小说Radotinib治疗实体肿瘤的应用通过自然杀手细胞的激活

文摘

Radotinib (Supect™)是开发治疗慢性粒细胞白血病(CML)作为bcr - abl1酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。伊马替尼等其他TKIs nilotinib,也为治疗CML的开发,和最近的研究增加对其他TKIs实体肿瘤的治疗效果。然而,radotinib对实体肿瘤的影响尚未研究。在这项研究中,radotinib杀CML细胞株K562直接;然而,radotinib没有增强NK细胞对K562细胞的细胞毒性。因为K562称为Fas-negative细胞系,我们调查是否radotinib可以调节细胞对各种Fas-expressing固体癌症细胞系细胞毒性。Radotinib大幅度增加的NK细胞对各种Fas-expressing固体肿瘤细胞细胞毒性,包括肺癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞。此外,效率radotinib-enhanced Fas siRNA-transfected细胞的细胞毒性较低比消极的控制,表明Fas信号可能参与radotinib-enhanced NK细胞的细胞毒性。这项研究提供了第一个证据,radotinib可以作为一个有效的和强大的治疗治疗实体肿瘤通过upregulation NK细胞的细胞毒性,这表明radotinib有间接杀死通过upregulation抗肿瘤机制先天免疫反应以及直接杀死对CML细胞活动。

1。介绍

Radotinib (Supect™;C₂₇H₂₁F₃N₈OHCl 4-methyl-N - [3 - (4-methyl-imidazol-1-yl) 5-trifluoromethyl-phenyl] 3 - (4-pyrazin-2-yl-pyrimidin-2-ylamino)苯甲酰胺盐酸盐)开发治疗慢性粒细胞白血病(CML)作为断点集群region-Abelson (bcr - abl) 1酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。Radotinib批准作为二线治疗CML在韩国1]。radotinib的结构非常类似于其他bcr - abl抑制剂,包括伊马替尼(一线治疗)和nilotinib(二线治疗)。

几项研究已经报道伊马替尼的影响和/或nilotinib自然杀伤(NK)细胞活性(2- - - - - -4]。伊马替尼特别在治疗浓度不影响干扰素(干扰素),γ生产、NK细胞的细胞毒性CML细胞线,K562。然而,高浓度的nilotinib抑制干扰素-γ生产,导致减少NK细胞活性(2]。Nilotinib CD56的诱导细胞死亡^明亮的CD16^{- - - - - -}NK细胞,知名cytokine-producing NK细胞的子集。这些结果表明,抑制干扰素-γ生产由nilotinib由于cytokine-producing NK细胞死亡(2]。此外,伊马替尼和nilotinib不调节颗粒的表达,如穿孔素(3]。其他研究已经表明,伊马替尼和nilotinib不影响激活或抑制NK细胞受体;然而,趋化因子受体CXCR4是增加了治疗伊马替尼或nilotinib,暗示TKIs的脱靶效应免疫细胞(4]。

NK细胞、CD56⁺CD3^{- - - - - -}血液中的细胞毒性淋巴细胞,发挥关键作用的先天免疫系统通过自发的消除癌细胞和病毒感染细胞。NK细胞的细胞溶解的活动是由Fas / Fas配体相互作用,颗粒胞外分泌,锁定细胞介导细胞毒性(5]。Fas的死亡受体胞浆内域包含一个守恒的死域。激活NK细胞表达Fas配体和识别Fas-expressing靶细胞通过Fas / Fas配位体的相互作用。这种交互导致激活半胱天冬酶的级联,最终在靶细胞凋亡机制6,7]。

尽管伊马替尼和nilotinib等其他TKIs不提高NK细胞活性,radotinib对NK细胞的细胞毒性的影响没有被调查。在这项研究中,我们将演示抗癌的效果通过upregulation radotinib NK细胞的细胞毒性与Fas-expressing癌细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和核转染

人类CML细胞株K562,人类肺癌细胞株A549和NCI-H460人类黑色素瘤细胞系A375 SK-MEL-5,和人类乳腺癌细胞株mda - mb - 231和MCF-7买来写明ATCC(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。K562细胞培养rpmi - 1640中(Gibco),和其他细胞培养在杜尔贝科鹰介质的修改。媒体都补充了2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升,10% heat-inactivated胎牛血清。细胞被保持在5%的股份有限公司₂孵化器在37°C。

在大约70% confluency A549细胞转染50 pmole Fas siRNA使用Lipofectamine RNAiMAX(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)制造商的指示。商用人类Fas核和消极控制核购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)。转染效率表面染色分析证实了使用FACSCalibur(美国BD生物科学,圣何塞,CA)使用藻红蛋白- (PE)共轭Fas抗体(BD生物科学)或PE-conjugated老鼠免疫球蛋白同形像控制。

2.2。人类外周血淋巴细胞和NK细胞的隔离

人类血液样本来自Inje大学釜山Paik医院(韩国)。所有研究机构审查委员会批准的使用人类受试者(Inje IRB / 1)。外周血单核细胞(PBMC)从血液通过密度梯度离心法分离Ficoll-Paque(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),然后外周血淋巴细胞人外周血单核细胞耗竭后收集。简而言之,PBMC在RPMI1640 resuspended中补充10%胎牛血清的边后卫,塑料培养皿中5%孵化有限公司₂孵化器在37°C的过夜。悬浮细胞包括收集人外周血。人类主要NK细胞分离使用mac从人外周血NK细胞隔离设备(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)按照制造商的建议。

2.3。细胞毒性试验

如前所述(执行一个细胞毒性试验8]。短暂的效应细胞,如分离人外周血或纯化NK细胞,治疗与radotinib表示浓度或重组人白介素- 2 (IL) (50 U /毫升)48 h。二乙酸靶细胞是沾carboxyfluorescein succinimidylester(美国分子探针Inc .)五分钟37°C。三个洗冷完全培养基后,标记靶细胞与效应细胞孵化。试验进行了一式三份的各种效应细胞靶细胞(E: T)比率。孵化后37°C公司5%₂2 h,分析了目标细胞溶菌作用7-aminoactinomycin D (7-AAD) (BD生物科学)染色使用FACSCalibur (BD生物科学)与细胞追求软件。

阻止Fas-Fas配体相互作用,约0.5 - 2μg(重组人可溶性Fas(研发系统)与休息或孵化radotinib-treated NK细胞在细胞毒性试验。预培养1 h后,细胞毒性试验进行如上所述,没有洗。

2.4。统计分析

分析了所有的值与一个未配对的学生 - - - - - -测试。统计分析使用GraphPad棱镜5(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。

3所示。结果与讨论

小说bcr - abl1 TKI Radotinib,是一种有效的治疗药物治疗CML [1]。bcr - abl1融合CML的主要发病机制,导致无法控制的扩散。因此,TKIs针对bcr - abl1已经开发成治疗CML,因为它们不受控制的增殖抑制。确认radotinib对CML细胞的影响,我们使用代表CML细胞系K562。细胞K562细胞的生存能力大大降低甚至在radotinib的最低浓度(12.5μ米),这表明radotinib杀死了K562细胞直接(图1(一))。据报道,另一个标准TKI,伊马替尼,抑制癌细胞扩散通过细胞周期的调控9]。因此,我们的数据表明,radotinib能够抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,抑制bcr - abl1以及伊马替尼。

(一)

(b)

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图1

Radotinib增强对A549细胞的人外周血细胞溶解的活动,但不是K562细胞。(一)CML细胞K562,处理各种radotinib 24 h浓度来确定直接radotinib对K562细胞死亡的影响。台盼蓝排斥试验进行计数活细胞。(b)人外周血分离得到健康的捐赠者和孵化0或100μM radotinib 48 h。2作为一个积极的控制。进行细胞毒性试验、K562或A549细胞被贴上carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE),然后作为靶细胞。Radotinib-stimulated人外周血与CFSE-labeled孵化2 h靶细胞(E: T:1)来衡量人外周血的溶细胞活性。与7-AAD孵化后,细胞被染色,FACSCalibur被用来分析CFSE和7-AAD double-positive靶细胞。数据报告 。未配对学生的所有值进行了分析 - - - - - -测试使用GraphPad棱镜5。和 。所有资料都是代表三个独立的实验。

确定radotinib杀死K562细胞的能力通过外周血淋巴细胞的溶细胞活性(人外周血),我们进行了细胞毒性试验使用radotinib-treated人外周血效应细胞和K562细胞作为靶细胞。尽管radotinib直接和有效地杀死了K562细胞,它没有加强对K562人外周血的溶细胞活性,而大大刺激的人外周血细胞毒性(图- 21 (b))。因为是Fas-negative细胞K562细胞(10- - - - - -12),我们假设radotinib可能调节细胞对某些类型的肿瘤细胞细胞毒性,如Fas-expressing细胞。确认的影响radotinib对Fas-expressing人外周血细胞的细胞毒性,我们确定A549细胞株的Fas表达。如图2 (b)A549细胞高表达了Fas受体。与这些差异Fas表达一致,radotinib大幅度增加的人外周血的溶细胞活性只有在A549细胞(图1 (b))提出一个新颖的治疗效果radotinib CML以外的实体瘤。

(一)

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(c)

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图2

Radotinib增强细胞溶解的NK细胞的活性对Fas-expressing A549细胞。(a)主要NK细胞分离得到健康的捐赠者执行NK细胞的细胞毒性试验。CD3的纯度^{- - - - - -}CD56⁺NK细胞是96.6%。(b)来确定radotinib对NK细胞的溶细胞活性的影响对A549细胞,这些细胞被处理各种radotinib浓度(0、12.5、25、50、100和200μ48 h M)和细胞毒性试验(E: T:1)。(c)来确定radotinib对NK细胞毒性的影响被Fas受体介导,Fas表达是暂时性的小干扰rna转染成A549细胞由Fas表达下调。confluency大约在70%,A549细胞孵化与50 pmole Fas-specific核或消极控制核使用Lipofectamine RNAiMAX。表面的表达Fas A549细胞被染色确定PE-conjugated Fas抗体(实线)。PE-conjugated老鼠免疫球蛋白抗体作为同形像控制(虚线)。(d)的影响radotinib NK细胞溶解的活动对Fas siRNA-transfected A549细胞是由细胞毒性试验。Radotinib-treated NK细胞被用作效应细胞,Fas siRNA-transfected A549细胞或控制细胞作为靶细胞(E: T:1)。所有值归一化相对于控制(radotinib 0μ米)。相对控制级别被设置为1。(e)来进一步证实Fas-Fas配体的参与互动radotinib-enhanced NK细胞毒性,重组人可溶性Fas NK细胞是用来阻止Fas配体。不同浓度的可溶性Fas和休息preincubated NK细胞或radotinib-treated NK细胞1 h,然后进行了细胞毒性试验(E: T:1)。所有值归一化相对于控制(radotinib 0μ米)。相对控制级别被设置为1。数据报告 。未配对学生的所有值进行了分析 - - - - - -测试使用GraphPad棱镜5。 , ,和 。所有资料都是代表三个独立的实验。

我们下一个孤立的人类主要从人外周血NK细胞的细胞溶解的活动是否介导了人外周血NK细胞的细胞毒性。纯化NK细胞( %,如图1(一))孵化与不同剂量(0、12.5、25、50、100和200μradotinib M),这并不影响NK细胞的可行性(数据没有显示)。NK细胞细胞毒性显著调节radotinib治疗。这显著增加细胞毒性radotinib治疗剂量依赖性(图2 (b))。确定Fas-FasL互动参与radotinib-enhanced NK细胞的细胞毒性,A549细胞瞬变与Fas-specific转染核或消极控制核。表面染色和流式细胞术被执行检测Fas表达转染细胞。如图2 (c)Fas的表面表达降低与Fas-specific A549细胞转染核相比,控制。图2 (d)显示的效率radotinib-enhanced细胞毒性较低的Fas-specific siRNA-transfected A549细胞比控制细胞。进一步证实这一结果,重组人可溶性Fas被用来阻止Fas-FasL交互。要绑定的可溶性Fas和NK细胞preincubated Fas配体表面细胞毒性试验。图2 (e)显示的效率radotinib-enhanced细胞毒性显著降低了可溶性Fas的预孵化。

此外,Fas配体的表达对NK细胞被证实确定radotinib对Fas NK细胞的配体表达的影响。Fas配体表达被radotinib稍有增强NK细胞治疗。主要从9个健康的捐赠者NK细胞分离,然后与100年孵化μM radotinib 48 h。荧光强度的平均值(MFI) Fas配体表达的所有9个样品增加约10 ~ 20%,补充图所示S1。Fas配体表达对NK细胞往往增加了radotinib治疗;然而,这一增长已被证明在捐助者的一部分(3个人在9捐助者)。然而,可以肯定的是,radotinib显著增强NK细胞对各种固体癌症细胞系细胞毒性甚至在捐助者的Fas配体不会增加。NK细胞的细胞毒性radotinib其他Fas-expressing细胞系测试通过使用不同的肺癌细胞系,NCI-H460;黑素瘤细胞系,SK-MEL-5 A375;和乳腺癌细胞株MCF-7和mda - mb - 231。这些细胞系作为靶细胞中Fas表达证实了流式细胞术(图3(一个))。图3 (b)表明radotinib-stimulated NK细胞有效地杀死了所有的固体肿瘤细胞检测。

(一)

(b)

(一)
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图3

Radotinib增强NK细胞的细胞溶解的活动对各种肿瘤细胞表达Fas受体。进一步探讨Fas受体参与细胞溶解,各种癌症细胞系被用来分析radotinib-enhanced细胞溶解的NK细胞的活性。(一)各种肿瘤细胞表面Fas表达,包括A549, NCI-H460, A375, SK-MEL-5, mda - mb - 231和MCF-7由染色PE-conjugated Fas抗体(实线)。PE-conjugated老鼠免疫球蛋白抗体作为同形像控制(虚线)。(b)的影响radotinib NK细胞溶解的活动对各种癌症细胞系是由细胞毒性分析。Radotinib-treated NK细胞被用作效应细胞,癌症细胞系作为靶细胞(E: T )。数据报告 。未配对学生的所有值进行了分析 - - - - - -测试使用GraphPad棱镜5。和 。所有资料都是代表三个独立的实验。

因此,它可以改变NK子集的个人或其他NK-activating受体。几项研究已经报道各种NK细胞子集,比如CD56^明亮的或CD56^昏暗的。众所周知,CD56^昏暗的/ CD16⁺外周血NK细胞是主要的人口有溶细胞的活动(13,14]。特别是,据报道,Fas ligand-mediated NK细胞的细胞毒性取决于表达CD56张cd^昏暗的NK细胞。张⁺CD56^昏暗的NK子集高度表达Fas配体,这意味着Fas配体表达的程度不同的细分NK子集(15]。此外,2 b4 LFA-1同时在NK细胞移植Fas配体表达CD94 / NKG2A抑制Fas ligand-mediated细胞毒性(16]。因此,进一步的研究将被要求证明radotinib对Fas配体表达的影响通过细分NK子集的个人理解radotinib-enhanced NK细胞杀伤活性设计未来临床应用治疗。

除了Fas-FasL交互,众所周知,NK细胞的激活是由激活和抑制受体的平衡;确定几个NK细胞受体的表达,如补充图所示S2。激活(NKp46、NKp44 NKp80, NKG2D)和抑制性(CD94、KIR2DL1 KIR2DL2 / DL3和KIR3DL2)受体没有受到radotinib治疗的影响。最近的一项研究调查了其他TKIs包括伊马替尼和nilotinib的影响,导致这两个TKIs也不提高激活或抑制NK细胞受体。然而,这些TKIs增加趋化因子受体CXCR4 NK细胞和单核细胞表面的4]。因此,它是需要调查的影响radotinib趋化因子受体或粘附分子的表达。

这里,我们证实radotinib增强NK细胞对Fas-expressing癌细胞的细胞毒性,但不是CML细胞系K562,提供新的见解radotinib对实体肿瘤的抗肿瘤作用机制。这些结果表明radotinib不通过PBL-mediated细胞毒性诱导K562细胞死亡,其他TKIs相媲美,包括伊马替尼和nilotinib,不提高人外周血对K562细胞的溶细胞活性(2]。因此,为了研究伊马替尼是否也能杀死癌细胞Fas-expressing由PBL细胞毒性,人外周血与甲磺酸伊马替尼治疗(100μM;Sigma-Aldrich)增强溶细胞的活动。对A549细胞毒性略有增加(图甲磺酸伊马替尼治疗4)。然而,增强细胞溶解的活动在radotinib治疗大。

图4

比较radotinib的溶细胞活性和甲磺酸伊马替尼。比较radotinib的溶细胞活性和甲磺酸伊马替尼,TKI治疗CML,反对Fas-expressing A549细胞进行使用radotinib——或者伊马替尼mesylate-treated人外周血和效应细胞A549细胞作为靶细胞的细胞毒性试验。数据报告 。未配对学生的所有值进行了分析 - - - - - -测试使用GraphPad棱镜5。和 。所有资料都是代表三个独立的实验。

总之,这项研究提供了第一个证据表明radotinib,这是作为CML治疗药物开发的,可用于一个新颖的应用程序用于治疗实体肿瘤。这项研究显示了一个强有力的证据表明radotinib增强NK细胞溶解的活动,导致对各种固体癌症细胞系抗癌效应。这表明radotinib间接杀死的抗肿瘤机制通过upregulation先天免疫反应以及直接杀死活动BCR-ABL1-positive CML细胞。这些radotinib的脱靶效应免疫细胞表明radotinib可能是最有效的和最强的治疗实体肿瘤。此外,radotinib已经批准,目前用于治疗CML患者和这些脱靶效应没有杀死正常的免疫细胞在我们的研究中所示。因此,我们希望能够直接应用于其他固体癌症的治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Sunyoung Kyung Eun Kim Hyun Jeong公园,和Daeho秋同样造成这一工作。Kyung Kim Eun和Sunyoung公园co-first作者也同样导致了这项工作。

确认

这项工作是支持的知识经济部(批准号10033778)和创造性的材料发现程序通过韩国国家研究基金会(NRF)由科技部,ICT和未来规划(2016 m3d1a1021387)。

补充材料

补充图1:radotinib对初等NK细胞表面Fas配体的表达。确定radotinib对Fas NK细胞的配体表达的影响,主要从9个健康的捐赠者NK细胞分离,然后与100年孵化μM radotinib 48 h。(A)在NK细胞表面Fas配体的表达是由染色PE-conjugated Fas配体抗体(实线)。PE-conjugated老鼠免疫球蛋白抗体作为同形像控制(虚线)。数据表明是一个代表三个捐助者增加Fas配体的表达。(B)荧光强度的平均值(MFI) Fas配体表达的所有9个样品了。所有值归一化相对于控制(radotinib 0μ米)。相对控制级别被设置为1。补充图2:radotinib对激活或抑制受体的表达。确定的影响radotinib激活或抑制NK细胞的受体,表面染色流式细胞仪进行描述的材料和方法。休息NK细胞或radotinib-treated NK细胞孵化与抗体如下:PE-conjugated NKp44, PE-conjugated NKp46, PE-conjugated NKp80, PE-conjugated NKG2D, FITC-conjugated CD94, APC-conjugated KIR2DL1, PE-conjugated KIR2DL2 / DL3 PE-conjugated KIR3DL2(实线),或同形像控制(虚线)。表面分子的表达水平检测使用FACSCalibur (BD生物科学);然后使用FlowJo数据分析软件。所有资料都是代表三个独立的实验。(补充材料)

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