免疫球蛋白和免疫球蛋白联合应用可减轻比格犬的过敏反应

抽象

背景。我们之前报道过在BALB/c小鼠中注射同源(小鼠)多克隆抗独特型免疫球蛋白(Ig)和免疫球蛋白后，血清中ova特异性IgE水平和淋巴细胞来源的IL-4(过敏性免疫的标称标记物)降低。我们预测这可能推广到其他种和利用异源混合Igs。在小鼠中，研究人员使用OVA致敏法对这一结果进行了评估，小鼠中有人类Igs作为抗idiotype Ig和免疫Ig的来源，也有花生黄油诱发过敏反应的犬。方法。八周龄的BALB / c小鼠接受OVA免疫和从任一同源的（小鼠）免疫球蛋白或抗独特型免疫球蛋白的5次每周注射或异源（人）的来源。五个月大的比格犬接受每周局部曝光（腹部），花生酱和治疗汇集狗Ig和犬免疫抗狂犬病免疫球蛋白，或人类IMIG和人抗四环素的组合。All mice/dogs thereafter received a final allergen challenge, and serum IgG, IgE, and allergen-induced IL-2/IL-4 and IL-31 production in 72 hr cultures was measured.结果。在OVA诱导的过敏（IgE的特异性Ig和OVA诱导的IL-4）的小鼠衰减使用小鼠和人Ig混合物看出，而不对OVA血清IgG或OVA诱导的IL-2的效果。Attenuation of concanavalin A- (ConA-) induced IL-4 : IL-2 production and of peanut butter-induced IL-4 and IL-31 was seen in dogs receiving combinations of both heterologous and homologous immune Igs and anti-idiotype Igs, with no decline in IL-2 production. Allergen-specific IgE/IgG was not detectable in dog serum, but there was a trend to lower total serum IgE levels (and decreased IgE : IgG ratios).结论。多克隆免疫球蛋白和免疫球蛋白的同源和异源组合可减轻小鼠和犬的过敏反应。这一治疗方案代表了一种新的方法，可适用于过敏脱敏在兽医和人类使用。

1.介绍

变应性鼻炎、哮喘和特应性湿疹是慢性疾病最常见的原因，综合患病率为10-20% [1-3]。所有这些疾病患病率不断增加，具有相当大的负担，医疗总费用。虽然开发过敏反应的倾向是终生的，随着时间的推移疾病变化的实际表现。举个例子，孩子往往发展湿疹的早期，其次是过敏性鼻炎和哮喘。生活的所有过敏性疾病影响质量，在更极端的情况下，发病率和死亡率甚至。

目前，这些疾病的治疗遵循几项主要指导原则[1]，包括避免变应原，药物治疗（包括口服和局部有效的抗炎药物（类固醇），抗组胺剂，并且在严重的情况下有过敏反应，肾上腺素），最后，在变应原是可识别的，脱敏疗法[4]。后者使用有控制的暴露于不断增加剂量的纯化过敏原来改变身体对过敏原暴露的反应。一般来说，脱敏治疗是长期的，通常仍然与传统的缓解过敏的药物。开发新疗法的需求仍未得到满足。

考虑到从小鼠到人的过敏研究外推[五]，出现了过敏性反应的其他动物物种的分析越来越感兴趣。人类和他们最重要的家畜，即，猫狗，也有类似的IgE受体剧目和表达模式，与已知牵连基本类似的细胞类型的触发和/或过敏性反应，包括肥大细胞，嗜酸性粒细胞调控，和调节性T细胞。这些动物都因此受到青睐临床前研究报告。

皮肤、呼吸道和食物过敏在狗中并不少见，其免疫机制更像人类而不是啮齿类动物[五，6]，使他们学习青睐的品种[7-11]。尘螨过敏原被认为与犬类过敏反应高度相关[12，尽管在一些没有临床过敏症状的狗身上也检测到了皮肤反应性和尘螨特异性血清IgE，这表明敏化不一定会引起临床显著的反应性[13]。狗狗因对贮存螨过敏而患上特应性皮炎[14]和植物来源的变应原[15，以及跳蚤过敏原[16]用时少所以其他昆虫和甚至模具[17]。在所有病例中，IgE对几种确定的蛋白过敏原的反应都已被记录在案。IL-31的诱导是狗发生特应性皮炎的重要因素[18]。

我们报道了多克隆抗独特型抗体与多克隆免疫抗体联合注射用于重置啮齿动物的免疫调节网络[19]。该治疗调节了许多免疫反应，在炎性结肠炎中降低了炎性细胞因子，在移植模型中降低了植皮排斥反应，在啮齿动物过敏模型中(对卵白蛋白(OVA))降低了IgE和IL-4的敏化。所见抗原特异性调控不依赖于制备多克隆免疫球蛋白的特异性抗原。导致这些效应的一个机制涉及调节T细胞网络的干扰，这与支持treg在控制过敏反应中发挥作用的其他数据一致[20.]。我们已经使用了前面描述的比格尔模型[7评估同种抗体的混合物(混合的犬Ig作为抗独特型的来源;犬狂犬病免疫球蛋白作为免疫球蛋白的来源可减轻犬的过敏反应。本模型中使用花生酱膏引起血清IgE增强，当动物口服刺激后，特应性犬出现瘙痒性皮炎、嗜酸性皮炎和皮肤IgE阳性细胞[7]。我们提出的治疗方案是否用来衰减过敏反应小鼠降低过敏原诱导的IL-4和IL-31的生产致敏狗，而不减少在相同的动物中IL-2（非特应）响应。我们还探讨了是否异种血清免疫球蛋白混合物（汇集多克隆人免疫球蛋白和汇集多克隆人抗破伤风免疫球蛋白），会导致类似过敏的脱敏。

2.材料和方法

2.1。小鼠的初步研究

2.1.1。Mice与道德检讨

所有的小鼠在与JAX创始人股票CEDARLANE实验室培育。所有研究由当地机构审查委员会批准，由加拿大动物保护协会的认证。动物在整个研究SPF条件下维持。

BALB / c小鼠的免疫接种产生IgE抗OVA被别处描述[19]。每组8只小鼠接受10 μ克OVA在明矾乳化在第0天和第10天的一个对照组接受没有OVA免疫。All but one OVA-immunized group and the no OVA control received ongoing exposure to egg white solution in the drinking water for 10 d until sacrifice—the other control group received OVA immunization only (no EWS). Beginning on day 7, groups of mice given OVA and EWS received 5 weekly 10 μ的克肌内（IM）注射汇集多克隆BL / 6的抗C3H免疫球蛋白，多克隆C3H防反C3H IG（C3H抗BL / 6 BL / 6吸收：抗独特型免疫球蛋白），或这些的组合latter 2 Ig preparations (estimated ~0.5 mg/kg/dose). At 42 d, all mice received a booster injection of OVA in alum, with sacrifice 7 d later. In a separate study, mice received OVA stimulation in the same fashion, but the Ig preparations used for treatment were heterologous in nature (pooled human IVIG, given intramuscularly, hence IMIG) and pooled human anti-Tet immune Ig (both purchased from Grifols, USA). In trial studies, we have found that optimal dosing for this heterologous Ig used as anti-idiotype (IMIG) was ~3x higher than the purified mouse polyclonal C3H anti-anti-C3H Ig, and accordingly, IMIG was used at a dose of ~1.5 mg/kg/dose. It should be noted that in separate studies (not shown), we have assessed different routes of delivery of immunomodulatory Igs, including intravenous (iv), intraperitoneal (ip), and subcutaneous (sq), without significant variation in efficacy, although anti-idiotype and immune Igs must be given by separate routes for optimal effects.

小鼠在牺牲时通过心脏穿刺获得血清[19]。同时，单个动物的单细胞脾细胞制剂在洗涤后重悬( min在4℃)与10%胎牛血清(RPMI)₁₀)。 单个动物的脾细胞在2ml RPMI中被重复培养₁₀with 0.1 mg/ml OVA for 72 hr, and culture supernatants assayed by ELISA for IL-2 and IL-4 production.

采用ELISA法测定所有血清样品中OVA特异性IgE或IgG，使用100ng /well OVA板，用HRP抗小鼠IgE或HRP抗IgG检测，然后选用合适的底物。

2.2。小狗

比格犬，在使用的起始年龄5月，是由保健研究（科罗拉多州Fort Collins）购买并获得批准兽医服务安装在他们的工厂，在监督下，并按照注册的动物协议委员会。动物喂养批准的狗粮自由采食，每天锻炼。3次/周权重紧随其后，每周兽医检查。狗均在研究结束时发布的宠物伴侣。有两个质量预/后处理任何在研究中使用的狗的组没有显著差异。

2.2.1。注射用Ig制剂

汇集人类IVIG和抗四环素免疫球蛋白是从GRIFOLS，USA购买。合并的小猎犬血清购自BioIVT（韦斯特伯里，NY）购买，和Ig的分离下面的硫酸铵沉淀。Polyclonal dog rabies immune Ig was pooled from the serum (3 ml/animal) obtained, with the owner’s consent, from 12 outbred dogs, 8-24 months of age, boosted with rabies vaccine 4 weeks before.

组5小猎犬狗收到我臀部注射0.5毫升无菌PBS 12毫克剂量的汇集多克隆搞笑(人类IMIG-group狗IMIG-group 2或3)和4毫克IM相反的肢体0.5毫升无菌PBS的多克隆免疫搞笑(人类anti-Tet-group狗antirabies-group 2或3)。控制(组1)收到只有狗狗IMIG (Ig总使用16毫克剂量)。每周注射5周，每2周注射3次。从注射的第一天开始，每周在动物腹部涂抹15克左右的花生酱。在涂上花生酱后，给狗狗戴上项圈6-8小时，以防止狗狗把花生酱弄掉。最后一次IM注射5天后，所有动物接受花生黄油(~15克)口腔刺激。口腔挑战后，连续3天每天拍摄腹部照片。在口服刺激后3天，研究开始时采集肝素化血液样本(4 ml/狗)，在室温下空运(FEDEX)到加拿大安大略省Cedarlane Labs进行分析。在收集的24小时内，所有的样本都被接收和收集用于血清/PBMCs培养。所有被照料的个体都不知道哪一种治疗包含哪一种狗。在研究过程中，3只狗(每组1只)在不同时间在注射部位出现轻微皮肤刺激。 In each case, the dogs were monitored by a CARE veterinarian, and the irritation resolved without treatment within 7-10 days, with no recurrence.

2.3。犬血清IgG和IgE及IL-4, IL-2和IL-31细胞因子测定

PBL harvested in heparinized tubes was diluted 1 : 1 with PBS, layered over 4 ml Ficoll/Hypaque, and centrifuged for 20 min at 1600 rpm at room temperature (rt). The diluted serum (1 : 1) overlaying the cell interface was collected with a Pasteur pipette, and the cells (PBMCs) were diluted into 10 ml RPMI with 5% fetal calf serum+5% dog serum (both sera heat inactivated 30 min at 56°C: hereafter RPMI_血清)。将样品在1600 rpm下离心10 min，将细胞颗粒重悬于2ml RPMI中_血清，用RPMI稀释细胞_血清集中到 /毫升。血清标本保存在-80℃，用于随后的Ig分析(ELISA)。 ⁶在1.5 ml RPMI中复制PBMCs_血清与任一5 24孔培养板 μ克/毫升的ConA（时间零和研究结束时）或用20 μl of DMSO extract of peanut butter (1 gm in 10 ml DMSO: final concentration in culture ~2 mg/ml); control samples were incubated with 1.5 ml RPMI_血清和20 μl只有DMS。Supernatants were harvested from culture at 72 hr for IL-2/IL-4 detection by ELISA.

在所有血清IgG和IgE的浓度通过ELISA确定如下。山羊抗犬IgG是来自Thermo Scientific的，费舍尔，加拿大（目录＃18763）购买。山羊抗狗IgE的是来自Bio-Rad公司，加拿大（猫＃AHP946）。从R＆d系统加拿大获得驴抗山羊HRP。高结合ELISA板从SARSTEDT（目录＃82.1581.200）和自Thermo Scientific ELISA底物溶液（目录号34028）。100 μ将实验血清1∶100、1∶1000和1∶10000稀释，以100倍的倍数加入微量滴定板μl.所有的微量滴定板涂敷过夜(37℃)，以及重复的控制孔，孔中含有已知浓度的标准犬IgG或犬IgE(均购自R&D Systems)。随后，进行常规ELISA检测，步骤包括添加抗犬IgG或抗犬IgE，然后添加驴抗山羊HRP，然后添加底物，最终在ELISA平板阅读器中读取。用纯化后的IgG和IgE标准曲线测定血清中IgG和IgE水平。

IL-2和IL-4的水平ConA活化或使用由R＆d提供商业试剂盒测定花生酱刺激的PBMC（搭档设IL-2：目录号1815;朵集IL-4：目录号DY754），以及辅助试剂盒（R＆d目录号DY 008）。IL-31与使用试剂/标准市售试剂盒同样地测定，从NeoScientific（目录号C10041）。

2.4。统计数据

所有的小鼠实验数据报道如下相加超过至少两项研究，在所有组的所有实验最少16只小鼠。一般情况下，用于与多个组的研究中，首先应用于方差（MANOVA）测试的多变量分析，以评估组之间的任何差异显著，并且随后，在这里所指出的，成对 -检验用于各个组比较与记录的控制。

狗的研究使用3组描述。5只动物/组被随机分配到不同的处理。组间比较采用方差分析。

3.结果

3.1。通过联合使用抗idiotype和免疫球蛋白(免疫球蛋白)，即使使用异源猪免疫球蛋白(免疫球蛋白)，在ova引物小鼠中，可减弱ova特异性IgE，而不是IgG

我们的第一项研究重复了之前报道的结果[19]。BALB / c小鼠在用明矾OVA免疫和在所述饮用供应为持久过敏原暴露的源给定的EWS。小鼠组还接受抗独特型和/或免疫Igs的5次每周肌肉注射如在材料和方法来表示。Following a final boost with OVA after these 5 Ig injections, mice were sacrificed 7 d after OVA, and serum IgG/IgE to OVA was detected by ELISA, with IL-2 and IL-4 levels detected at 72 hr from OVA-stimulated splenocytes. Data pooled from two such studies, using 8 mice/group, are shown in Figures1和2。

图的比较图1（a）和图1（b）结果表明，与单纯OVA免疫的小鼠相比，暴露于EWS的小鼠IgG和IgE反应更明显。单独暴露于EWS(未进行OVA免疫)的小鼠产生很少的OVA特异性Ig。联合Ig制剂处理小鼠，而不单独使用任何一种Ig制剂，导致小鼠IgE反应减弱(图)图1（a）），但不是IgG应答（图图1（b）)。The effect produced by the combined Ig preparations is emphasized by comparison of the OVA-specific IgE : IgG ratios in all groups (Figure图1（c））-attenuation只有组接受联合治疗的Ig中发生。

ova诱导IL-4和IL-2的产生与各组IgE/IgG水平相似。联合Ig制剂的处理导致了OVA刺激后IL-4水平的降低(图)图2（a）），而不是IL-2水平（图2 (b)），an effect emphasized by assessment of IL-4 : IL-2 ratios in these groups (Figure2 (c))。

我们曾预测，在拥有共同祖先免疫系统的脊椎动物中，即使是异源Igs(免疫+抗idiotype)也可能产生与同源Igs混合相同的效果[19，21，22]。因此，经ova免疫的小鼠接受多克隆免疫人Ig(抗tet Ig)和/或多克隆人抗idiotype Ig(使用IVIG作为来源[22，23由于分娩是肌肉注射的，因此这被称为IMIG)。数据的数据3和4从2个这样的研究汇集。

图的比较1-4显示，使用免疫球蛋白和抗独特型免疫球蛋白的同源性（小鼠）的组合观察到的效应，使用异源的（人类）的试剂作为抗体源重现。

3.2。免疫Ig和抗idiotype Ig联合应用对花生黄油致敏的影响

Groups of 5/group 8 kg Beagle dogs receiving topical exposure to peanut butter were given 5 weekly injections of dog immunoglobulins (pooled IMIG and antirabies immune Ig) or human immunoglobulins (pooled IMIG or anti-Tet immune Ig) as described in Materials and Methods. After one final oral challenge with peanut butter, serum and PBMCs were harvested and total dog serum IgE and IgG levels were determined by ELISA (Figure五) -由于技术原因，我们无法检测出花生酱中狗特有的IgE或IgG。此外，我们测量了cona诱导的IL-2和IL-4水平的PBMC培养的预处理和后处理犬样本刺激(见材料和方法)μg / ml ConA(图6)。Peanut butter-induced IL-2, IL-4, and IL-31 levels were measurable only on posttreatment dog samples, using PBMCs stimulated with 2 mg/ml (estimated) DMSO peanut butter extract.

在图7，这些样品仅用DMSO培养基培养后，未见IL-2/IL-4/IL-31产生。

首先，有治疗（图后的总体IgE或IgG水平没有显著差异在任何组/前图5（a）-5 (d))。犬鼠和人Igs组合处理的犬在花生酱致敏后IgG与IgE比值呈上升趋势，这在人Igs处理组中达到显著水平(图)5 (e))，意味着该组IgE水平(相对于IgG)相对下降。我们怀疑纯粹是出于技术上的原因，我们无法在致敏后检测出任何犬类特异性IgE或IgG水平。通过分析不同组对ConA反应的IL-2和IL-4的释放情况，可以看出联合注射Ig组的过敏反应性普遍下降。不同组治疗前后IL-2产量无显著差异，延长接触花生酱时间后各组IL-2产量普遍呈上升趋势(图)6 (b)与图6(一)），有一个趋势下降IL-4生产具有组合狗或人Igs的处理后（图图6（d）），再次达到与人Ig治疗组的意义。Comparison of IL-2 : IL-4 ratios in all groups before/after treatment (Figure6（e）中)证实在用狗或人Igs治疗的致敏组中IL-4的产生相对减少。最后，通过对致敏犬中由过敏原引起的IL-2、IL-4和IL-31产生情况的分析，我们发现，仅在接受犬或人Igs治疗的犬中，IL-4/IL-31产生情况(而非IL-2水平)存在显著差异(图)图7（a）），which again translated to a highly significant increase in IL-2 : IL-4 and IL-2 : IL-31 ratios in the same groups (Figure图7（b）)。

4.讨论

Exploration of novel therapies for treatment of allergic diseases has highlighted measures which decrease IgE levels and target cytokines (e.g., IL-4, IL-5, and IL-31) thought to be implicated in control of those levels and other cell populations (eosinophils/basophils) implicated in allergic disease [18，24-三十]。We reported on the use of a novel therapy aimed at manipulating self-reactive immune regulatory networks through deliberate perturbation of idiotype : anti-idiotype interactions, as a potential mechanism to attenuate several pathological immune reactions in rodents, including allergic sensitization to ovalbumin [19]。到目前为止，还没有对这些治疗方法在大型动物或人类身上的效果进行过调查。

我们假设的鼠标过敏性反应，以卵清蛋白的衰减在与免疫球蛋白和抗抗免疫球蛋白自我（图重复注射1和2）中的溶液中最好由两个B细胞和复位介导的效果来理解T调节（Treg细胞）在小鼠细胞免疫网络接收联合免疫Ig和抗独特型免疫球蛋白[19，22]。我们进一步表明，在啮齿类动物中，这种治疗后过敏反应减弱的机制主要涉及免疫Ig和抗idiotype Ig组合诱导的Treg活性增强[22，31]。我们曾预测，在拥有共同祖先免疫系统的脊椎动物中，即使是异源Igs(免疫+抗idiotype)也会产生同样的效果[21，22]。在使用卵白蛋白致敏的BALB/c小鼠模型中，对这一假设进行了初步检验，结果显示，在接受商业免疫Ig和人类来源的抗idiotype Ig的小鼠中，过敏反应减弱，见图3和4。这些重要的观察结果证明了在患有特应性皮炎(犬中最常见的过敏性皮肤病)的犬模型(比格犬)上进行的试验性临床前试验是正确的[五-10]。

狗只对花生酱过敏[7] showed evidence for a generalized relative decrease in serum IgE : IgG levels following combined treatment with the two Ig preparations, along with a similar attenuation of the IL-4 : IL-2 ratio from ConA-stimulated PBMCs (Figures五和6)。更显著的是，在处理后的动物中，由过敏原引起的IL-4和IL-31的产生以及IL-4: IL-2和IL-31: IL-2的水平下降(图)7)。考虑到有证据表明IL-31是与过敏犬瘙痒有关的关键细胞因子，且指向IL-31的单抗已获准用于治疗过敏性皮炎，这种治疗后IL-31产生的衰减特别有趣[18]，而抗IL-31免疫接种也已提出在这样的动物的新型疗法[三十]。出人意料的是，我们看到了IL-4的衰减效应/ IL-31生产中大多采用人体免疫力的组合免疫球蛋白和抗独特型免疫球蛋白显着（商用抗四环素和IMIG），而不是（狗试剂的组合抗狂犬病IgG抗体并汇集IMIG）。我们怀疑这可能只是反映了一个未开发的剂量 - 效应关系，这已经是正在调查中。这是要注意重要的是，我们无法检测到任何过敏原特异性IgE或IgG花生酱致敏犬，虽然这种故障假设是更多的技术比实际，对于特别提供的证据过敏原诱发的IL-2和IL-4在相同的动物（图7)。我们正在评估用纯化过敏原(尘螨)治疗的狗的反应，以进一步澄清这一问题。我们的数据与以下观点一致，即所使用的治疗减弱过敏原引起的IL-4/IL-31反应有助于上述效果，这在其他地方已被提出[18，19，26，28，三十]。

综上所述，我们扩展了之前关于一种可以减弱啮齿动物过敏免疫的新疗法的研究，证明同样的方法在抑制大型动物(狗)的这种免疫上是有效的，这一结果对兽医界具有重要意义。

数据可用性

数据和材料（如果有的话）包括在本研究将免费提供。

伦理审批

如在材料和方法记录了当地动物保护委员会的批准后，所有小鼠和狗的研究进行。

的利益冲突

摹霍夫曼和RM Gorczynski宣布购买在NI公司摹霍夫曼股是NI公司牛逼马克布勒的研究顾问委员会的成员，没有竞争的利益。作者都不是NI公司的员工支付的，也没有人收到本研究中从事工作的报酬。

作者的贡献

RMG设计并进行了实验论文，起草的手稿的最初和最终的版本。GWH协助实验设计和数据分析。TM协助在小鼠和数据采集/分析所有的研究。所有作者都念稿子，完全熟悉下面的数据，并同意在其目前的形式发布。

致谢

作者和NI承认莫约威廉姆斯和阿斯马汉哈达德在CEDARLANE实验室附加的技术援助，以ELISA研究报告和克里斯托弗Gorczynski（ACCESSiFLY）进行数据分析，管理层在CEDARLANE（埃迪·约翰逊和约翰课程）在整个的支持实现这一研究，并CARE（科罗拉多州Fort Collins）的执行所有描述的狗研究的援助。所有的研究费用，耗材，试剂，动物和实验室管理费用是由网络公司免疫（NI公司，BC，加拿大）提供资金。

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