一个包含CD4多个抗原肽疫苗⁺T细胞抗原表位增强体液免疫旋毛虫感染小鼠

文摘

Multiepitope肽疫苗有传统优势重组蛋白疫苗由于其简单和快速生产和可能包含多个保护病原体的抗原表位。然而,它通常是免疫原性很差,需要共轭很大载体蛋白。肽共轭中央赖氨酸核心形成多个抗原肽(地图)将增加肽疫苗的免疫原性。在这项研究中,我们构建了一个地图CD4细胞组成⁺T细胞和B细胞抗原表位的paramyosin (Pmy)旋毛虫(Ts-Pmy),已被证明是一个好的候选疫苗在我们以前的工作。免疫原性和诱导保护性免疫的地图旋毛虫(t . spiralis)感染在老鼠身上进行评估。我们表明,老鼠与地图包含CD4免疫⁺T细胞和B细胞抗原表位(测序结核菌)诱导显著提高保护的挑战t . spiralis幼虫(肌肉幼虫减少35.5%)相比,仅包含B细胞表位的地图(MAP-B)肌肉幼虫减少了12.4%。测序结核菌的免疫引起的更好的保护与提高抗体滴度(IgG1和IgG2a)和混合Th1 / Th2细胞因子的生产免疫小鼠的脾细胞分泌的。进一步的流式细胞术分析淋巴细胞在脾脏和淋巴结与测序结核菌特别表明,小鼠免疫增强T卵泡辅助(Tfh)细胞的生成和生发中心B细胞(GC),而抑制卵泡监管CD4细胞⁺T (Tfr)细胞和调节性T细胞(Treg)。脾部分还证实,测序结核菌疫苗接种免疫荧光染色增强gc的形成。我们的研究结果表明,CD4细胞⁺T细胞表位的Ts-Pmy为诱导组件疫苗更好的保护是至关重要的t . spiralis感染。

1。介绍

Trichinellosis是全球食源性人畜共患病动物和人之间传播,主要由感染引起的旋毛虫(1]。人感染通过包含感染性幼虫吃生的或未煮熟的肉类,主要来自猪或野猪(2]。在中国,受污染的猪肉仍然trichinellosis在人类的主要来源。从2005年到2009年,人类trichinellosis 15的爆发,与1387例和4例死亡,据报道在中国西南三省或自治区;其中12个(85.71%)是由于吃生的或未煮熟的猪肉(3]。猪肉的一项调查报告,总体患病率t . spiralis感染猪是0.61%(5/823)在中国的河南省,0.91%(5/550)的头猪被感染仅在南阳城市(4]。据估计,超过4000万人的风险旋毛虫在中国感染(5]。在工业化国家,虽然商业生产的猪肉在控制管理目前约占一半的世界猪肉生产,对自由放养的猪肉消费者的需求,特别是在欧洲和北美,越来越多。在东欧和阿根廷,传统散养backyard-raised猪经常参与喂养的食物浪费,国内猪肉感染仍然是归咎于许多暴发trichinellosis [6]。因为不同程度的户外暴露在散养体系中,有人担心这样的暴露会增加传播的风险t . spiralis从野生动物水库对人类6]。据报道,老鼠生活在养猪场发挥重要作用在维护或这种寄生虫传播到其他动物2]。因此,打断寄生虫传播通过疫苗接种的牲畜有力和有效的疫苗是一种实用的方法来防止人类trichinellosis。

在过去的30年里,许多的努力一直致力于开发疫苗t . spiralis感染的目的,减少虫繁殖能力或减少肌肉的幼虫和成虫负担(1]。候选疫苗包括excretory-secretory (ES)抗原(7),重组蛋白(8,9),DNA疫苗(10),诱导不同级别的部分保护性免疫的动物模型。然而,作为一个tissue-dwelling寄生虫,很难建立一个有效的疫苗,因为导致不育的免疫力t . spiralis有一个复杂的生命周期,不同stage-specific抗原,免疫逃避策略(11,12]。子单元基于多个保护性抗原表位肽疫苗可能克服这些问题,从而提供了一个新颖的方法来开发疫苗等传染病trichinellosis [13]。

在我们之前的研究中,一个有希望的候选疫苗,paramyosin (Pmy)t . spiralis(Ts-Pmy)展出部分保护性免疫力t . spiralis感染小鼠(14]。一种保护B抗原决定基Ts-Pmy YX1,已经被筛选噬菌体展示肽库特征与保护性单克隆抗体(mAb)命名为7 e2 (15]。为了提高宿主体液免疫在驱逐起着重要的作用t . spiralis(16),两个强有力的CD4细胞⁺T细胞抗原表位的Ts-Pmy确定之前(17被融合的保护B抗原决定基Ts-Pmy (YX1)构建多个抗原肽(测序结核菌)在这项研究。我们发现,小鼠免疫这幅地图融合(测序结核菌)基于T / B抗原表位Ts-Pmy诱导强有力的保护t . spiralis感染与增强体液免疫反应有关。

2。材料和方法

2.1。道德声明

本研究按照美国国立卫生研究院执行实验动物保健和使用指南。综述了所有动物实验程序和批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)首都医科大学(批准文号:aeei - 2015 - 149)。

2.2。老鼠和寄生虫

六到八周大的雌性BALB / c (2^d)老鼠从实验动物获得服务中心首都医科大学(中国,北京)和特定的无菌标准条件下长大。每个实验小组由十个老鼠。t . spiralis533年(ISS)菌株用于本研究中维护女性ICR小鼠,和肌幼虫从受感染小鼠的肌肉恢复使用修改后的pepsin-hydrochloric酸消化法所描述的赌博等。18]。

2.3。合成图

测序结核菌和MAP-B建造在这个研究包含两个CD4 four-branched地图⁺T细胞抗原表位(T2和T5)与B细胞表位融合(测序结核菌)或只有B细胞表位(MAP-B)。的地震遥测肽与C末端的赖氨酸地图的核心。两个不同的CD4⁺T细胞抗原表位,T2和T5,代表了CD4细胞⁺T细胞抗原表位P2和P5确认在我们先前的研究[17,19),为构建测序结核菌(表选择1,数据1(一)和1(b))。B代表了B细胞抗原决定基最初定为YX1,被保护马伯,授予部分保护t . spiralis感染由被动转移(15]。地图被英杰华合成系统生物学公司(中国)。地图的合成利用固相合成使用9-fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC)作为保护组。合成地图被高效液相色谱法(HPLC)净化,然后冻干干燥存储在使用前在-80°C。地图也被质谱,地图的纯度超过90%。冻干地图被溶解在PBS在5毫克/毫升为股票的解决方案是使用之前储存在-40°C。工作在PBS浓度为0.6 mg / ml。

2.4。免疫疗法

评估测序结核菌引发的免疫反应和MAP-B十雌性BALB / c小鼠皮下注射免疫。地图与弗氏佐剂乳化(Sigma-Aldrich、德国)使用的初始剂量和不完全佐剂成套辅助以下两个助推器接种的间隔两周。30μ克测序结核菌或MAP-B (50μl)与同样体积的佐剂乳化单剂量。另一个10小鼠皮下注射50μl PBS乳化同样体积的相应的辅助控制。一周后最后的提振,五个老鼠从每组以牺牲收集血清,脾脏,腹股沟淋巴结(ILNs)评价诱导免疫反应。其余5老鼠挑战400感染肌肉幼虫(ML)t . spiralis评估保护如下所述。实验设计的表示如图2。

2.5。抗体反应

反- - - - - -B细胞epitope-specific地图免疫引起的抗体ELISA测定。简单,板涂有10μg /的B细胞表位肽YX1涂层缓冲区在一夜之间在4°C。阻塞后,连续稀释血清(0 w、2 w, 4 w, 7 w,和13 w)被添加在37°C的30分钟之后HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 1000稀释)。每组的浓度表示的几何平均数稀释。免疫球蛋白子类的检测,血清稀释1:2000和1:5000年,然后孵化Biotin-conjugated鼠Anti-Mouse IgG1或IgG2a(美国BD生物科学)后跟Streptavidin-HRP(美国BD生物科学)。颜色是与开发tetramethylbenzidine衬底(美国BD生物科学三甲)和阅读在450海里。

2.6。细胞因子测定

一周后最后的免疫,老鼠牺牲和脾细胞分离无菌使用小鼠淋巴细胞分离介质(Dakewe生物技术,中国)。在离心机后,脾脏细胞resuspended和调整 细胞/毫升完全rpmi - 1640补充10%的边后卫,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μg / ml)。为在体外刺激,总共 脾细胞与混合肽(2.5孵化μg / ml T2和单独T5)在200年μl完整的rpmi - 1640 48 h在37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂。脾细胞与ConA同时刺激(美国Sigma-Aldrich;5μg / ml)担任积极控制。细胞因子IFN -γ2、il - 4、IL-5和il - 6检测使用相应的酶联免疫试剂盒(美国BioLegend),根据制造商的指示。

2.7。流仪结果

小鼠的脾脏和ILNs收获最后的免疫后7天。流式细胞术的淋巴细胞进行了收集和分析。CXCR5的频率⁺PD-1⁺CD3⁺CD4⁺Tfh细胞在脾脏,CXCR5⁺PD-1^高CD3⁺CD4⁺在ILNs Tfh细胞(),和CD25⁺FoxP3⁺CD3⁺CD4⁺Treg细胞在脾脏内提出总CD4细胞⁺T细胞;GL7的频率⁺Fas⁺B220⁺生发中心B细胞(GC)总B220内提出⁺B细胞;和CXCR5的频率⁺FoxP3⁺CD3⁺CD4⁺总和生育率细胞CD4细胞内⁺T细胞(在脾脏和ILNs)被检测到。死细胞已排除了可行性染料染色,重复被排除在外的FSC / A和FSC / W的控制分析。细胞分析BD LSRFortessa™流式细胞仪(美国BD生物科学)。数据获取和分析了BD FACSDIVA™8.0.2版本(美国BD生物科学)。

表面染色,脾细胞被封锁anti-CD16 / CD32马伯(克隆:93 BD Pharmingen™,美国)和染色后抗体:anti-CD3e-Percp-Cyanine5.5(克隆:145 - 2 - c11、eBioscience,美国),anti-CD4-FITC(美国eBioscience克隆:RM4-5) anti-PD-1-PE(美国eBioscience克隆:J43)和anti-CXCR5-APC(美国eBioscience克隆:SPRCL5) Tfh细胞分析;anti-GL7-FITC(克隆:GL7, BD Pharmingen™,美国),anti-Fas-PE(克隆:Jo2, BD Pharmingen™,美国),和anti-B220-PerCP-Cy5.5(克隆:RA3-6B2, BD Pharmingen™,美国)马伯GC B细胞分析。可行性染料染色,可确定的可行性染料eFluor™450(美国eBioscience)添加表面染色抗体。

细胞染色(Treg /总生育率),脾细胞被封锁anti-CD16 / CD32马伯(克隆:93 BD Pharmingen™,美国),沾anti-CD3e-Percp-Cyanine5.5, anti-CD4-FITC anti-CXCR5-APC,或anti-CD25-APC(美国eBioscience克隆:PC61.5),然后用FoxP3固定/透化作用固定工作方案(美国eBioscience)和permeabilized透化作用缓冲(美国eBioscience)。之后,这些细胞被细胞沾anti-FoxP3-PE(美国eBioscience克隆:FJK-16s)。

2.8。免疫荧光分析

BALB / c小鼠的脾脏分离后一周最后免疫和嵌入在最佳切削温度(10月)化合物(樱花,美国)。组织切片前被冻结在-80°C (8μ米)在低温恒温器(德国徕卡)。后固定在冷丙酮和1% BSA在PBS阻塞在室温下1 h,部分被孵化与生物素化的花生凝集素(机构,1:100稀释,向量,美国)在一夜之间在4°C。DyLight™488链霉亲和素(1:100稀释,BioLegend,美国)作为二级抗体室温1 h。最后,Alexa萤石®647 -共轭anti-mouse CD45R(1: 150稀释,克隆RA3-6B2 BioLegend,美国)是在室温下孵化1 h。下的部分进行扫描Pannoramic扫描仪器(3 dhistech、匈牙利)。为量化的面积GCs、脾三部分从每组小鼠被ImageJ分析软件。

2.9。挑战试验

第三次免疫后一周,其余五每组的小鼠口服400的挑战t . spiralis -感染性毫升。六周后感染,幼虫从每个被感染的老鼠的肌肉被收集和统计。毫升负担减速率的计算基于恢复幼虫每克(液化石油气)肌肉从小鼠免疫与测序结核菌或MAP-B和PBS对照组。具体地说,它是计算如下: 。三个独立的实验。

2.10。统计分析

使用SPSS统计分析与单向方差分析对于Windows, 17.0版。所有数据都表示为 (SD)或均值±SD。值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。老鼠与测序结核菌疫苗免疫产生显著较高的抗体反应

BALB / c小鼠免疫与测序结核菌和MAP-B三次,和血清收集0 w、2 w, 4 w, 7 w,和13 w。B细胞表位肽YX1作为包被抗原,抗体和抗体YX1 ELISA测定。Anti-YX1免疫球蛋白浓度在五个老鼠免疫与测序结核菌大大提升第一次免疫后,明显高于那些老鼠免疫MAP-B或PBS(图3(一个), )。免疫球蛋白抗体子类决定在1:2000稀释(图3 (b))和1:5000(图3 (c))和显示,测序结核菌诱导IgG1和IgG2a反应,IgG1是主要的。然而,MAP-B只包含B抗原决定基和免疫MAP-B诱导Th2极化方向显示主要IgG1和生产IgG2a受损。

3.2。测序结核菌疫苗诱导小鼠混合Th1、Th2细胞因子反应

细胞因子IFN -γ2、il - 4、IL-5和il - 6分泌免疫小鼠的脾细胞混合肽T2和T5刺激在体外被检测到相应的特定的ELISA。典型的Th1细胞因子的水平(IFN -γ和2),Th2细胞因子(il - 4和IL-5),刺激脾细胞的培养上清液中il - 6与测序结核菌显著提高小鼠免疫与免疫小鼠MAP-B或PBS(图4)。然而,没有明显的所有细胞因子在小鼠免疫反应MAP-B比PBS对照组。这些结果表明,测序结核菌疫苗诱导小鼠混合Th1、Th2细胞因子反应。

3.3。测序结核菌疫苗增强Tfh细胞和生发中心B细胞的扩张

高亲和性抗体的生产依赖于复杂的交互与GC Tfh细胞B细胞的反应。七天最后一次免疫后,脾脏淋巴细胞和ILNs收获和流式细胞术分析了确定CXCR5的频率⁺PD-1⁺CD3⁺CD4⁺Tfh细胞在脾脏,CXCR5⁺PD-1^高CD3⁺CD4⁺GL7 Tfh细胞(ILNs)⁺Fas⁺B220⁺GC B细胞在脾脏,CXCR5⁺FoxP3⁺CD3⁺CD4⁺总和生育率细胞(20.)(在脾脏和ILNs)和CD25⁺FoxP3⁺CD3⁺CD4⁺Treg细胞在脾脏()。代表点块流仪结果如图5。事实证明,CXCR5⁺PD-1^高CD3⁺CD4⁺T细胞在淋巴结GC代表一个特定Tfh子集与B细胞成熟和免疫球蛋白生产(21]。在总CD4 Tfh细胞的频率⁺脾脏T细胞和总B220 ILNs和GC B细胞⁺脾脏B细胞增加小鼠免疫与测序结核菌相比MAP-B或PBS组(数字5(一个)和5 (b))。的频率一致,总和生育率在CD4细胞⁺脾脏T细胞和ILNs CD4和Treg细胞的频率⁺小鼠脾脏T细胞的显著降低免疫与测序结核菌较其他两组(数字5 (c)和5 (d))。

GCs通过接种疫苗的形成可以通过机构确认染色(22]。测序结核菌疫苗接种的形成极大地增强了GCs相比,小鼠的脾脏MAP-B或PBS组经免疫荧光染色(图6)。

3.4。部分测序结核菌引起的免疫保护性免疫力

与测序结核菌挑战实验表明,小鼠免疫诱导毫升PBS对照组相比减少35.5% ( ),也明显高于MAP-B免疫(ML减少12.4%, )。然而,没有明显差异之间的ML负担MAP-B和PBS组(表2)。这些结果表明,测序结核菌免疫引起部分保护t . spiralis感染,而MAP-B免疫不引起显著的保护( )。

4所示。讨论

在过去的几十年中,研究人员一直致力于发展疫苗trichinellosis利用不同的疫苗平台,如原油虫抗原,重组蛋白和DNA疫苗。作为t . spiralis不能培养在体外,很难获得大量的寄生虫抗原。近年来,研究人员专注于重组蛋白质和DNA疫苗。例如,重组的特性,6-bisphosphate醛缩酶(23),丝氨酸蛋白酶(24),DNase II酶(25)和烯醇酶26从t . spiralis展示肌肉幼虫减少从17.7%到62.1%不等。不同的DNA疫苗显示肌肉幼虫从15.8%减少到71.84%t . spiralis幼虫的挑战[10,26,27]。一些研究已经完成trichinellosis肽疫苗。1995年首次报道,40-mer合成肽疫苗诱导成年蠕虫减少皮下注射免疫小鼠(64.3%28]。七年之后,同样的研究小组报告说,鼻内政府与霍乱毒素B 30-mer肽抗原的女性显著降低线虫繁殖力与对照组相比(33.3%)(29日]。另一个研究小组报告说,免疫小鼠的减毒沙门氏菌应变显示30-mer肽使用ShdA autotransporter诱导显著减少成人蠕虫(61.83%)t . spiralis感染(30.]。所有上述的肽t . spiralisgp43抗原,已被证明是一个高度immunodominant蛋白质。

在我们之前的研究中,Ts-Pmy已被证明是一个好的候选疫苗抗原免疫小鼠诱导显著保护的挑战t . spiralis -感染性幼虫(14]。然而,作为一个大的蛋白由885个氨基酸组成的预测分子质量102 kDa,很难表达可溶性重组蛋白在原核表达系统。甚至在真核表达系统中,只有一小部分的蛋白质可以表示为可溶性蛋白质,从而防止其扩大生产重组蛋白疫苗。除了困难屈服的完整的重组蛋白,蛋白质抗原的复杂性可能导致不良有害的副作用(31日]。近年来,肽的生产变得很容易复制,快速、有效的多肽合成的研究进展。此外,化学合成可以删除的担忧与表达式的生物污染系统相关抗原的重组蛋白的生产。肽疫苗也有一些其它的优势,例如水溶性有简单的存储条件下高稳定性(一般不需要“冷链”)(32]。由于这些优势,肽链型疫苗正在发挥着重要的作用在癌症和感染性疾病疫苗的发展13,33]。一些肽链型疫苗临床试验已经成功测试了近年来作为癌症治疗的潜在候选人(33]。

然而,肽疫苗也有一些缺点,比如可怜的免疫原性和共轭很大载体蛋白的需要(例如,KLH和BSA)。肽链型疫苗的免疫原性,增加多个抗原肽的新战略(地图)成为一个受欢迎的选择。地图是人为分支利用肽lysine-based中央骨干,可以结合多个肽链。支肽有时可以大大提高他们的免疫反应,因为高摩尔比率的多肽抗原的核心分子,使他们更加的高分子量结合的免疫原性而不需要载体蛋白(32,34- - - - - -36]。地图在几个传染病疫苗研究,如淋巴丝虫病(37),恶性疟原虫(恶性疟原虫)[38),鼠疫杆菌(39),和艾滋病毒(40]。临床研究已经在地图上进行疫苗恶性疟原虫子孢子(41]。在淋巴丝虫病,thioredoxin-transglutaminase地图授予保护63.04%明显高于整个蛋白质混合疫苗(55.8%)在沙鼠模型(37]。在恶性疟原虫anti-MAP-1(环子孢子蛋白基质)抗体阻止HepG2肝细胞的入侵恶性疟原虫子孢子(最高95.16%,hla a2 C57BL / 6;最低,11.21%在BALB / c) [38]。本研究显示,免疫反应引起的地图通常被MHC的依赖。它突出的前景图结构可能产生高效抗疟反应基因的多样化HLA类型。

中肽疫苗,epitope-composed有其他一些独特的优势,为疫苗发展成为一个不错的选择。这种类型的疫苗可以让我们专注于具有强免疫原性的抗原表位,可能诱发免疫动物的健壮的保护性免疫作用。识别和正确选择这些抗原表位是关键的一步的表位肽疫苗的设计。免疫原性蛋白抗原表位的利益应该确定通过使用生物信息学工具表位预测算法(42)或通过筛选抗体(43]。应该测试和证实这些抗原表位诱导的能力强,长期的体液(B细胞或Th2抗原表位)和/或细胞免疫(CTL或Th1抗原表位)对目标病原体(32,42]。在这项研究中,我们构建了一个基于T / B细胞表位的地图Ts-Pmy和评价其免疫原性和诱导保护性免疫相比,B细胞epitope-conjugated地图。

先前的研究表明,Th2免疫反应是重要的保护性免疫力t . spiralis感染(16]。因此,Th2抗原表位疫苗的重要组成部分t . spiralis感染。在免疫应答的启动,第二的主要组织相容性复合体(MHC)结合处理抗原表位抗原呈递细胞触发进一步辅助T细胞的激活,激活细胞免疫和体液免疫。在我们以前的工作,基于BALB / c小鼠模型,2^d限制CD4⁺T细胞抗原表位(我^d和我^d)Ts使用SYFPEITHI -Pmy预测数据库。表位肽可以刺激脾细胞的rTs-Pmy-immunized Th2细胞因子il - 4和IL-5老鼠分泌。进一步的验证,这些抗原表位immunodominant Th2抗原表位Ts-Pmy通过实验在体外和在活的有机体内(17]。在实验中CD4的识别和描述⁺T细胞抗原表位,刺激小鼠的脾细胞免疫与rTs-Pmy最高IL-5由肽T5,而T2刺激Th2细胞因子il - 4的产量最高,而其他T细胞抗原表位。T5也刺激的小鼠脾细胞免疫与T5 CD4细胞产生il - 4在所有最高的候选人⁺T细胞抗原表位(17]。根据这些结果,T5和T2 CD4被选中⁺T细胞抗原表位在本研究构建地图。此外,保护B抗原决定基Ts-Pmy YX1,坐落在88年和107年之间的氨基酸Ts-Pmy,已被识别的马伯7 e2被动转移保护t . spiralis天真的小鼠感染(15]。评估Th2抗原表位能否协调B细胞抗原决定基产生更好的保护t . spiralis感染与B细胞表位相比,两种类型的地图包括测序结核菌和MAP-B构造。测序结核菌结合两个Th2抗原表位和一个B细胞表位而MAP-B只包含B细胞表位(图1)。诱导免疫反应和保护作用t . spiralis感染免疫与这两个地图疫苗进一步评估和比较。

我们以前的研究表明,重组multiepitope蛋白质(rMEP)四CD4结合⁺T细胞抗原表位和一个B细胞表位生产减少55.4%的肌肉幼虫(19]。在这项研究中,我们表明,小鼠免疫与测序结核菌诱导显著提高保护的挑战t . spiralis感染性幼虫(ML减少35.5%)相比,诱导的MAP-B毫升下降只有12.4%。测序结核菌没有产生类似的保护引起rMEP可能由于更少的保护性抗原表位包含在测序结核菌的构造。由于技术的局限性地图合成、四个CD4的只有两个⁺T细胞抗原表位,同时构建一个B细胞表位在本研究地图。nonsterilizing豁免权或低保护是疫苗开发的困境不仅对旋毛虫感染也为其他寄生虫感染。例如,其中一个最寄生虫疾病的研究,血吸虫病,酒吧来实现人类的保护效果是一致的诱导40%或更好的保护由世界卫生组织(世卫组织),尽管这是一个适度的目标,它尚未达到六个最有前途的血吸虫病疫苗候选(Sm28GST、IrV5 Sm14, paramyosin, TPI,和Sm23) (44,45]。疫苗钩虫虫减少不到30%的负担也在临床试验中测试(46,47]。低保护单一疫苗免疫引起的寄生虫感染可能是由于生命周期的复杂性,多样性stage-specific抗原,免疫逃避策略,和宿主反应的调节效应48]。的确,寄生虫数量直接相关的病理蠕虫存在的主机。相反,一种疫苗的主要好处是减少蠕虫负担,相应的发病率,尤其是对驱虫的寄生虫,这导致主机nonsterilizing免疫(49]。

在这项研究中,测序结核菌引起的健壮的体液免疫反应和免疫球蛋白g比MAP-B滴度高。免疫球蛋白亚型检测表明,测序结核菌免疫诱导IgG1和IgG2a (IgG1主导),而MAP-B主要诱导IgG1指示测序结核菌刺激Th1、Th2反应。由脾细胞分泌细胞因子的概要文件还显示,测序结核菌免疫诱导不仅Th2细胞因子(il - 4和IL-5)而且Th1细胞因子(IFN -γ和2)。Th1细胞因子反应也升高,推测抗原表位短肽,它们可能是cross-presented树突细胞。

进一步的流式细胞术分析淋巴细胞在脾脏和淋巴结与测序结核菌特别表明,小鼠免疫增强Tfh细胞和GC B细胞的生成和抑制总和生育率/ Treg细胞。脾部分还证实,测序结核菌疫苗接种免疫荧光染色增强gc的形成。所有结果表明地图包含Th2和B细胞抗原表位Ts-Pmy比地图更好的保护与B细胞表位,同事与增强体液免疫反应,增强Tfh和GC B细胞,抑制总和生育率和Treg细胞。它还表明,B细胞表位单独不能诱导体液免疫反应强,这是与减少代Tfh和GC B细胞。

Tfh细胞CD4是独一无二的⁺T卵泡辅助细胞提供同源有助于B细胞诱导的高亲和性GCs抗体生产(50]。Tfh细胞依赖CXCR5本地化卵泡地区淋巴器官和维护稳定的接触antigen-primed B细胞(51]。GCs强烈支持B细胞克隆扩张,体细胞hypermutation,选择高亲和性的B细胞和类免疫球蛋白基因的开关。GC的产品反应是记忆B细胞和长寿的浆细胞分泌抗体的高亲和性(22]。越来越多的证据显示很强的相关性之间的频率Tfh细胞和抗原抗体反应,更重要的是,它是进一步证明了人类的免疫系统(52]。除了Tfh增生的诱因,测序结核菌免疫诱导il - 6的海拔也被证明是一个重要的监管机构Tfh分化的细胞(53]。据报道,il - 6在形成中扮演了重要角色的获得性免疫反应促进B细胞的分化成免疫球蛋白生产浆细胞和增加血清丙种球蛋白水平(54]。此外,il - 6也是一个重要的细胞因子,防御病原体入侵的信号传送或组织损伤网站刺激急性期反应,免疫反应、造血作用,以及各种内部器官准备宿主防御(55]。

作为一个强大的协会Tfh细胞与多个系统和粘膜抗体反应在许多研究证实,许多疫苗策略的探索了提高代Tfh细胞通过疫苗的调制方案。MF59,例如,水乳佐剂已经被证明能够促进GC B细胞分化和Tfh感应(56]。其他疫苗策略,如将启动DNA和蛋白质增加(57)或纳米疫苗(58),显示扩大Tfh细胞群,促进GC发展,导致增强体液免疫。抗原剂量也有积极影响Tfh细胞的诱导频率和随后的血清学反应(59]。鉴于先天免疫信号在塑造的重要性自适应免疫反应(60),一个特定的先天免疫途径与Tfh cell-skewing能力,如TLR8,已被确认为合理设计Tfh cell-targeted疫苗佐剂(61年]。在未来的研究中,努力将针对引发更强的抗原Tfh肽疫苗引发的反应。

T卵泡监管(Tfr)细胞是一种专门的子集效应Treg细胞抑制抗体生产(62年]。成功的体液免疫是一个微妙的平衡刺激Tfh细胞和抑制总和生育率细胞而不是简单的结果的总数Tfh细胞(63年]。Tfh和总和生育率细胞紧密控制的规模和输出GC的反应,从而使它们操纵疫苗设计关键目标。增加Tfh细胞的形成和/或函数或减少总生育率施加的抑制细胞在GC可能是一个理性的策略改进疫苗的反应和功效64年]。我们的研究显示Tfh频率的增加和减少的频率总和生育率在脾脏和ILNs与抗体反应的扩张,这与以前的研究一致(63年,65年]。

Treg细胞被认为是消极的监管者可以抑制活化的免疫反应,扩散,和效应功能(如细胞因子生产)自然杀伤(NK)和NKT细胞、B细胞、CD4细胞⁺和CD8⁺T细胞和抗原递呈细胞,在体外和在活的有机体内(66年]。作为生存策略的驱虫的寄生虫,慢性寄生虫感染刺激亚生产监管和抗炎细胞因子,减少入侵宿主免疫应答的蠕虫67年]。许多寄生虫感染,如Heligmosomoides polygyrus(68年),日本血吸虫(69年),曼氏裂体吸虫(70年),而与象皮病马来(71年),被刺激亚群的数量增加。最近,我们的研究小组已经发现Treg细胞显著诱导肠道阶段(感染后的6天)和新生幼虫迁移阶段(感染后的15天内)早期t . spiralis感染(72年]。在我们的研究中,我们发现,免疫与测序结核菌Treg下降( )总和生育率细胞和刺激Tfh dLNs GC B细胞和脾脏免疫小鼠单独MAP-B相比,表明添加T-epitope MAP-B可以抵消免疫抑制寄生虫感染和促进体液免疫反应引起的疫苗抗原。这也可能部分解释了免疫保护作用诱导的测序结核菌和MAP-B。

在当前的研究中,我们发现肽疫苗组成CD4测序结核菌⁺T细胞抗原表位可以产生更好的保护t . spiralis相关的感染,增强体液免疫反应,相比MAP-B和PBS组。这项研究的结果表明,B-epitope本身并不是有效的诱导健壮的体液免疫反应。有必要把CD4结合起来⁺T细胞抗原表位来构建一个表位肽疫苗为了产生更好的保护t . spiralis感染。类似的研究还表明,强有力的CD4感染性疾病⁺T细胞表位疫苗是一个关键的组件来引起强大的免疫反应(73年,74年]。作为一种多价疫苗抗原肽不仅能更好的覆盖自然病原体抗原多样性的目标病原体的几个生命阶段,甚至可能还更好的匹配宿主免疫系统的遗传变异性(32),因此,它是一种很有前途的战略发展疫苗多细胞寄生虫感染等t . spiralis。在未来的研究中,包括保护性抗原表位(T和B细胞抗原表位)的地图结构将是一个可行的方法来提高保护。

缩写

ES:	Excretory-secretory
GC:	生发中心
高效液相色谱法:	高效液相色谱法
ILN:	腹股沟淋巴结
液化石油气:	幼虫每克
马伯:	单克隆抗体
地图:	多个抗原肽
MHC:	主要组织相容性复合体
ML:	肌幼虫
NK:	自然杀伤细胞
10月:	最佳切削温度
Pmy:	Paramyosin
机构:	花生凝集素
Tfh细胞:	T辅助滤泡细胞
总和生育率细胞:	卵泡监管T细胞
三甲:	Tetramethylbenzidine
Treg细胞:	调节性T细胞
Ts-Pmy:	Paramyosin的旋毛虫

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以在这篇文章中,或从作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

元古设计并进行实验。Ximeng太阳和晶晶黄进行了动物实验。手稿是由元古和本·詹。新平朱参加了研究设计。所有作者阅读和批准的最终版本。

确认

本研究进行金融援助从中国的国家自然科学基金(国家自然科学基金委,81572015)。

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