文摘
有人提议,突变型p53与肺癌的复发。最近,一个小的细胞不对称和对称的自我更新潜能已被确定在肺癌,被称为癌症干细胞样细胞(二者)和猜测是癌症化疗后复发的原因。在这项研究中,我们使用不同TP53背景的肺癌细胞系阐明潜在作用的突变型p53在调节肺CSC自我更新和肺癌复发。有顺铂耐药性不同TP53背景的肺癌细胞生成在体外通过公开A549, H460 H661肺癌细胞系反复顺铂。CD44+/ CD90+在上面有顺铂耐药性肺癌干细胞样细胞识别(称为有顺铂耐药性肺癌干细胞样细胞,(Cr-LCSCs))和PKH26染色染料用于定义自我更新模式。对称分裂的比例明显高于在Cr-LCSCs突变(mt)与野生型p53与Cr-LCSCs (wt) p53,并迫使太p53的表达促进了对称Cr-LCSCs分工。此外,减少巨噬细胞堆积在皮下植入异种移植组成的mt p53 Cr-LCSCs与wt p53 Cr-LCSCs相比。这些结果表明太p53加速肺癌的复发可能通过调节自我更新Cr-LCSCs动力学以及巨噬细胞的招募。
1。介绍
肺是一个屏障器官的第一道防御各种威胁从病原体的致癌物质,易患癌症。肺癌已经成为癌症相关死亡的主要原因在男性和女性1]。靶向药物开发治疗肺癌患者窝藏EGFR突变(2)或针对有eml4 - alk放大3]。免疫抑制剂检查站(艾多酷),即程序性死亡1 (PD-1)抗体4),经FDA批准作为一线治疗方法。然而,传统cisplatin-based nonresectable肺癌化疗仍然是一线治疗方案没有可操作的突变或得分比例PD-l肿瘤不到50%(支持)。cisplatin-based化疗策略被应用于先进的希望或IV肿瘤患者和手术后辅助治疗在早期阶段。然而,NSCLC的总体5年存活率是40%以下(5),这主要是归功于肺癌化疗后的复发。
它提出了一小部分茎状的细胞,称为起始细胞(CIS)或癌症干细胞样细胞(二者),在肿瘤负责启动,发展,最重要的是,癌症的复发(6]。二者都牵连到癌症的复发射流化疗药物的能力通过一些药物流出的表达和DNA修复蛋白不消除化疗后(7]。除此之外,二者是分裂的对称和非对称结构类似于正常的同行,和传播的方式取决于干细胞池储备的要求,组织修复和遗传背景。对称分裂产生完全相同的子细胞,提供所需要的干细胞池快速组织修复,和不对称分裂产生一个未分化和一个分化为保留干细胞池(8]。的再生肿瘤化疗后的质量可能受到之间的平衡对称和非对称细胞分裂,和因素,确定这种平衡可能导致二者的异常扩张和复发的癌症。
野生型p53,肿瘤抑制基因TP53,翻译的功能,以防止DNA损伤。p53基因突变导致野生型p53的障碍。TP53突变已确定在不同癌症类型,包括肺癌。已经观察到,太p53与不良预后相关,在切除肺癌的复发和cisplatin-treated肺癌9,10]。理解的角色太p53在肺癌的复发,我们调查的参与太p53在调节Cr-LCSC自我更新及其与宿主免疫系统的相互作用,特别是巨噬细胞的先天免疫。因此,我们旨在实现以下目标:(1)隔离Cr-LCSCs从3不同p53背景的肺癌细胞系;(2)调查的参与太p53在调节Cr-LCSC自我更新模式;(3)调查太p53 Cr-LCSCs的致瘤性的影响;和(4)比较的巨噬细胞浸润密度皮下植入wt和p53 Cr-LCSC异种移植。结果提供了新的见解和目标的预防肺癌化疗后复发。
2。材料和方法
2.1。细胞系和试剂
A549, H460 H661, H1299肺癌细胞系得到来自美国类型文化集合(写明ATCC)(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和rpmi - 1640培养基培养(美国纽约Gibco,大岛)补充10%胎牛血清(美国UT Hyclone、南洛根)。顺铂,4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和PKH-26红色荧光细胞链接器套件从Sigma-Aldrich化学公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。FITC-conjugated CD44抗体,APC-conjugated CD90抗体和相应的同形像控制从BD购买生物科学(美国加利福尼亚州圣何塞)。反CD44、CD90、p53主要抗体买来Abcam(美国Cambridge, MA)。CCR2抗体从研发(明尼阿波利斯,美国);CD68抗体和Lipofectamine 2000试剂购自英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。二次抗体FITC-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白和Cy3-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白是购自杰克逊ImmunoResearch(西树林,宾夕法尼亚州,美国)。从Bert Vogelstein pCMV-Neo-Bam p53 R249S是一份礼物(Addgene质粒# 16438),和pCMV-Neo-Bam p53 wt (wt p53)的礼物Bert Vogelstein (Addgene质粒# 16434)。
2.2。代有顺铂耐药性肺癌细胞系
肺癌A549, H460 H661, H1299细胞暴露在顺铂的IC50值72 h。中被删除,在正常培养基培养细胞,直到细胞完全恢复。每2 - 3轮的治疗,为每个细胞株IC50浓度被重新评估。有顺铂耐药性肺癌细胞系建立了稳定的IC50值时。
2.3。隔离Cr-LCSCs
CD44+/ CD90+细胞A549 / Cr隔绝,H460 / Cr, H661 / Cr, H1299细胞/ Cr使用MoFlo XDP流式细胞分析仪沾FITC-conjugated CD44抗体和APC-conjugated CD90抗体。被封闭的细胞碎片和死细胞对比基于细胞的大小和复杂性。
2.4。免疫荧光染色
A549 / Cr, H460 / Cr, H661 / Cr盖玻片上培养的细胞,在4%多聚甲醛固定,然后用反CD44分子标记CD90一夜之间在4°C。样本与孵化FITC-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白和Cy3-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白g(1: 200稀释)1 h在37°C。巨噬细胞在肿瘤染色,冷冻组织切成10μ米厚的部分,固定在冷丙酮10分钟,并阻止10%正常山羊血清。肿瘤部分与主要孵化anti-CD68抗体(1:200稀释)一夜之间在一个潮湿的室在4°C,然后孵化与FITC-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体1 h在37°。核与DAPI counter-stained。共焦显微镜获得的图像。
2.5。免疫组织化学(包含IHC)分析
formalin-fixed,石蜡包埋组织异种移植是切成8μ米厚的部分。幻灯片是脱蜡,放在微波炉抗原检索95 30分钟,然后孵化与CCR2抗体(1:200稀释),和颜色是由涂的方法。显微图像获得的相衬显微镜(BX41TF、奥林巴斯、东京、日本)。CellSens标准1.13(奥林巴斯)软件被用来捕获的图像。
2.6。转染wt p53和太p53 H1299细胞/ Cr
4μ克的DNA控制pCMV-Neo-Bam向量,pCMV-Neo-Bam p53 R249S向量,和pCMV-Neo-Bam p53 wt向量在Opti-MEM介质与Lipofectamine 2000混合试剂,在室温下培养5分钟,然后加入H1299细胞/ Cr在70%汇合的,培养48 h。300年μ克/毫升的G418被用来选择稳定转染克隆。
2.7。PKH-26染色
PKH-26细胞膜荧光染料和分裂的子细胞。PKH-26的子细胞的分布情况进行跟踪,并Cicalese博士率领等人提供的数学模型被用来定义业务模式(11]。PKH-26染料稀释是表示和孵化PBS-washed细胞在室温下为5分钟。染色反应停止通过添加2毫升血清。这些细胞被洗了,离心去除游离染料过剩,resuspended在无血清DMEM培养基补充20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, 4μg / ml胰岛素。单个细胞是通过串行在96孔板稀释,标记,荧光显微镜下观察。共焦显微镜的图像被收购了。
2.8。球体形成分析
评估球体形成能力,在无血清DMEM培养基培养Cr-LCSCs是补充20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, 4μg / ml胰岛素为3周。球面形成能力评估的外观和球面机构的数量和规模和绘制直方图。
2.9。肿瘤异种移植于裸小鼠
BALB / c裸小鼠注射用于建立肿瘤异种移植的200μl细胞悬液 H1299 / Cr-mt-p53和H1299 / Cr-wt-p53细胞皮下注射。肿瘤体积(毫米3)每周由以下公式计算: 。在4周,小鼠牺牲,肿瘤被删除,以尸体剖检。
2.10。统计分析
这样的结果 (SD)。与双尾未配对学生的差异进行了分析 - - - - - -试验2组或三组之间的单向方差分析。 定义具有统计学意义。数据分析使用SPSS v16.0软件(SPSS Inc .)、芝加哥,美国),和图表进行使用GraphPad棱镜软件(La Jolla、钙、美国)。
3所示。结果
3.1。隔离有顺铂耐药性的Cr-LCSCs Nonsmall细胞肺癌细胞系
化疗后复发的概括LCSCs, A549 (wt P53) H460 (wt P53)和H661(太P53)人类肺癌细胞系与顺铂治疗浓度从0.1μM - 100μ米来确定初始治疗的IC50,正如前面报道(12]。用顺铂治疗细胞然后根据72 h的IC50,剩下的细胞培养rpmi - 1640年完全培养基,直到完全康复(图。S1)。与治疗大约20细胞通道后,细胞开始出现稳定的IC50值,和细胞经过20通道被定义为有顺铂耐药性(Cr)细胞并用于随后的调查(图。S2)[12]。
CD44 (13]和CD90 [14)LCSC表面标记。我们分析CD44的表达和CD90 A549 / Cr, H460 / Cr, H661 / Cr细胞使用免疫荧光测定。CD44和CD90检测A549 / Cr, H460 / Cr, H661 / Cr细胞(图1(一))。CD44以来+/ CD90+被定义为LCSCs以前[90],我们发现CD44的比例+/ CD90+细胞A549 / Cr, H460 / Cr, H661 / Cr细胞。CD44+/ CD90+细胞被发现在A549 / Cr, H460 / Cr和H661 / Cr细胞,表明LCSCs富含顺铂治疗体外(图1 (b))。上述double-positive细胞群被指定为cisplatin-enriched LCSCs (Cr-LCSCs)。有趣的是,我们发现Cr-LCSCs太p53 H661 / Cr的比例明显高于与wt p53 A549 / Cr和H460 / Cr(图1 (b)和无花果。S3)。
(一)
(b)
3.2。A549 / Cr-LCSCs H460 / Cr-LCSCs, H661 / Cr-LCSCs表现出矛盾的自我更新属性和传播不同
进一步研究的内在区别Cr-LCSCs A549 / Cr、H460 / Cr和H661 / Cr细胞,这可能是由p53的地位,我们第一次孤立CD44+/ CD90+亚种群使用流式细胞仪(图2(一个)和无花果。S4)。总共 排序A549 / Cr-LCSCs H460 / Cr-LCSCs, H661 / Cr-LCSCs无血清培养系统24-well不依从盘子中补充EGF、bFGF和胰岛素。突变型P53 H661 / Cr-LCSCs形成球体在3天,和野生型P53 A549 / Cr-LCSC和H460 / Cr-LCSC球体出现文化(图10天后2 (b)),这表明Cr-LCSCs展出体外自我更新特征。3周后,我们发现H661 / Cr-LCSC球体的数量明显比A549 / Cr-LCSC和H460 / Cr-LCSC球体,显微镜下计数(图2 (c)),测量H661 / Cr-LCSC球体的大小比A549 / Cr-LCSC和H460 / Cr-LCSC球体(图2 (d))。染色后BrdU的球体,没有观察到显著差异的扩散wt p53 H460 / Cr-LCSC和太p53 H661 / Cr-LCSC球体(图2 (e))。结果表明,太p53影响Cr-LCSC传播通过机制而不是操纵扩散。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
干细胞的数量可以由对称和非对称有丝分裂细胞分裂之间的平衡。进一步调查的角色太p53 Cr-LCSCs分工模式,上述细胞研究使用PKH-26细胞染色,如前所述[11,12]。在这项研究中,我们发现的模式的细胞分裂A549 / Cr-LCSCs对称的56.3%,27.4%不对称,16.3%未定义(不能归类PKH-26染料使用Cicalese博士率领et al。)提供的一个数学模型。H460细胞分裂的/ Cr-LCSCs对称的48.2%,31.6%的不对称,20.2%的定义。模式的细胞分裂H661 / Cr-LCSCs对称的91.2%,3.5%不对称,5.3%未定义(图3)。这些结果与先前的研究一致表明,耐药非小细胞肺癌主要分为对称(12]。此外,这项研究表明,太p53H661 / Cr-LCSCs几乎只喜欢对称分裂与wt p53 A549 / Cr-LCSCs和H460 / Cr-LCSCs,提供一个合理的解释的自我更新速度较慢,A549 / Cr-LCSCs和H460 / Cr-LCSCs。
3.3。太p53提升Cr-LCSCs的对称的自我更新
进一步调查的角色太p53 Cr-LCSCs的自我更新,p53空H1299肺癌细胞系是顺铂处理以生成H1299 / Cr。我们转染H1299 / Cr与wt p53和mt p53质粒获得稳定转染细胞系,名叫H1299 / Cr-wt-p53和H1299 / Cr-mt-p53,分别。wt p53的程度和p53的超表达稳定克隆被免疫印迹(图验证4(一))。此外,我们孤立的CD44+/ CD90+从H1299细胞/ Cr-wt-p53和H1299 / Cr-mt-p53细胞和无血清培养系统中。我们彩色Cr-LCSC球体BrdU排除扩散的差异;正如所料,超表达wt p53或太p53没有影响的扩散Cr-LCSC球体(图4 (b))。然后我们研究了wt p53的超表达的影响或太p53 Cr-LCSC部门PKH-26染色。分工的LCSCs H1299 / Cr-wt-p53细胞32.4%是对称的,不对称的56.9%,和10.7%的定义,并从H1299 LCSCs分工的对称/ Cr-mt-p53细胞86.8%,6.3%不对称,6.9%未定义(图4 (c))。这些结果进一步证明了mt p53能够操纵Cr-LCSC部门向对称模式。
(一)
(b)
(c)
3.4。太p53 Cr-LCSCs显示皮下异种移植模型中增加致瘤性和抑制巨噬细胞的积累
我们检查了体内致瘤性的p53 Cr-LCSCs CD44和wt p53 Cr-LCSCs使用皮下注射+/ CD90+从H1299细胞隔离/ Cr-wt-p53和H1299 / Cr-mt-p53细胞。皮下肿瘤的生长监测和测量每个星期到第四个星期。增长率肿瘤来源于H1299 / Cr-mt-p53 LCSCs明显加速而H1299 / Cr-wt-p53 LCSCs(图5(一个))。最后四个星期,2 6小鼠注射H1299细胞/ Cr-wt-p53未能开发肿瘤虽然所有老鼠注射H1299 / Cr-mt-p53细胞发达。肿瘤的体积来自H1299 / Cr-mt-p53 LCSCs H1299 /价格相比明显大Cr-wt-p53 LCSCs(图5 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
进一步探索太p53 Cr-LCSCs致瘤性的增加在宿主免疫防御方面,我们专注于宿主免疫系统的巨噬细胞,因为无胸腺的裸小鼠不适合的调查获得免疫力。异种移植从H1299 / Cr-wt-p53和H1299 / Cr-mt-p53 LCSCs沾CD68巨噬细胞标记,和CD68下降+巨噬细胞在H1299 / Cr-mt-p53异种移植而H1299 / Cr-wt-p53异种移植(图5 (c))。CCR2提出了巨噬细胞在肿瘤部位,我们调查的表达CCR2在H1299 / Cr-wt-p53和H1299 / Cr-mt-p53 LCSC异种移植。我们发现CCR2表达下调H1299 / Cr-mt-p53 LCSC异种移植的价格相比H1299 / Cr-wt-p53 LCSC异种移植(图5 (d))。
4所示。讨论
铂类偶极子与非小细胞肺癌患者的化疗是标准的一线治疗没有可操作的“驱动基因”或PD-L1 。20 - 40%的专利倾向于6个月内复发,虽然与最初反应以铂为基础的化疗紧身上衣在肺癌15]。许多先前的研究已经提出,这可能是由于存在chemotherapy-resistant在化疗和干细胞的表型特征。证据表明,LCSCs负责肺癌复发,因为细胞毒性试剂消除大部分肿瘤细胞分化,而LCSCs生存和继续增殖(12]。从理论上讲,类似于正常成人干细胞,LCSCs预计将保持静止,应该有一个较慢的增长速度比肿瘤细胞分化。然而,证据表明,环境,信号通路,表观遗传变化保持LCSCs的分化和静止之间的平衡。我们建议LCSCs可能被激活化疗治疗期间,必须迅速应对扩大和肿瘤再生受损。巴尔(报告的使用方法16),我们丰富耐药肺癌细胞具有干细胞特性后~ 20段落使用顺铂在三个被指定为A549肺癌细胞系/ Cr, H460 / Cr, H661 / Cr细胞。CD44和已报告CD90 LCSCs标记,和CD44+/ CD90+LCSCs被隔绝A549 / Cr, H460 / Cr, H661 / Cr细胞。在这项研究中,我们调查了自我更新,致瘤性和免疫原性Cr-LCSCs和监管因素。
在组织修复过程中,采用对称分裂的干细胞产生更多的后代快速响应扩展和替换受损的细胞。肿瘤质量可以被认为是一个不正常的器官,二者可能应对损伤,如化疗和放疗造成的损失,扰乱了正常的平衡不对称分裂和对称分裂。是否Cr-LCSCs采用对称分裂或对称分裂化疗是未知的。在这项研究中,确定Cr-LCSCs孤立的自我更新模式,我们使用PKH-26 Cr-LCSCs标签的后代。对于对称分裂,PKH-26平均分配到两个子细胞,注定要具备干细胞分化或维护的同样的命运。不对称分裂的结果保留女儿PKH-26染料的干细胞,是相对静止而分化后代。结果表明,多数Cr-LCSCs孤立于肺癌细胞系进行了对称分裂,表明暴露在体外促进化疗LCSCs的对称的自我更新。化疗在CSC的体内影响自我更新也被报道在接受新辅助化疗的乳腺癌患者因为自我更新潜能形成mammospheres增强新辅助化疗后(17]。
TP53是一个肿瘤抑制基因的细胞命运决定强调或受损细胞诱导可逆细胞周期阻滞,DNA修复、细胞凋亡(18]。TP53基因突变频繁在非小细胞肺癌,突变导致错误的蛋白质合成或改变损害的dna结合域p53的肿瘤抑制功能(19]。临床数据描述p53突变确定与非小细胞肺癌患者的预后已经广泛报道(20.,21]。在I期NSCLC患者的死亡风险增加肿瘤p53基因突变与肿瘤p53 wt (22]。p53零突变也会导致糟糕的结果在早期非小细胞肺癌患者23]。更好的趋势在nsclc患者预后wt p53被认为与wt p53肿瘤抑制活动,而肿瘤太p53逃脱DNA damage-dependent细胞衰老和凋亡诱导化疗或放疗。最近,据报道,p53调节干细胞的自我更新模式(11]。太p53 Cr-LCSCs的自我更新的影响没有被调查。在这项研究中,我们报道了mt p53促进Cr-LCSCs对称细胞分裂,导致积累的可能性太p53 NSCLC肿瘤干细胞池的质量后顺铂治疗。
进一步阐明太p53的可能作用在肺癌的复发,我们比较的致瘤性太p53 Cr-LCSCs和wt p53 Cr-LCSCs体内。太p53 Cr-LCSCs更致瘤的肿瘤与wt p53 Cr-LCSCs相比,增加肿瘤生长速度和终点。单核吞噬细胞存在于肺的肺从最早的阶段发展到死亡和是最重要的先天免疫系统组件的肺抵御癌症。肿瘤浸润的白细胞(包括巨噬细胞)被认为是肿瘤本身的免疫反应的结果,具体地说,以后第一个先天免疫和特异性免疫识别肿瘤相关抗原(24]。CD68+巨噬细胞浸润在食管癌与更好的预后有关25]。然而,肿瘤相关巨噬细胞最近被认为促进肿瘤发生、生长和发展(26]。肿瘤相关巨噬细胞的作用在癌症仍然是有争议的27]。在这项研究中,我们探讨巨噬细胞的积累太p53 Cr-LCSC wt p53 Cr-LCSC异种移植。我们发现太p53抑制巨噬细胞在异种移植的积累CCR2表达水平下降。据报道,p53是一个压抑的表达抑制炎症反应的小鼠的炎症趋化因子受体CCR2 (28]。是否太p53在CCR2压制效应较强,需要进一步调查。中最重要的趋化因子受体CCR2在癌症招募巨噬细胞;CCR2基因缺失的结果在渗透小鼠巨噬细胞的异种移植(29日]。我们的研究结果表明,太p53抑制CCR2和导致减少巨噬细胞在异种移植和显示一个潜在的癌症细胞和巨噬细胞之间相互招聘调制p53体细胞突变的癌症。
总的来说,这项研究表明当前抗癌化疗失败的可能性消除耐LCSC克隆与对称细胞分裂模式可能与不良反应和肺癌复发有关。太p53激活进一步增加Cr-LCSC扩张通过促进对称的自我分裂和抑制巨噬细胞的积累,导致增加致瘤性。
数据可用性
辅助数据是可用的。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81201684)和自然科学基金的资助重庆(cstc2016jcyjA0578)。
补充材料
图S1 A549 /信息系统的形态学,H460 /信息系统和H661 /信息系统细胞。图S2:顺铂治疗体外的IC50。图S3: CD44的比例+/ CD90+细胞A549 /信息,H460 /信息系统和H661 /信息系统细胞。无花果。S4:流式细胞仪闸门Cr-LCSCs战略。图S5:流式细胞术分析CD44+/ CD90+第3代某人(球体)细胞A549 /信息系统(CD44+/ CD90+),H460 /信息系统(CD44+/ CD90+),H661 /信息系统(CD44+/ CD90+),H1299 /信息系统(CD44+/ CD90+)细胞。给出的数据 为一式三份。 ,相比于A549 /信息系统(CD44+/ CD90+);□ ,而H460 /信息系统(CD44+/ CD90+);△而H661 /信息系统(CD44+/ CD90+);◇而H1299 /信息系统(CD44+/ CD90+)。(补充材料)