles-Pérez参与了免疫调节剂的开发和制造。其他所有作者都宣称没有相互竞争的利益。

致谢

我们要感谢Ma Guadalupe Pérez Ruiz博士对M. Ruiz博士Castañeda的知识和研究的信任、维护和保护，以及对以他的名字命名的研究所的保护:过敏和自身免疫研究所M. Ruiz博士Castañeda。这项工作得到了Alergias y Autoinmunidad研究所Maximiliano Ruiz博士Castañeda A.C.的支持

补充材料

图S1:志愿者1过敏性鼻炎(A)、志愿者2类风湿性关节炎(B)、志愿者3慢性鼻咽炎(C)和基质(D)中免疫调节剂的反相基峰强度分布图 9个月。（补充材料）

参考文献

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