胶质瘤干细胞中B7-H6的优先表达通过C-MYC / RNMT轴增强肿瘤细胞增殖

摘要

B7同源物6（B7-H6）是B7刺激性分子家族的新发现成员，不仅是通过与NKP30结合的NK细胞介导的免疫反应的关键调节因子，而且由于其在人类癌症中的异常表达而具有临床意义。这里，我们表明B7-H6表达在胶质瘤组织中异常上调，并且用干细胞标记SOX2共压制B7-H6。有趣的是，在胶质瘤细胞系的表面上很少检测到B7-H6，但在胶质瘤干细胞（GSLC）中大量表达，所述细胞（GSLC）衍生自胶质瘤细胞系体外。令人惊讶的是，B7-H6是唯一一个优先在B7家族成员之间的GSLC中表达的人。在功能上，SIRNA通过SIRNA的GSLC中B7-H6的敲低导致细胞增殖，癌基因MYC表达的降低以及PI3K / AKT和ERK / MAPK信号传导途径的灭活。此外，我们确定三种基因CBL（CASITAS B型淋巴瘤原癌基因），CCNT1（细胞周期蛋白T1）和RNMT（RNA鸟嘌呤-7甲基转移酶）与来自胶质瘤组织样本的B7-H6和C-MYC共同制成TCGA数据库并发现，仅通过GSLC中的B7-H6表达的敲低仅抑制了RNMT表达，表明RNMT在B7-H6 / C-MYC轴中的累积。将其扩展至293T的细胞，我们观察到敲除具有CRISPR-CAS9系统的B7-H6也抑制了细胞增殖。因此，我们的研究结果表明B7-H6作为胶质瘤干细胞靶向免疫疗法的潜在分子。

1.介绍

恶性胶质瘤是最常见的主要恶性脑肿瘤，根据患者的近似80％。它是最令人恐惧的肿瘤类型之一，不仅是因为令人沮丧的预后，而且还因为它对认知功能和生活质量的直接影响[1].由于血脑屏障（BBB）的存在[2那3.]淋巴系统中的缺陷[4.]，胶质瘤在肿瘤发生过程中免疫系统无法有效监测，且在大脑特殊解剖结构下难以治疗。

近年来，积累的证据表明，胶质瘤的进展由具有与干细胞类似的特性的肿瘤细胞的小亚群驱动。通过对白血病患者血液中的自我更新和分化能力的一种类型的细胞的描述，在20世纪60年代起肿瘤干细胞的概念起源于白血病患者的血液中的一种类型的细胞[5.］．在脑癌中，几个独立研究报告了胶质瘤干细胞。singh等。通过分选干细胞标记物CD133阳性细胞分离的肿瘤初始细胞[6.]，而ignatova等。和Galli等人。根据神经圈形成能力，从肿瘤样品确定胶质瘤干细胞体外[7.那8.］．他们表明，分离的细胞是自我更新和放射疗法和化疗抗性[9.］．其他研究表明，胶质瘤干细胞与肿瘤复发有高的相关性[10.]和转移[11.］．据报道，cd133阳性细胞具有高度致瘤性[6.]异种移植之后和耐几个化学治疗剂[12.]，与复发的化疗后可能性较高[13.］．然而，肿瘤干性的关键分子和机制仍然是未知的。

研究表明，B7家族成员，尤其是B7-H1（PD-L1）、B7-H3（CD276）和B7-H4（VTCN1）参与了包括胶质瘤在内的多种肿瘤的免疫逃逸。B7-H6（B7同源物6）被鉴定为B7家族成员，并被证明是激活自然杀伤细胞受体NKp30的配体[14.];通过结晶分析确认B7-H6和NKP30之间的直接相互作用[15.那16.］．早期研究[14.那17.-19.报道，B7-H6用作激活剂以增强肿瘤和炎性微环境中NK细胞的细胞毒性。此外，已经描述了B7-H6表达以在不同类型的肿瘤细胞中呈现，但尚未发现在正常的成人组织中[15.］．最近的一项研究提到，B7-H6的肿瘤细胞通过金属蛋白酶有助于脱落到肿瘤逃逸[19.]，和肿瘤B7-H6的表达抑制通过ILC2-MDSC的免疫应答在急性早幼粒细胞白血病轴线[20.］．尽管如此，B7-H6的表达在肿瘤组织上的生物效应的细节还不清楚。

在这项研究中，我们发现这是与Sox2的胶质瘤组织中共同表达B7-H6的异常表达。有趣的是，B7-H6的表达在神经胶质瘤细胞系很少检测到，但可在从父神经胶质瘤细胞系，推导出该GSLCs来检测。此外，GSLCs被鉴定为癌症干细胞样细胞由于几种干细胞标志物和耐化学治疗药物中的表达。在功能上，在GSLCs B7-H6的B7-H6的表达通过敲低特异性siRNA通过c-Myc的下调抑制GSLCs’增殖和也对Akt和ERK信号传导途径的效果。此外，我们发现，RNMT（RNA鸟嘌呤-7-甲基转移酶）参与了B7-H6 / c-myc的轴。总的来说，我们的研究结果已揭示在胶质瘤干细胞B7-H6的一个以前未被认识优先表达，它提供了一个潜在的分子靶点胶质瘤的治疗。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

包括U87（人，胶质母细胞瘤 - 星形细胞瘤，RRID：CVCL_0022），U251（人，胶质细胞瘤，RRID：CVCL_0021），A172（人，胶质母细胞瘤，RRID：CVCL_0131），SHG-44（人，星形细胞瘤，RRID：CVCL_6728）和SU2（分化的胶质瘤干细胞系分离出52岁女性患者[21.]）在高葡萄糖DMEM所有培养（Hyclone公司，南洛根，UT，USA），补充有10％胎牛血清（FBS，Hyclone公司，南洛根，UT，USA）和1％青霉素/链霉素（碧云天，上海，中国）。GSLCs derived from U87 or U251 cells were maintained in DMEM/F12 (Hyclone, South Logan, UT, USA), supplemented with 2% B-27 supplement (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA), 20 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF, Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA), and 1% glutamine (GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA). These cells were all cultured in a humidified atmosphere containing 5% CO₂在37℃下，如果在传代之前，必要时，用0.125％胰蛋白酶分散在5mM EDTA。所有使用的细胞系在20倍以下。

2.2。患者和标本

37名患者的组织样本（表1）S1）与胶质瘤和9名非肿瘤患者（作为对照）在本研究的免疫组织化学分析中使用。谁接受根治性手术不用开刀前收到化疗或放疗的患者在苏州大学和江苏大学附属医院澳洋（中国苏州）的第二附属医院被选定。所有的肿瘤组织用苏木精和伊红（H＆E）染色后，手术切除确认为神经胶质瘤。该研究得到了我们医院的伦理委员会，所有患者在登记前提供书面的知情同意书。

2.3。从胶质瘤细胞系中产生GSLC

为了分离和富集胶质瘤细胞系衍生的胶质瘤干细胞，在96孔板中接种单个U87或U251细胞以形成克隆。在10-15天之后，具有非典型形状和聚类生长模式的细胞（图。S1A＆B.中间）不同于正常细胞的细胞（图。S1A＆B.上文）挑取，并随后保持在神经干细胞培养基中含有B-27，EGF，和bFGF。Most cells formed neural spheres after 72 h of culture (Fig.S1A＆B.底部）。此外，来自大约通道10-15的神经球员用于本研究。

传代过程中丢弃贴壁细胞，收集神经球内的细胞进行RT-PCR分析。在U87和U251细胞的两个克隆中分别检测了作为胶质瘤干细胞标记的3个基因(图2)。S1 C＆d)在两个细胞球克隆中，Sox2的表达极度升高，而CD133和Nestin的表达也明显上调。然后，我们用三种临床治疗常用的化疗药物ADM（阿霉素）、DDP挑战来源于U87的GSLC，进一步评估其抗化疗能力结果（图。S1E.）表明U87衍生的GSLCs对与化学治疗药物的治疗不太敏感，而不是U87细胞，特别是用ADM或DDP治疗。然而，响应CBP治疗的两种细胞没有显示出显着差异。

2.4。实时PCR分析

总细胞RNA从细胞用TRIzol试剂（宝酒，东京，日本），按照标准方案分离。第一链互补DNA（cDNA），从1中合成 μ使用逆转录试剂盒的总RNA（Takara，Tokyo，Japan）。对于RT-PCR分析，1 μ第一链CDNA与10混合 μL的 （Takara，东京，日本）和1 μ引物的L (10μm）在最终体积为20 μL.使用CFX96（Bio-rad，Hercules，Ca，USA）进行温度循环和实时荧光扫描。PCR条件如下：在50℃下初始孵育2分钟，并在95℃下变性10分钟，然后在95℃下循环为40℃，60℃，30℃，72℃。30秒。每次扩增后产生熔化的曲线。相对基因表达分析用2进行^{−∆∆计算机断层扫描}方法，基因表达被标准化为管家基因GAPDH的表达水平。本研究中使用的PCR引物列于表中1。

2.5。流式细胞仪

按标准方法进行抗体染色。纯化的小鼠IgG1（Biolegend，San Diego，Ca，USA）和体育缀合的抗小鼠IgG抗体（多科学，杭州，中国）被用作单同种型对照进行间接染色，而PE缀合的小鼠IgG1抗体（Biolegend，San Diego，CA，USA）用于直接染色。小鼠抗人类PE缀合的B7-H1，B7-H3和B7-H4抗体（Biolegend，San Diego，CA，USA）以1的浓度使用 μL /测试并在4℃下孵育20分钟。B7-H6染色使用小鼠抗人B7-H6抗体（R＆D Systems，Minneapolis，Mn，USA），0.1 μg/用20号螺栓进行试验 在4℃下孵育至少20分钟，然后在4℃下用PE结合抗小鼠IgG抗体（多重科学，中国杭州）染色20分钟 使用FC500流式细胞仪（Beckman Coulter，Miami，FL，USA）和FlowJo软件（Tree Star，Inc.USA）分析最小荧光染色。

2.6。B7-H6耗尽测定

针对siRNA的人B7-H6和控制炒的siRNA从吉玛公司（上海，中国）。转染前，细胞接种聚d赖氨酸（PDL，碧云天，上海，中国）和层粘连蛋白（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州，美国）了一夜，使粘连包被的表面上。转染用脂质体3000（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，USA）按照制造商的说明书进行。A total of 80,000 cells were seeded before transfection in every well of 24-well plates, and the expression of B7-H6 and c-Myc was analyzed 72 h after transfection. The sequences of the siRNAs are listed in Table2。

2.7。在B7-H6基因与CRISPR-Cas9系统淘汰赛

关于B7-H6的敲除，我们使用四个质粒进行CRISPR-CAS9测定，分别编码CAS9基因，两个编码引导RNA，以及编码嘌呤霉素抗性基因的另一个质粒。用于目标B7-H6的指南RNA列于表中3.。简言之，将293T细胞用四种质粒用脂质转染胺3000（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，USA）共转染。嘌呤霉素（5 μ随后使用G / ml）（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo，USA）随后杀死未转染的细胞，然后挑选单个细胞以形成克隆。通过PCR和WB分析鉴定成功的双链编辑克隆，检测PCR引物显示在表中3.也

2.8。细胞增殖测定

细胞（8 000 /孔）最初在96孔孔预填充培养板中以三份镀。After 24 h, the medium was replaced with fresh medium, and the cells were transfected with siRNAs (20 μm）。孵育出指示的时间后，10 μ加入L of Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan)试剂，再孵育4 h。用Multiskan氧化石墨烯微孔板分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测量450 nm处的吸光度。

2.9。化疗药物毒性试验

细胞（8 000 /孔）最初在96孔孔预填充培养板中以三份镀。24小时后，用含有三种药物的新鲜培养基以不同的浓度或溶剂代替培养基。48小时后，10 μL的CCK-8 reagent was added into the medium and incubated for 1.5 h for U87 cells or 4 h for GSLCs. The absorbance at 450 nm was measured with a Multiskan GO microplate spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

2.10.蛋白质印迹分析

通过加入2×样品缓冲液制备细胞裂解物，然后进行超声波超声处理。通过将细胞裂解物与SDS-PAGE分离，然后湿转移到PVDF膜（Merck Millipore，Billerica，Ma，Ma，USA），根据标准方案进行Wb分析。兔抗人B7-H6多重抗体（ABCAM，剑桥，MA，USA），兔抗人磷酸化-AKT抗体，抗胰腺抗体，抗磷酸化-ERK抗体，抗泛骨单克隆抗体（细胞信号传导技术，Danvers，MA，USA）和小鼠抗人类GAPDH单克隆抗体（多科学，杭州，中国）在相应的推荐浓度下分别在4℃下分别孵育过夜。最后，HRP缀合的山羊抗兔和山羊抗小鼠 链多克隆抗体（多科学，杭州，中国）在室温下孵育1小时，以1：10,000。用ECL检测试剂盒（Bio-rad，Hercules，Ca，USA）和由化学型系统（型号6300）进行成像，将印迹进行可视化。

2.11。组织处理和IHC程序

所有手术切除的样品和活检样品都用10％中性缓冲福尔马林固定，嵌入石蜡中，并在4中连续切断 μm、 使用ChemMateTM Envision/HRP技术在选定的载玻片上进行IHC。简单地说，切片脱蜡、再水化，并进行加热诱导的表位提取。在使用H₂O.₂和3% BSA的非特异性结合，切片与B7-H6特异性一抗(Abcam, Cambridge, MA, USA)和二抗孵育，并用二氨基苯扎胺(DAB)观察。最后用苏木精对载玻片进行反染色。用小鼠IgG1抗体替代一抗产生阴性对照(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)。

B7-H6染色由不了解患者临床状况的授权病理学家进行评估。B7-H6的表达评分分别为染色强度和染色面积。染色强度评分如下：弱，1；中等，2；强，3。染色面积量化为s如下：<33%，1；>33%到<66%，2；>66%，3。每个样本都得到了一个最终分数，即强度和面积分数的乘积。

2.12。多色免疫荧光和共表达分析

多色免疫荧光方案基于酪酰胺信号放大（TSA）系统。简而言之，组织切片脱蜡、再水化，然后进行加热诱导表位提取（HIER），然后进行H₂O.₂和3％BSA阻断，以防止非特异性染色。然后，将该部分与针对B7-H6（ABCAM，剑桥，MA，USA）或SOX2（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，Ca，USA）的一部分孵育，HRP缀合的抗兔二抗和荧光酪胺（Biotium，Fremont，CA，美国）连续。然后重复它们再次享受，并重复通过另一轮抗体染色的BSA封闭的方法;最后，加入DAPI（Sigma-Aldrich，USA）以染色核，并通过荧光显微镜（尼康，日本）成像部分。

2.13.B7-H6和c-Myc mRNA表达的相关性分析

从CGGA获得325例胶质瘤的mRNA-SEQ数据（http://www.cgga.org.cn/）.首先将B7-H6和C-MYC的表达归一化为家务基因ACTB的那种，然后在分析之前进行转化。通过Pearson方法进行相关分析。 被认为意义重大。

2.14。统计分析

用未配对的学生进行组织和细胞培养实验数据的统计评估如果没有特别提到，通过使用GraphPad Prism 6（San Diego，USA）软件进行测试。 被认为意义重大。

结果

3.1。胶质瘤细胞异常B7-H6表达及其SOX2的共表达

为了分析Glioma的B7-H6表达，我们研究了B7-H6蛋白与IHC染色的胶叶瘤中石蜡染色。在来自非癌性脑组织样品的胶质细胞中检测到B7-H6的阴性或弱染色。此外，在神经元也观察到阳性染色。然而，在来自胶质瘤患者的肿瘤组织中发现了相当高的B7-H6表达。尽管在不同疾病阶段之间没有观察到显着差异，但在9个非癌组织和33个肿瘤组织样品之间观察到显着的表达差异（图1（a）和1（b）那 ）.在患者的肿瘤组织中观察到B7-H6的细胞内和细胞膜表达（图1（a））.然而，在培养的胶质瘤细胞系的表面上无法检测到B7-H6的表达（图1（c））.有趣的是，我们发现B7-H6在胶质瘤细胞中用SOx2共表达（图1（d））.数据显示B7-H6在胶质瘤组织中表达，但在细胞系中不表达，提示它可能在癌症干细胞中特异性表达。

3.2。在GSLCs B7-H6的优先表达

为了研究B7-H6是否优先于癌症干细胞表达，我们从U87和U251细胞系产生胶质瘤干细胞（GSLC）。我们确定GSLCS表现出高表达干细胞标记物（SOX2，CD133和Nestin）的干细胞特征，以及对化学治疗药物的强抗性（图。S1)然后我们分析了B7家族成员在GSLC中的表达，包括B7-H1、B7-H3、B7-H4和B7-H6（图2（a））.在GSLC中，B7-H4 mRNA显着增加（U87衍生的GSLC中的平均19.8倍，U251中的11.88倍），而B7-H1 mRNA被下调（在U87-衍生的GSLC中平均0.29倍，U251中的0.27倍）（数字2（b）），与亲本U87或U251细胞相比。令人惊讶的是，B7-H6在GSLC中特别表达，但不在U87细胞中表达（图2（c））.数据表明B7-H6是胶质瘤干细胞样细胞优先表达的重要分子之一。

3.3。B7-H6表达的敲低抑制GSLCS增殖，下调C-MYC表达，并灭活PI3K / AKT和ERK / MAPK信号通路

接下来，我们研究了B7-H6的功能在GSLCs。对于这一点，我们转染的siRNA特异性GSLCs至B7-H6，并表明，2的siRNA有效地降低相比SIR-NC B7-H6 mRNA和蛋白的表达（ ）（图。S2）.我们发现减少B7-H6表达显着抑制了GSLC增殖（图3（a））.为了了解潜在的分子机制，我们首先检查了C-myc并观察到与U87细胞相比，其MRNA在GSLC中表达（约26.49倍）（图3（c））.然而，c-Myc的过量表达后B7-H6与特异性siRNA沉默被废除（图3（c））.为了研究B7-H6在C-Myc表达中的可能作用，我们使用CGGA发布的胶质瘤RNA-SEQ数据库分析了B7-H6和C-MYC之间的mRNA表达相关性（http://www.cgga.org.cn/），并发现，有B7-H6和c-Myc 325例（之间的相关性显著 那 ）（数字3（d）），建议减少B7-H6可能在GSLC中的C-MYC封锁中发挥作用。此外，具有CRISPR-CAS9系统的B7-H6的耗竭也抑制了293T细胞中细胞增殖，表明B7-H6在不同类型的细胞中的一般作用（图3（f））.

我们接下来检查了PI3K / AKT和ERK / MAPK信号传导途径，以确定它们是否参与B7-H6介导的GSLC增殖抑制。结果表明，在B7-H6敲低GSLC中检测到磷酸化形式的AKT和ERK1 / 2水平的显着降低，而总AKT和ERK1 / 2水平不变（图3（b））.这些发现表明，PI3K / AKT和ERK / MAPK均参与B7-H6表达敲低介导的GSLCS生长的降低。

3.4。RNMT涉及GSLC中的B7-H6 / C-MYC轴

我们访问与33种主要肿瘤类型的RNA-SEQ数据库来评估基因与B7-H6和c-Myc的共表达。的五大得分基因（TAF1，TAFL1，CBL，CCNT1和RMNT）进一步分析在CGGA数据库胶质瘤组织样品英寸在这些基因中，TAF1和TAFL1不能在组织样品的检测（数据未显示）。其他三个基因显著与B7-H6的mRNA表达用的0.7475的相关系数（ ），0.5984（ ），和0.7558（ ）分别适用于CBL、CNMT和RMNT（图4（a）-4（c）)然后，我们研究了这三个基因是否受B7-H6调控并参与B7-H6/c-Myc轴。我们分析了这三个基因在转染B7-H6 siRNA的GSLCs中的表达，发现在B7-H6敲除的GSLCs细胞中，只有RNMT表达显著降低（图1）4（d））（ ）.这些结果表明RNMT是B7-H6/c-Myc轴的下游分子。

4.讨论

在本文中，我们已经表明，B7-H6，一个新发现的B7家族的分子[14.]，在人胶质瘤组织中异常表达，增强肿瘤细胞增殖。已经证明B7-H6与NK细胞活化受体NKP30相互作用，其参与先天免疫应答[18.] NK细胞诱导的抗肿瘤细胞毒性[19.]据报道，胃癌中存在B7-H6[22.]，非小细胞肺癌[23]， 成神经细胞瘤 [24，卵巢癌[25那26]，星形细胞瘤[27]， 乳腺癌 [28]急性早幼粒细胞白血病[20.]和B细胞非霍奇金淋巴瘤[29］．因此，以B7-H6/ nkp30为基础的策略已被用于构建结合嵌合抗原受体(CAR)的抗肿瘤免疫治疗[30那31]或嵌合蛋白技术[32那33］．我们在此发现B7-H6优先在人胶质瘤组织中表达。令人惊讶的发现是区分胶质瘤肿瘤组织和非癌组织中的B7-H6表达，尽管B7-H6表达与病态等级没有明确的相关性。这种发现与一般观念一致，即B7-H6不仅通过干扰肿瘤 - NK细胞相互作用的微环境而导致肿瘤发生器[19.那20.那25]但还通过促进肿瘤细胞中的恶性表型[29］．

然而，出乎意料的是，我们发现B7-H6未在几种已知的胶质瘤细胞系的细胞表面上表达。因此，我们假设B7-H6可以优先于胶质瘤肿瘤细胞的某些阶段和/或亚群中表达，这可能受到肿瘤微环境的影响。支持我们的概念是，在胶质瘤肿瘤组织中的肿瘤细胞内的一些区域中发现了B7-H6的B7-H6的共表达。此外，虽然B7-H6未在胶质瘤细胞系U87和U251上表达，但是在衍生自U87或U251细胞的胶质瘤干细胞（GSLC）上令人惊讶地提升B7-H6。有趣的是，GSLC表达极高的SOx2水平，并且显着上调CD133和巢蛋白表达，其是已知的干细胞相关标记。提供我们结论的进一步证据表达B7-H6表达的GSLC比亲本细胞更耐放地和DDP。B7-H6的过表达在MRNA和蛋白质水平中证实了。重要的是，B7-H6调节GSLC的细胞生长，因为B7-H6的还原显着降低了GSLCS细胞的增殖。在B7-H6缺乏293T细胞中进一步证实了B7-H6促进细胞增殖的功能。这符合B7-H6在B细胞非霍格金淋巴瘤中的影响通过促进细胞循环和克隆形成，增强转移和侵袭和保护细胞的能力[29］．我们的研究结果将胶质瘤干燥的细胞添加到可通过B7-H6各种可能受影响的肿瘤细胞列表中。

c-Myc，一种在多种癌症中过度表达的癌基因，在细胞周期中起重要作用[34[参与了GSLC的B7-H6介导的细胞增殖，因为B7-H6的下调降低了C-MYC的表达。基于CGGA获得的RNA-SEQ数据，B7-H6和C-MICC的mRNA表达与CGGA数据之间存在显着相关性。我们进一步鉴定了可能涉及B7-H6 / C-Myc轴的RNMT，因为B7-H6表达的还原降低了GSCLS中RNMT的表达。RNMT（RNA鸟嘌呤-7甲基转移酶）是RNMT-RAM复合体介导的mRNA甲基化的组分，据报道是C-MYC表达的不可或缺的因素[35］．还报道了RNMT-RAM络合物可以通过C-MYC募集下游MYC-PRODI-LIGNERNA mRNA甲基化[36那37］．因此，我们可以设想通过C-MYC和RNMT影响细胞增殖。由于PI3K / AKT和ERK信号途径有助于细胞增殖，并且也由C-MYC调节[38那39[B7-H6表达敲低GSLC，我们进一步阐明了P-AKT和P-ERK显着降低。另外，胶质瘤中不同遗传谱的鉴定揭示了胶质瘤分类的新型分子生物标志物。因此，我们进一步分析了B7-H6表达和IDH1 / 2，TP53，EGFR，ATXR和EZH2的突变之间的主要突变。结果，在IDH1-R32和IDH2-R172突变中观察到显着的B7-H6上调，同时在EZH2突变中下调（图。S3)尽管由于高细胞毒性治疗敏感性，IDH突变表明预后较好，但不可否认的是，IDH突变通过多种机制驱动肿瘤发生[40］．B7-H6和IDH之间的相关性表明了具有IDH突变的胶质瘤患者的新治疗方面。

总之，我们发现用SOX2共同抑制的人胶质瘤组织中B7-H6表达的异常上调。通过建立衍生自胶质瘤细胞系的胶质瘤干细胞（GSLC）线，我们揭示了B7-H6优先在胶质瘤干细胞中表达。重要的是，我们阐明了通过癌基因C-MYC，PI3K / AKT和ERK / MAPK信号传导途径的B7-H6调节GSLC的细胞增殖。由于B7-H6是NKP30的天然膜表达活化剂，我们的研究结果表明B7-H6可能是胶质瘤免疫疗法的潜在目标。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

信息披露

载有一些初步数据的早期版本的本手稿是在第17届国际免疫学大会上提交的摘要（2019年）[41］．

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

我们感谢陈教授，从粘膜免疫科，Nidcr，NIH，美国，为他的宝贵讨论和建议。江苏省高校（18KJB320023和17KJA310004），江苏省医疗青年人才（孙京），通过科学，技术和教育和国家，江苏省医疗青年人才（孙京）的资金得到支持。中国自然科学基金（授予81873876）。

补充材料

图S1：U87和U251的细胞形态和识别衍生GSLCs。（A和B）或U87 U251用完全培养基（200）（以上）培养。U87或成形为后15天克隆形成（200）（中）非典型形式U251细胞。Most cells from (middle) formed spheres 72 h after culturing with stem cell medium (200) (bottom). (C and D) Sox2, CD133, and Nestin were detected in two clones of GSLCs derived from U87 or U251 cells each by real-time PCR. Data were shown as 。（e）将U87和GSLC播种在96个孔中，并用三种不同浓度的化疗药物治疗48小时。A450通过CCK-8试剂测量。抑制无线电计算为（A450NC-A450）/ A450nc。图S2：B7-H6由特定siRNA沉默。（a）通过在转染后的实时PCR 72小时检测B7-H6 mRNA。（b）通过流式细胞术检测在转染后通过流式细胞术检测B7-H6蛋白。填充的直方图代表同种型控制，而打开直方图表示染色组。（c）通过晶体缩写后检测到B7-H6蛋白在转染后检测到。图S3：B7-H6表达与基因突变之间的主要研究。进行测试以比较样品与基于CGGA mRNA-SEQ数据库的特异性基因突变的样品之间的B7-H6相对表达的差异（ ）.表S1：本研究中使用的组织样本信息。（补充材料）

参考

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