食品级皂素提取作为乳化剂和免疫刺激剂Emulsion-Based亚单位疫苗对猪

文摘

亚单位疫苗组成的高度纯化抗原的存在需要创建有效和持久的保护性免疫佐剂。辅助研究进展包括设计组合佐剂加入两个或两个以上的疫苗佐剂以增强疗效。以前,一个水包油乳液佐剂(OW-14)由矿物油和一个廉价的阿拉伯树胶乳化剂据报道显示增强的和健壮的免疫反应使用时猪亚单位疫苗的佐剂。本研究提出了一种修改版本与食品级OW-14准备Quillaja皂素提取(OWq)。在新OWq乳液,皂素提取作为乳化剂乳液液滴的稳定和immunoactive化合物。皂甙的使用可以减少所需的原始OW-14的乳化剂。然而,乳液稳定与皂苷显示扩展物理稳定性即使在高温(37°C)。剂治疗疫苗接种的古典猪瘟病毒(CSFV)糖蛋白E2-based疫苗配方OWq产生更高水平的E2-specific免疫球蛋白和病毒中和抗体在猪与动物相比之下接受疫苗佐剂与石油。此外,新OWq佐剂的疫苗接种是安全使用猪。

1。介绍

亚单位疫苗的有效性依赖于免疫刺激性佐剂诱导有效和持久的抗原免疫反应。早期佐剂铝盐和乳剂一样,仍然是主要的疫苗配方选择畜牧物种由于其安全、简单的配方,和低成本1,2]。然而,这些传统的疗效佐剂诱导的抗体反应需要进一步改进。铝盐或乳剂与免疫刺激剂物质目前被认为是一种很有前途的方法在提高疫苗的性能(3,4]。佐剂的组合与不同的行动模式提出了潜在的增强和定制的免疫反应对疾病的长期保护。共同服用两个或两个以上的佐剂的疫苗也一直在探索在兽医2]。不同免疫刺激剂的组合物质,如皂苷、乳剂和铝盐牲畜疫苗一直积极研究了几个研究小组(5- - - - - -7]。例如,添加皂素提取Quil-A®商业emulsion-based疫苗被报道提高体液免疫反应的猪接种口蹄疫(7]。在本研究中,我们利用皂素提取,不仅是免疫刺激性化合物也作为稳定乳状液辅助乳化剂。

皂苷是天然三萜烯葡萄糖苷化合物(图1)中常用的疫苗研究动物和人类病原体(8]。Quillaja saponaria莫利纳树是疫苗佐剂的皂苷的主要来源,尽管有报道称,从其他植物免疫刺激剂活动获得的皂苷9和半合成皂甙10]。商业皂素佐剂隔绝问:saponaria树如Quil-A (Brenntag Biosector / S,丹麦)和QS-21(美国沙漠王)是非常有效的诱导高抗原免疫反应的辅助1 (Th1)和辅助2 (Th2)起源11]。研究表明,碳水化合物组皂苷分子与受体相互作用的抗原递呈细胞(apc)和促进抗原吞噬作用和分泌细胞因子的装甲运兵车,酰基链域协助外源性抗原交付的装甲运兵车和促进Th1免疫(12]。醛基的三萜烯领域促进T细胞表面受体(图的聚集有关1)[13]。然而,这些皂苷提取物在动物疫苗的商业应用程序阻碍了他们的高成本。

另一方面,食品级Quillaja皂素提取也用作乳化剂生产风味和维生素饮料。皂苷分子含有疏水性和亲水性域使它们适合使用乳剂(图稳定水包油的食物1)[14,15]。

OW-14我们之前报道,一种低成本的基于光矿物油乳剂佐剂和食品级阿拉伯树胶乳化剂,可以刺激高层为猪流感疫苗中抗原抗体反应(SI),支原体hyopneumoniae和古典猪瘟(CSF) (16,17]。在目前的研究中,一种变体OW-14乳液辅助制定的食品级皂素提取、Sapnov LS™(美国Naturex), CSF的亚单位疫苗进行了测试。

CSF是由CSF病毒引起的,它是一个小,包膜RNA病毒属瘟病毒属家庭的黄(18]。猪的疾病负责经济损失行业在许多国家。亚单位疫苗是基于古典猪瘟病毒包膜糖蛋白E2 (CSFV)已被证明高层抗原诱导免疫反应和临床保护猪从CSFV的挑战17,19]。

的安全性和有效性食品级皂素提取作为乳化剂和免疫刺激剂与E2 emulsion-based辅助coadministered抗原进行调查。Sapnov LS™是一个水提取物问:saponaria皂素含量约65%干的基础上根据制造商。这个成本效益的非离子表面活性剂用于生产风味和颜色的乳剂浓缩饮料和酒精饮料等。我们所知,这是第一次报告的应用食品级皂素提取emulsion-based疫苗牲畜。此外,一个实验性的油性佐剂(OBA)低能与水溶液混合后产生乳化的E2抗原测试相比,saponin-based乳剂疫苗。

2。材料和方法

2.1。材料

轻矿物油,Drakeol 5和Drakeol 6,买来的象征Panreco(美国圆锥形石垒的城市,PA)。TICAmulsion a - 2010乳化剂(阿拉伯胶)是获得抽搐牙龈(白色的沼泽,医学博士,美国)。Quillaja水提取物Sapnov™(皂素含量65%)是由Naturex Inc .(美国芝加哥,IL)。高分子表面活性剂Atlas g - 5002 l和4916年Atlox获得Croda Inc .旗下(美国德新城堡)。石油石油中链甘油三酯(MCT)购买Jedwards International Inc .(美国马布伦特里)。

2.2。制定佐剂和疫苗

乳液佐剂与皂素提取(OWq)是由溶解TICAmulsion - 2010 (5%/)nanopure水和磁棒搅拌过夜。Quillaja提取Sapnov乳化剂(0.5%/)添加到TICAmulsion解决方案和倒几次,以确保完整的混合乳化剂在水里。矿物油Drakeol 5 (15%/)与乳化剂添加到解决方案。粗乳液和高剪切混合实验室搅拌机(L5MA Silverson Inc .,东Longmeadow,妈,美国)在10000 rpm 15分钟,然后通过microfluidizer M110P(美国微流体,韦斯特伍德,MA)在10000 psi的5倍。OWq被储存在4°C到使用。

昆虫cell-expressed CSFV E2蛋白制备如前所述[17]。亚单位疫苗是由混合2制定vol. E2蛋白溶液溶解在磷酸盐(PBS)和1 vol. OWq乳液辅助使用旋涡混合器几秒钟。

油性佐剂(OBA)是由两个非离子溶解嵌段共聚物表面活性剂,阿特拉斯g - 5002 l和4916年Atlox 7: 1特定的重量比混合油和Drakeol 6矿物油,分别。油和表面活性剂混合在一起在一个80:20重量比率产生一个清晰的黄色的混合物。准备emulsion-based亚单位疫苗,OBA慢慢添加到解决方案的E2蛋白在PBS 1: 1的比例的辅助水相,用电磁搅拌器搅拌30分钟在室温下。

最终浓度的抗原E2蛋白疫苗配方是50μ每剂g。

2.3。佐剂的物理特性和稳定性研究

刚做好的乳剂进行了分析使用动态光散射(DLS)莫尔文Zetasizer纳米z 90(美国莫尔文仪器,位于马)来确定液滴大小,多分散性,电动电势。OWq乳液辅助分析的准备。OBA混合与PBS 1: 1重量比使用电磁搅拌器获得DLS分析和乳液贮存稳定性评估。

约5μl的乳液样品在1毫升的去离子水稀释达到一个半透明的解决方案和执行测量。所有样品都是在室温下测量3次。结果给出了平均3测量±标准差(SD)。乳剂的pH值测量使用VWR交响乐数字酸度计SB21(美国VWR国际,二,PA),校准根据制造商的手册。评估货架稳定、样本存储在4°C,室温(RT), 37°C,然后又分析了液滴大小和pH值6个月后的存储。乳剂乳化的存在也观察到视觉,相分离,和颜色变化。

2.4。猪免疫

动物研究是按照制度进行动物保健和使用委员会(IACUC)。动物被安置在大型动物研究中心(表面)设施,堪萨斯州立大学。传统大型White-Duroc杂交断奶无特定病原体小猪(3周的年龄)疫苗被随机分为两组( 为每个组)和对照组1 - ( )。猪肌内免疫2毫升每个亚单位疫苗。第一组E2蛋白与OWq流行性流感减毒活疫苗(E2 + OWq)。第二次疫苗组免疫与E2和油性佐剂(E2 + OBA)。三个6的动物疫苗组第二个剂量的亚单位疫苗第一次免疫后14天(剂治疗猪)。负对照组收到2毫升PBS的肌肉。收集血液样本在天0、7、14、21、28的实验。从血液中血清分离并存储在−20°C到进一步化验使用。猪每周测量体重。猪健康每天监测包括疫苗注射部位反应。动物是人道的安乐死和处理实验的最后(28天)。

2.5。抗体反应

E2-specific免疫球蛋白、IgG1 IgG2抗体滴度测定的猪血清酶联免疫吸附试验(ELISA)如前所述17,20.]。短暂,96年的平底微量滴定板(康宁®)涂在一夜之间62.5 ng / ml的纯化E2紧随其后洗涤与ELISA洗缓冲区(PBS渐变20 0.05%)和阻塞与ELISA阻断缓冲区(2%胎牛血清在PBS)为1小时37°C。稀释血清添加了盘子和孵化1小时在RT,紧随其后的是洗3次与ELISA洗缓冲区。山羊anti-swine免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(合)(# sc - 2914,圣克鲁斯生物技术、美国、稀释变换),鼠标anti-swine IgG1(美国# MCA635GA, Bio-Rad抗体稀释1/300),或鼠标anti-swine IgG2(美国# MCA636GA, Bio-Rad抗体稀释1/300)100年ELISA阻断缓冲区添加在井μl /二次抗体和孵化1小时与ELISA RT其次是洗涤3次洗缓冲区。HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)(美国# 115-035-003,杰克逊ImmunoResearch稀释变换)添加到井在100年μ信用证在IgG1和IgG2效价分析和孵化1小时在RT其次是洗涤3次清洗缓冲。3,3,5,5-Tetramethylbenzidine -(三甲)稳定发色体(Novex)是用于开发ELISA板2 n硫酸后停止反应。相对抗体浓度决定了光学分光光度计使用SpectraMAX标在450 nm和分析Softmax®Pro 6.4软件(美国分子设备)。

2.6。Anti-CSFV猪血清中和试验

anti-CSFV中和抗体水平是用间接荧光抗体(IFA)测定猪血清收集后21天第一剂量的亚单位疫苗或PBS所描述的其他地方(20.]。在血清样本计算中和滴度的倒数的最高稀释导致病毒的中和50%的井。

2.7。统计分析

数据从猪实验报告为平均值±标准误差的测量(SEM)。治疗组之间的差异分析单向方差分析(方差分析)使用SigmaPlot 11.0软件(Systat软件有限公司、美国)。时被认为是具有统计学意义的差异 。

3所示。结果

3.1。设计佐剂后保留其物理特性长期存储在不同的温度下

根据DLS测量,刚做好的OWq乳液辅助纳米液滴的大小与平均值约为200 nm和相对较低的多分散性,同时乳液准备与OBA液滴周围320海里较高的液滴大小的差异(表1)。所有配方pH值(表7点左右1)。OWq乳液有一个相对狭窄的粒径分布范围从91到531纳米,而乳剂准备从油性佐剂与液滴直径从106纳米到3090纳米(图2(一个))。此外,saponin-based乳液泽塔潜在价值较低(−51.7 mV)比乳剂准备OBA (−25.0 mV)(表1)。经过6个月的存储在不同的温度下,OWq乳液辅助没有发生任何重大的变化在乳液液滴的平均大小,多分散性,电动电势和pH值(表1)。DLS分析检测到一个小的乳液粒径分布转向较大的液滴为所有OWq样品(4°C, RT和37°C)(图2 (b))。因此,6个月后存储在37°C, OWq乳液液滴的大小范围从106到955纳米。但是,没有乳化、相分离和颜色变化被发现在扩展存储后OWq乳液的外观甚至在37°C(图2 (b)插入照片)。平均液滴大小的乳液准备OBA并未改变后存储在4°C和37°C。然而,减少从320纳米到217纳米中检测出样本存储在RT(表1)。视觉观察没有发现任何变化出现的所有OBA乳液样品(数据没有显示)。

3.2。亚单位疫苗与Saponin-Based乳液没有产生健康问题在动物和诱导高的抗体反应

与E2亚单位疫苗接种后,所有猪增长持续,没有观察到体重的差异之间的动物收到1剂量和2剂量的亚单位疫苗和负对照组注射PBS(图3(一个))。小(1 - 2厘米)的存在皮下肿块观察E2 + OWq-vaccinated猪注射部位的组织。28天的研究中,他们在尺寸减少,大部分消失了。阴性对照组和E2 + OBA-vaccinated猪群没有任何病变在注射部位(数据没有显示)。没有观察到猪的健康问题,所有动物靠研究结束的。

猪14天收到提高疫苗的研究增加了E2-specific免疫球蛋白水平的21天、28天的实验(图3 (b))。动物免疫与E2 + OWq显著更高的免疫球蛋白浓度相比,疫苗组收到E2 OBA ( )和对照组(图3 (c))。正如所料,一剂治疗免疫接种程序提供免疫球蛋白g浓度显著高于一剂疫苗两组研究(图21天3 (c))。IgG1和IgG2抗体滴度也高E2 + OWq组与E2 + OBA疫苗组相比,尽管它应该注意的是,两组之间没有统计上的显著差异( 0.12,IgG1和IgG2效价分析,分别)(图3 (d))。

表2代表anti-CSFV中和试验的结果与猪血清收集研究的21天。最高的中和抗体滴度检测在猪接种两剂OWq乳液的E2亚单位疫苗佐剂。很低或没有检测到可检测浓度在所有其他猪等动物接种PBS代替亚单位疫苗(表2)。

4所示。讨论

乳剂是有效的疫苗佐剂,结合皂甙是一种很有前途的方法增加动物疫苗的功效。皂苷是非常有效的免疫增强药和疫苗配方一直在研究在过去几十年(2]。然而,皂苷的毒性较高,原因是他们洗涤剂属性提供了一个主要缺点在他们广泛应用于人类和动物疫苗(11]。有商用纯化皂苷提取物(Quil-A QS-21);然而,他们的高成本排除了他们的应用程序在质量家畜免疫佐剂。

安全性、有效性以及物理和化学稳定性的疫苗佐剂疫苗配方设计新颖的关键因素。此外,材料成本和生产发展的最为重要的家畜疫苗(21]。在这项研究中,一种矿物油基乳液与食品级廉价皂素提取(OWq)和油性佐剂生产乳剂温柔与水相混合后检测猪接种疫苗的安全性和免疫活动。

在OWq,皂素提取作为乳化剂乳化液滴的稳定和亚单位疫苗的免疫刺激剂。因此,皂素提取的原始配方(OW-14) [16)允许减少TICAmulsion a - 2010从7.5%乳化剂/到5%/在不影响架子上辅助的稳定。此外,OWq乳液辅助证明好物理稳定后180天的存储测试温度。意味着液滴大小仍较低的小于300纳米液滴(表之间的多分散性1,图2 (b))。轻微的pH值下降的样品储存在4°C和37°C检测后180天。然而,在乳液样品没有生理变化,如乳化或相分离,被观察到。物理稳定性是非常重要的家畜疫苗,特别是在发展中国家制冷在运输和储存期间可用的疫苗并不总是或成本效益。

液滴直径,多分散性,电动电势准备乳剂是重要的因素在预测乳剂的物理稳定性。刚做好的OWq乳液有纳米尺寸范围从91到531纳米的水滴和低电动电势(−51.7 mV),它提供了液滴之间的静电排斥和防止快速絮凝、聚结。疫苗可以很容易地在现场准备的简单的手混合或温和的风潮OWq与抗原的解决方案。它很容易通过一个标准的管理与20量度针注射器。

OBA混合PBS的低能混合方法产生一个乳液多分散性高,意味着液滴大小约320海里,和电动电势−25 mV。未发现重大的改变意味着液滴大小后180天的存储。然而,减少电动电势值表示降低胶体稳定性与OWq乳剂相比。

佐剂的安全性和免疫活动设计进行了测试与E2猪接种疫苗抗原。猪在亚基CSFV E2与实验免疫佐剂疫苗没有经历任何健康问题并获得重量相同的层次上,负控制猪在整个研究(图3(一个))。小皮下肿块观察OWq疫苗注射部位的组织,虽然他们在大小显著降低或对实验的最后消失了。这些发现表明,食品级皂素提取疫苗配方可以安全地用于兽医。此外,集团与两剂E2亚基蛋白免疫佐剂与OWq乳液有更高E2-specific免疫球蛋白水平(数字3 (b)- - - - - -3 (d))和anti-CSFV中和抗体滴度(表2)相比,疫苗组接受E2制定乳液和无皂甙或其他免疫刺激剂的化合物。

原因E2 + OBA疫苗不能产生强烈的免疫球蛋白抗体反应和高anti-CSFV中和滴度可以归因于的成分和物理特征辅助。OBA主要由植物的MCT油与矿物油的很小一部分,而疫苗通常基于矿物油注射部位产生更多的刺激和诱导免疫反应高于疫苗与植物的油(22]。此外,平均液滴大小的乳液捏造OBA为327.40 nm。然而,它已经表明,颗粒小于200纳米装甲运兵车更有效的处理(23]。显然,OBA成分的变化应该减少乳液液滴的大小,提高乳液稳定性和有效性作为疫苗佐剂。

动物与亚单位疫苗接种两次发展明显高于免疫球蛋白浓度(图3 (c))和anti-CSFV中和抗体滴度(表2)相比,猪接受单一疫苗接种。然而,先前的研究表明,即使是针式接种emulsion-based亚单位疫苗可以保护挑战CSF的猪病毒(17,20.]。

之前的研究结果表明,皂苷促进生产的IgG2 IgG1抗体子类和支持Th1细胞毒性T淋巴细胞反应等传统佐剂与铝盐和乳剂在小鼠模型9,11]。这些表明,皂素佐剂可以是有益的在细胞内病原体如病毒疫苗。在目前的研究中,猪血清样本的IgG2效价分析并没有显示出显著差异saponin-based乳液佐剂和乳剂不皂苷( )(图3 (d))。这可以归因于几个因素如老鼠和猪的区别对皂苷的免疫反应、异构的合成食品级皂素提取、或皂苷的稳定性差导致Th2免疫的刺激,而不是Th1。它已经表明,不同分数的问:saponaria提取液有不同的免疫活动,并能引起生产不同的免疫球蛋白抗体子类(11]。另一项研究表明,问:saponaria提取存储期间很容易退化导致脱酰作用的皂苷分子和无法促进强有力的Th1反应和IgG2生产(24]。确切的分数食品级成分皂苷提取物在这项研究中的应用是未知的,需要确定来验证这些假说。此外,需要进一步研究来证实猪免疫保护的水平和E2蛋白OWq saponin-based乳液后所面临的挑战与CSF病毒。

5。结论

便宜的食品级皂素提取来创建emulsion-based猪亚单位疫苗的佐剂。皂苷为双重目的:稳定乳状液液滴和刺激免疫反应。的皂素提取有助于减少乳化剂在原始OW-14佐剂。这种成分的改变不影响乳液的液滴尺寸稳定佐剂。因此,OWq可以存储至少180天没有戏剧性的变化在不同的温度下液滴的大小,乳化或相分离。一saponin-based乳液在猪免疫佐剂是安全的使用没有明显的炎症在注射部位和一致的观察动物体重增加与E2共同服用后抗原蛋白。两个剂量的CSF E2亚单位疫苗OWq辅助证明高免疫球蛋白和总anti-CSFV中和抗体滴度在猪相比,乳液用油性佐剂疫苗准备没有皂甙。这是第一次证明具有成本效益的食品级皂素提取可以合并在一个emulsion-based佐剂和安全地用于家畜免疫促进强大的抗体反应。

数据可用性

数据集用于支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们要感谢比较堪萨斯州州立大学医学人员的帮助动物研究。这项研究受到了国家生物和农业防御设施的奖项过渡基金和美国农业部农业研究所具体合作协议(59 - 5430 - 001 - 23,np - 103)。

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