文摘

自然杀伤(NK)细胞是典型的先天免疫细胞在多种传染性疾病中扮演角色。NK细胞具有多种通常让他们感知和响应入侵的病原体。我们之前的研究发现,NK细胞可以调节免疫反应引起的日本血吸虫(美国日本血吸虫)在C57BL / 6小鼠。在目前的研究中,通常在进展的作用美国日本血吸虫感染调查。结果表明,TLR3在NK细胞的表达明显增加美国日本血吸虫感染通过rt - pcr和流式细胞仪( )。TLR3受体激动剂(多聚肌苷酸)增加干扰素-γ和il - 4水平的上层清液培养的脾细胞,诱导干扰素的比例更高γ- - - IL-4-secreting从受感染的小鼠脾细胞NK细胞( )。不仅MHC II的百分比,CD69,和NKG2A / C / E-expressing细胞il - 4的百分比,IL-5, TLR3和IL-17-producing细胞+NK细胞显著增加感染后( )。此外,NKG2A / C / E的表达,NKG2D, MHC II和CD69脾NK细胞表面的变化美国日本血吸虫TLR3来华的−−/(TLR3 KO小鼠, );NK细胞的能力在il - 4, IL-5, IL-17分泌减少( )。这些结果表明,TLR3是主要的分子调节NK细胞的激活和功能的过程中美国日本血吸虫C57BL / 6小鼠感染。

1。介绍

日本血吸虫病是一种慢性寄生虫感染引起的人类美国日本血吸虫(1,2]。的鸡蛋美国日本血吸虫沉积在肝、肺、肠道壁和诱发肉芽肿性炎症和进行性纤维化,这是主要的临床病理变化。有许多类型的细胞参与抗击入侵美国日本血吸虫和它的卵,包括Th细胞、自然杀伤(NK)细胞,NKT细胞,myeloid-derived抑制细胞(MDSCs)和巨噬细胞3- - - - - -6]。因此,明显的变化可以被探测到的免疫器官,如脾脏和局部淋巴结(7,8]。

NK细胞是先天淋巴细胞,快速响应入侵病原体通过施加一个直接细胞毒性效应或分泌各种细胞因子,特别是移行细胞(IFN -γ)[7)最近的研究报道,NK细胞能够存活足够长的时间来参与适应性免疫反应(9),和NK细胞在免疫反应中发挥重要作用的宿主对病原体和肿瘤(10]。在寄生虫感染,激活和抑制受体如CD16、CD69, NKG2D, Ly49a NK细胞表达下调后16天摘要cantonensis感染小鼠(11]。CD56的循环频率的降低+CD161+NK细胞在人类内脏利什曼病(12)和效应功能的downmodulation NK细胞刚地弓形虫感染都发现了13]。负监管中NK细胞的作用美国日本血吸虫egg-induced肝纤维化(被发现14]。我们以往的研究表明,Th2-like反应是脾NK细胞的诱导美国日本血吸虫来华的老鼠(7]。

Toll样受体(通常)是在脊椎动物进化保守分子,最初发现其同源性与人数的基础上(15)哺乳动物通常是一个家庭至少12膜蛋白质,引发先天免疫反应。TLR家族成员是模式识别受体(PRRs)承认脂质、碳水化合物、多肽、核酸结构,由不同组的表达广泛微生物(16]。TLR2, TLR3和TLR4可能回应寄生虫抗原和调节树突细胞的激活美国日本血吸虫感染(17,18]。TLR3据报道,调节免疫病理反应曼氏裂体吸虫egg-driven Th2反应肺(19]。

NK细胞具有多种通常让他们感知和响应入侵的病原体。据报道,在健康对照组,TLR2和TLR4的NK细胞主要是胞内表达类似于TLR9识别(20.]。通常可以调节激活NK细胞的细菌/病毒免疫反应在哺乳动物21]。TLR3和TLR7子宫NK细胞的活化可能扮演了一个重要的角色在nonobese糖尿病(NOD)小鼠22]。免疫反应修饰符(irm)可以调节NK细胞功能在体外和体内,和人类NK细胞活化控制不同的间接途径TLR7和TLR8受体激动剂(23]。在这项研究中,通常在NK细胞的角色美国日本血吸虫来华的小鼠脾脏。

2。材料和方法

2.1。道德声明

六到八周大的女性C57BL / 6小鼠(野生型、中山大学实验动物中心、中国)被用于实验。实验利用TLR3也执行−−/老鼠(B6;129年s1-tlr3tm1Flv / J)购买的模型动物资源信息平台(中国南京;压力:J005217)。所有的老鼠都保持在一个特定的无菌微环境实验动物中心,广州医科大学。动物实验进行严格按照法规和准则制度动物保健和使用委员会广州医科大学。所有动物使用适当被批准协议和人道机构广州医科大学动物保健和使用委员会(2012 - 11)。是尽一切努力来减少痛苦。

2.2。老鼠、寄生虫和感染

的日本血吸虫cercariae用于实验获得钉螺hupensis -感染蜗牛(江苏寄生虫病研究所、中国)。30 C57BL / 6小鼠和10 TLR3−−/小鼠经皮感染40±5 cercariae,和同等数量的未感染正常小鼠被用作控制。所有的老鼠都牺牲了6周后美国日本血吸虫感染报道之前(5]。

2.3。抗体

以下单克隆抗体被用于这些研究:PE-conjugated鼠IgG1 (R3-34) APC-conjugated鼠IgG1 (R3-34) APC-cy7-conjugated anti-mouse CD3 (145 - 2 - c11), Alexa萤石647 -共轭anti-mouse TLR2 (c2) 6日,PE-conjugated anti-mouse TLR4 (MTS510) PE-conjugated anti-mouse TLR7 (A94B10) PerCP-Cy5.5-conjugated anti-mouse CD4 (RM4-5) APC-conjugated anti-mouse CD8 (RPAT8) FITC-conjugated anti-mouseγδ细胞受体(GL3) APC-cy7-conjugated anti-mouse CD11b (M1/70) PE-conjugated anti-mouse Ly6G (1 a8) FITC-conjugated anti-mouse CD94 (20 d5), PE-conjugated anti-mouse CD314 (XMG1.2) APC-conjugated anti-mouse干扰素-γ(XMG1.2) PE-conjugated anti-mouse il - 4 (11 b11) PE-conjugated anti-mouse IL-17A (TC11-18H10)和APC-conjugated anti-mouse IL-5 (TRFK5)。所有抗体都购自BD Pharmingen(美国圣地亚哥,CA)。FITC-conjugated鼠IgG1 (G0114F7) FITC-conjugated anti-mouse MHC II (M5/114.15.2) FITC-conjugated anti-mouse CD94 (Kp43) PE-cy7-conjugated鼠IgG1 (G0114F7) PE-cy7-conjugated anti-mouse F4/80 (EMR1 Ly71) PE-cy5-conjugated anti-mouse CD19 (6 d5), PE-cy7-conjugated anti-mouse NK1.1 (PK136) APC-conjugated鼠IgG1 (G0114F7) APC-conjugated anti-mouse TLR3 (11 f8), PE-conjugated anti-mouse TLR3 (11 f8), PE-conjugated anti-mouse NKG2D (A10)和APC-conjugated anti-mouse CD69 (H1.2F3)抗体购自BioLegend(美国圣地亚哥,CA)。

2.4。制备脾细胞和NK细胞

老鼠牺牲在感染后6周。脾脏是通过100年机械分离和加工μm细胞过滤器(BD猎鹰)。红细胞后被红细胞裂解缓冲(NH)4Cl 8.29 g, KHCO31 g和Na2EDTA 37.2 mg / l),这些细胞被洗两次汉克斯平衡盐溶液和resuspended完全rpmi - 1640中,含有10% heat-inactivated胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素、2毫米谷氨酰胺和50μM 2-mercaptoethanol。脾细胞显微镜下计数,然后稀释的最终浓度2×106细胞培养细胞/毫升。细胞染色,脾细胞沾使anti-mouse CD3和NK1.1抗体为30分钟,其次是洗涤两次,在无菌PBS resuspending 0.5牛血清白蛋白(BSA)。然后,CD3−NK1.1+NK细胞按使用流式细胞仪(美国贝克曼MoFlo XDP)。NK细胞的纯度是90%以上,后立即使用排序。

2.5。细胞表面和细胞内染色

脾淋巴细胞刺激如前所述执行(7]。短暂,细胞表面染色,单身脾淋巴细胞悬浮液与anti-CD3洗两次,染色,NK1.1, TLR2 TLR4、CD4、CD8,γδT CD19 Ly6G F4/80, MHC II, CD69, CD94 (NKG2A / C / E),或CD314 (NKG2D)抗体在黑暗中30分钟在4°C。染色细胞被洗两次,使用流式细胞仪检测出来。对细胞内细胞因子染色、单脾淋巴细胞悬浮液是孵化5 h的佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) (20 ng / ml,σ)和ionomycin (1μg / ml,σ)在37°C下5%的股份有限公司2大气;brefeldin (10μg / ml,σ)增加了1小时后刺激。细胞被洗两次,沾染了抗体的细胞表面标记在黑暗中30分钟在4°C。细胞被固定在4%多聚甲醛和permeabilized一夜之间在4°C PBS缓冲含有0.1%皂苷(σ),南BSA的1%和0.05%3。在第二天,细胞染色与共轭抗体特定TLR3, TLR7, il - 4,干扰素γ、IL-17 IL-5 30分钟。染色细胞被洗了两次,发现通过使用流式细胞仪(美国贝克曼库尔特CytoFLEX)和数据分析程序CytExpert 1.1(美国贝克曼库尔特)。

2.6。实时PCR RNA准备

脾淋巴细胞和NK细胞总RNA分离用试剂盒试剂(美国生活表达载体技术,卡尔斯巴德,CA)。1μg的总RNA转录cDNA通过使用上标三世逆转录酶工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。以下引物合成了英杰公司(中国上海):TLR2, 5-CTCTCCGTCCCAACTGATGA-3(向前)和5-GGTCTGGTTGCATGGCTTTT-3(反向);TLR3, 5-ATTCGCCCTCCTCTTGAACA-3(向前)和5-TCGAGCTGGGTGAGATTTGT-3(反向);TL4起,5-AGGTTGAGAAGTCCCTGCTG-3(向前)和5-GGTCCAAGTTGCCGTTTCTT-3(反向);TLR7, 5-GCATTCCCACTAACACCACC-3(向前)和5-ACACACATTGGCTTTGGACC-3(反向);为β肌动蛋白,5-CCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3(向前)和5-GGGTGTAAAACGCAGCTCAGTA-3(反向)。与RT-qPCR mRNA表达进行了分析通过使用豆类SYBR预混料交货Taq II (RR820A)。PCR条件列出如下:95°C 30年代,紧随其后的是40个周期95°C的5 s和60°C 30年代。放大进行了一式三份。β肌动蛋白mRNA用于规范化。放大是由使用CFX96触摸qPCR系统(Bio-Rad、大力神、钙、美国),和定量mRNA水平正常化β肌动蛋白mRNA表达水平。TLR成绩单是归一化的水平β肌动蛋白成绩单通过使用相对数量(RQ) = 2−△△Ct方法。qPCR产品分析multiwelled 1.0%琼脂糖凝胶。电泳中执行1×TAE缓冲在400 V 30分钟。凝胶中可视化ChemiDoc XRS普遍罩II (Bio-Rad实验室)。

2.7。ELISA检测

细胞培养与不同的刺激在96 -孔板在37°C下5%的股份有限公司272 h的气氛。上层清液收集和干扰素-的水平γ和il - 4用ELISA检测(IFN -根据制造商的指令γ:551866,双相障碍;il - 4: 555232,双相障碍)。干扰素-的检测下限γ是3.126 pg / ml和il - 4的7.8 pg / ml。样本在450 nm通过使用微型板块读者(BioTek elx莫德- 800)。

2.8。统计分析

数据用SPSS 11.0软件进行了分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。平均值差异利用Mann-Whitney组评估 测试。单向方差分析是用来分析数据的TLR3 KO鼠标在图1。 被认为是具有统计学意义。

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图1
NK细胞的特征美国日本血吸虫TLR3来华的−−/老鼠。女性C57BL / 6野生型小鼠(WI)和TLR3−−/老鼠(TLR3 KO)被感染美国日本血吸虫5周后cercariae与否和牺牲。脾淋巴细胞分离和染色的不同使抗体并通过流式细胞仪分析。CD19 (A / B)−细胞群是封闭的首先。CD3的百分比−NK1.1+NK细胞进行了分析。(一)代表结果显示。(b)统计结果脾NK细胞的百分比的计算从流式细胞仪数据。一个综合症代表一个独立的实验。(c, d)的表达MHC II, CD69, NKG2A / c / E, NKG2D NK细胞的小鼠正常和感染WT TLR3 KO小鼠脾脏被检测到。(c)一个代表性的结果显示。(d)统计结果显示至少有三个独立的实验。(e, f)脾淋巴细胞与PMA刺激+ ionomycin 5小时,由细胞内染色,染色和流式细胞术分析。干扰素-的表达式γil - 4, IL-5, IL-17 NK细胞从不同群体所示。结果显示(e)的代表。(f)至少三个独立实验的统计结果。数据显示为意味着+ 3 - 5三个独立样本的扫描电镜实验。 和 ;ns的 。N:正常;正:感染。

3所示。结果

3.1。TLR3表达在脾NK细胞增加美国日本血吸虫来华的老鼠

探索的角色通常在NK细胞的进步美国日本血吸虫感染,通常在NK细胞的表达美国日本血吸虫首先检测出来华的老鼠。如图2,正常和感染小鼠的脾脏孤立,和单个细胞悬浊液的准备,不同使anti-mouse CD3和NK1.1排序CD3抗体被用来−NK1.1+NK细胞流式细胞仪。排序NK细胞的纯度在95%以上。此外,信使rna提取从脾细胞和脾脏NK细胞,分别。互补脱氧核糖核酸合成,qPCR。结果表明TLR2的表情,TLR3, TLR4, TLR7 mRNA在脾NK细胞明显增加美国日本血吸虫感染( )。TLR3 mRNA表达与正常小鼠相比(几乎增加了5倍 )。此外,脾细胞染色和TLR2的表达,TLR3和TLR4 CD3−NK1.1+NK细胞被发现(图2 (c))。结果(图2 (d))显示的百分比在脾NK细胞TLR2和TLR3感染组高于正常组(TLR2: 12.80±2.442和21.23±2.409, ;TLR3: 13.75±1.623%和1.558±0.266%, )。然而,TLR4的表达没有明显差异,TLR7 NK细胞间正常和被感染的老鼠( )。

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图2
不同的表达通常在小鼠脾淋巴细胞和NK细胞美国日本血吸虫感染。(一)从正常和脾淋巴细胞分离美国日本血吸虫野生型老鼠来华,CD3−NK1.1+NK细胞脾淋巴细胞用流式细胞术中分离的纯度分离脾NK细胞通过流式细胞仪被发现。(b)脾淋巴细胞和NK细胞总RNA是收获,分别。的积累TLR2 TLR3、TLR4和TLR7 mRNA被使用qPCR量化。TLR成绩单是归一化的水平β肌动蛋白成绩单通过使用相对数量(RQ) = 2−△△Ct方法。数据代表意味着±SEM的至少三个实验。(c, d)表达TLR2, TLR3, TLR4和TLR7脾NK细胞用流式细胞仪进行评估。(c)一个代表性的结果显示。(d)统计结果6到8个独立的结果。N:正常;正:感染; ,比较正常和感染组。
3.2。多聚肌苷酸促进il - 4从受感染的小鼠脾NK细胞分泌

进一步探索的角色通常对NK细胞、脾细胞从正常和被感染的老鼠与PGN培养,保利我:C,分别或有限合伙人。上层清液收集72 h后,干扰素-γ用ELISA和il - 4水平检测。如图3(一个),感染小鼠的上层清液中il - 4水平明显高于正常小鼠( )。保利之后我:C语言刺激、il - 4水平显著高于nonstimulated控件(38.76±4.45%和23.88±2.33%, )。

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图3
干扰素-γ和il - 4分泌toll样受体激动剂引起的。(a)从正常和感染小鼠脾淋巴细胞悬浮液制备和培养与PGN聚我:C,或有限合伙人。七十二小时后,干扰素-γ用ELISA和il - 4生产评估。(b)从正常和感染小鼠脾淋巴细胞悬浮液与PGN准备和刺激,保利我:C,有限合伙人,或者PMA + ionomycin 5小时。干扰素-γ和il - 4生产由脾NK细胞用流式细胞仪进行评估。干扰素的结果- - - - - -γ和脾NK细胞产生的il - 4 (c)计算列示。数据显示为意味着+ 5的扫描电镜样本三个独立的实验。 ,比较正常和感染组。

此外,感染小鼠和正常小鼠的脾细胞刺激通过使用PGN,保利我:C,有限合伙人,或者PMA + ionomycin分别。干扰素的表达γ和il - 4 NK细胞通过细胞内细胞因子染色(图检测3 (b))。如图3 (c),il - 4的比例+从感染小鼠脾NK细胞是细胞显著增加(安:2.52±2.00%和9.37±1.22%;PGN: 2.32±1.37%和13.03±4.11%;多聚肌苷酸:2.54±1.97%和14.60±4.53%;有限合伙人:2.44±1.67%和12.17±6.00%;PI: 3.04±1.55%和9.6±4.15%, )。NK的百分比+il - 4+引起的细胞聚我:C是明显高于对照组( )。干扰素-的百分比γ+细胞脾NK细胞从受感染的老鼠比正常老鼠(安:4.54±0.95%;PGN: 2.42±1.08%;多聚肌苷酸:6.01±1.50%;有限合伙人:4.02±1.80%;PI: 6.11±0.47%, ),但干扰素-的百分比γ+NK细胞引起这些通常不高于如果控制感染小鼠( )。

3.3。TLR3的细胞来源的脾脏美国日本血吸虫来华的老鼠

单一的脾细胞悬浮液从正常和准备美国日本血吸虫-受感染的老鼠调查TLR3的细胞来源美国日本血吸虫-感染小鼠脾脏。TLR3表达在不同的细胞检测到细胞内染色子集,包括CD3+CD4+Th细胞、CD3+CD8+Tc细胞、CD3+NK1.1+NKT细胞、CD3+γδ细胞受体+γδT细胞、CD3−CD19+B细胞、CD3−CD19−NK1.1+NK细胞单核细胞群。数据4(一)和4 (b)表明,TLR3的比例+NK细胞在感染后增加了约三倍(正常:2.07±0.63%;感染:5.65±0.78%, )。没有明显差异在Th细胞检测,Tc细胞,B细胞,NKT细胞,或γδT细胞( )。

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图4
TLR3表达在不同的脾细胞的子集。(a)单一的脾细胞悬浊液分离,体积小的人口活细胞是封闭的首先,TLR3在CD4的表达+CD8 T细胞,+T细胞,NKT细胞γδT细胞CD3+细胞群,CD3−CD19+B细胞、CD3−CD19−NK1.1+分析了NK细胞流式细胞术。TLR3表达在不同的统计分析脾脏淋巴细胞的子集(b)所示。(c)脾淋巴细胞活细胞总人口首先是封闭的;TLR3表达的不同骨髓包含CD11b子集+Ly6G+中性粒细胞,CD11b+F4/80+巨噬细胞,CD11c+B220+CD11b−血浆树突细胞(髓样),CD11c+B220−CD11b+传统树突状细胞(cdc) (d)所示。数据代表意味着±SD的三个独立实验每组3 - 5的老鼠。 ; 。N:正常;正:感染。

同时,TLR3表达检测骨髓细胞群,包括CD11b+Ly6G+中性粒细胞,CD11b+F4/80+巨噬细胞,CD11c+B220+CD11b−血浆树突细胞(髓样),CD11c+B220−CD11b+传统树突状细胞(疾控中心)。如数据所示4 (c)和4 (d)的表面,TLR3表达高度(?)从正常小鼠中性粒细胞(8.03±0.97%),但比例下降美国日本血吸虫感染(4.46±0.51%, ,数据4 (c)和4 (d))。类似的趋势也发现了巨噬细胞和疾病预防控制中心,但没有统计学差异( )。髓和疾控中心检测之间无显著差异( )。

3.4。TLR3表型和功能变化+脾NK细胞诱导美国日本血吸虫

此外,从正常和感染的小鼠脾细胞分离和染色不同使抗体,包括anti-CD19, CD3, NK1.1, TLR3, MHC II, CD69, NKG2A / C / E, NKG2D调查的作用美国日本血吸虫在TLR3+脾NK细胞。CD19的−单核细胞是封闭的首先;CD69的表达MHC II, NKG2A / C / E, NKG2D在TLR3发现了−/ +NK细胞(图5(一个))。结果(图5 (b))表明,MHC II的百分比——CD69, TLR3和NKG2A / C / E-expressing细胞+在感染后NK细胞显著增加(MHC II: 76.59±3.054%和92.92±1.770%;CD69: 17.72±1.257%和22.30±0.3512%;NKG2A / C / E: 77.80±2.498%和90.48±1.626%, )。相反,TLR3 NKG2D的百分比+在感染后NK细胞明显减少(47.43±4.974%和12.99±1.155%, )。的表达在TLR3 NKG2A / C / E−在感染后NK细胞显著增加(70.23±0.6203%和77.18±1.348%, ),而在TLR3 NKG2D的百分比−在感染后NK细胞明显减少(61.08±3.683和13.64±1.682, )。没有发现显著差异在MHC II和CD69的表达TLR3的表面−NK细胞( )。

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图5
TLR3表型和功能变化+脾NK细胞。(a, b)脾淋巴细胞在CD19封闭−CD3−NK1.1+首先,细胞和细胞与单克隆抗体染色鼠标NKG2A / C / E, NKG2D, MHC II和CD69。一个代表性的结果显示在(A),活化分子的比例在TLR3表达+NK细胞和TLR3−NK细胞流式细胞仪数据计算(b)。(c, d)脾淋巴细胞与PMA刺激+ ionomycin 5小时,固定和利用单克隆抗体染色。(c)一个代表性的结果显示。(d)的比例在TLR3细胞因子生产+NK细胞和TLR3−NK细胞从流式细胞仪数据计算。数据从三个独立实验每组和显示为3 - 5个老鼠意味着±SEM。 ;ns的 。N:正常;正:感染。

同时,从正常和脾细胞美国日本血吸虫来华的老鼠被PMA + ionomycin孤立和刺激,和细胞内细胞因子染色是在材料与方法中描述。干扰素的表达γil - 4, TLR3 IL-5, IL-17调查−/+脾NK细胞(图5 (c))。结果(图5 (d))表明,il - 4的百分比——IL-5, TLR3和IL-17-producing细胞+在感染后NK细胞数量显著增加(il - 4: 14.73±1.968% 8.787.97581%;IL-5: 0.03333±0.03333%和0.9833±0.1922%;IL-17: 24.50±2.466%和51.76±2.258%, )。然而,没有发现显著差异在干扰素-的百分比γTLR3第细胞+NK细胞( )。TLR3的人口−NK细胞il - 4, IL-17-producing细胞的百分比显著增加(il - 4: 7.150±1.028%和12.85±1.627%;IL-17: 6.223±1.309%和11.98±1.534%, )。然而,干扰素-的百分比γ分泌细胞显著下降(16.96±1.190%和6.120±1.609%, )。没有发现显著差异在IL-5-producing NK细胞的百分比(0.4067±0.05812%和0.5267±0.08192%, )。

3.5。TLR3介导期间脾NK细胞的功能美国日本血吸虫感染

此外,野生型(WT)和TLR3淘汰赛(TLR3 KO)小鼠感染美国日本血吸虫确认TLR3在NK细胞的作用。脾细胞被孤立在感染后5周,TLR3和未感染野生型基因敲除小鼠被牺牲为对照组。如图1(一),CD3的百分比−NK1.1+NK细胞CD19−单核细胞流式细胞仪,探讨了不同组的老鼠。结果表明,从感染了WT小鼠的NK细胞比例(0.80±0.28%)远低于未受感染的老鼠WT (3.76±0.56%, )。所以是比较感染(1.33±0.14%)和未感染(3.43±0.13%, TLR3 KO小鼠。值得注意的是,从TLR3 KO感染小鼠的NK细胞比例增加而WT感染小鼠( ,图1 (b))。

接下来,MHC II的表达CD69, NKG2A / C / E, NKG2D从四组小鼠的NK细胞用流式细胞术检测(图1 (c))。的表达MHC II WT小鼠的NK细胞明显增加美国日本血吸虫感染(6.15±1.95%和16.36±2.93%, ,图1 (d))。MHC II表情TLR3 KO小鼠的NK细胞,相比之下,并没有改变在感染后统计(5.94±2.25%和5.97±0.94%, ,图1 (d))。MHC II-expressing NK细胞的百分率TLR3 KO小鼠感染后不到WT统计( ,图1 (d))。类似于MHC II,从WT小鼠NK细胞CD69的表达也显著增加感染后(8.34±2.18%和15.39±0.69%, ,图1 (d)),没有感染和未感染的区别TLR3 KO小鼠(11.10±2.04%和10.66±3.37%, ,图1 (d))。然而,对NK细胞CD69的表达受感染TLR3 KO小鼠并没有改变显然与他们匹配的对照组相比( ,图1 (d))。符合我们之前的研究中,NKG2A / C / E和NKG2D的表达从WT小鼠NK细胞明显减少美国日本血吸虫感染(NKG2A / C / E: 47.88±8.12%和19.93±3.69%;NKG2D: 80.62±2.21%和35.35±3.65%, ,图1 (d))。正如我们所料,之间没有明显的改变感染和未感染TLR3 KO小鼠(NKG2A / C / E: 45.25±2.42%和42.35±6.65%;NKG2D: 67.17±1.62%和60.51±13.67%, ,图1 (d))。值得注意的是,NKG2A / C / E和NKG2D的表达从感染了TLR3 KO小鼠NK细胞与小鼠感染WT(相比要高得多 ,图1 (d))。

我们还测量了细胞因子的生产从感染了TLR3 KO小鼠NK细胞。数据1 (e)和1 (f)显示的百分比IFN -γ+从WT小鼠NK细胞明显减少美国日本血吸虫未感染:感染(15.19±2.62%;感染:4.03±0.25%, ,图1 (f)),因为我们之前的研究中,所以是TLR3 KO组(未感染:14.73±4.4%;感染:5.94±0.6%, ,图1 (f))。il - 4的比例+和IL-5+未感染WT小鼠NK细胞在3.86±0.26%和0.76±0.44%,分别。这些百分比显著增加到8.27±0.70% ( ,图1 (f))和1.66±0.22% ( ,图1 (f)),分别美国日本血吸虫感染。这些数字显著降低到4.07±1.77%和0.70±0.16%感染了TLR3 KO小鼠( ,图1 (f)),这等于未感染TLR3 KO小鼠组(il - 4: 3.78±0.09%;IL-5: 0.45±0.13, ,图1 (f))。出乎意料,IL-17的百分比+NK细胞显著增加感染后从WT(未感染:1.74±0.09%;感染:5.06±1.71%, ,图1 (f))和TLR3 KO小鼠(未感染:1.31±0.05%;感染:2.31±0.38%, ,图1 (f))。不过,WT之间有显著差异,TLR3 KO受感染的老鼠( ,图1 (f))。

4所示。讨论

据报道,NK细胞可以表达多种通常可以发挥重要作用的进展NK细胞活化反应细菌和病毒感染(21)和肿瘤(24]。这里的角色通常在NK细胞的进步美国日本血吸虫感染C57BL / 6小鼠脾脏内研究了感染后6周,这是感染的急性期以前的报告(6- - - - - -8]。如图2,脾NK细胞表达了一种更高层次的TLR3 TLR2, TLR4 TLR7, TLR9识别美国日本血吸虫鼠标(来华的 )。它建议TLR3可能参与调节的激活美国日本血吸虫侵染诱导NK细胞。

正如我们所知,美国日本血吸虫感染可能导致Th2-dominant体内免疫反应(25]。我们先前的研究已经发现,脾NK细胞分泌干扰素-的能力γ从美国日本血吸虫来华的鼠标是下降而il - 4分泌增加(7]。在这里,我们的研究结果表明,聚我:C可以诱导更高层次的从受感染的小鼠脾细胞il - 4(图3(一个), )和il - 4的比例+NK细胞在聚我:C cocultured感染脾细胞非常高( )。它表明,美国日本血吸虫侵染诱导TLR3 NK细胞是参与调节NK细胞的功能。然而,据报道,保利我:C不仅是TLR3配体还可以与rig - I (26,27),这可能会影响il - 4的表达(28]。

另一方面,据报道,TLR3可以调节免疫病理反应曼氏裂体吸虫egg-driven Th2反应肺(19]。TLR3表达许多类型的免疫细胞,如DC细胞、巨噬细胞、NK细胞、T细胞和B细胞(29日- - - - - -32]。在这项研究中,TLR3表达的是不同类型的脾细胞从正常和检查美国日本血吸虫来华的老鼠。结果表明,TLR3表达显然只会增加从感染小鼠NK细胞( ,图4(一))。它建议NK细胞可能可以应对材料的主要靶细胞通过TLR3脾的过程中美国日本血吸虫感染。虽然接触的TLR2和TLR3血吸虫卵是重要的炎性细胞因子的产生和干扰素刺激基因,如某些趋化因子,通过DCs (18),并观察TLR3表达无显著差异在髓,疾控中心,中性粒细胞和巨噬细胞( ,图4 (b))。它可能与事实髓细胞主要在网站上播放功能(炎症33]。

MHC II、CD69 NKG2A / C / E, NKG2D激活,关联表示NK细胞表面的分子(34- - - - - -37]。我们的研究结果表明,MHC II的百分比、CD69, TLR3和NKG2A / C / E-expressing细胞+NK细胞显著增加感染后( ,数据5(一个)和5 (b))。它表明,美国日本血吸虫感染可能诱发TLR3的激活+在脾脏NK细胞。此外,据报道,朝鲜血统可能发展成cytokine-producing / apc影响系统性自身免疫性疾病的启动和进展(37]。和许多细胞因子,如干扰素-γil - 4, IL-5 IL-17,据报道被NK细胞(分泌7,38]。我们的研究结果显示,il - 4的比例显著增加,IL-5, TLR3和IL-17-producing细胞+NK细胞人口从被感染的老鼠( ,数据5 (c)和5 (d))。它表明,TLR3可能调解Th2-like脾NK细胞的免疫反应的进展美国日本血吸虫感染。

此外,TLR3−−/老鼠感染美国日本血吸虫进一步评估的角色TLR3在NK细胞的感染。结果表明,NKG2A / C / E的表达,NKG2D, MHC II,对NK细胞CD69显著降低美国日本血吸虫TLR3来华的−−/老鼠(图1 (c)和1 (d))。这些结果表明,TLR3 NK细胞的活化介导的美国日本血吸虫感染。与此同时,我们的研究结果显示,显著降低干扰素-γ第NK细胞,增加il - 4 -, IL-5和IL-17-producing NK细胞美国日本血吸虫TLR3来华的−−/老鼠( ,数据1 (e)和1 (f))。它证实,TLR3可以调节过程中NK细胞的功能美国日本血吸虫感染。

总之,我们的研究表明,脾NK细胞美国日本血吸虫来华的C57BL / 6小鼠更高层次的TLR3表达,和TLR3-expressing NK细胞更敏感,在体外和体内。我们的研究结果表明,TLR3可能参与调节NK细胞的免疫反应过程中美国日本血吸虫C57BL / 6小鼠感染。

缩写

美国日本血吸虫: 日本血吸虫
TLR: toll样受体
NK: 自然杀手
IL: 白介素
Th: 辅助T细胞
干扰素: 干扰素
柯: 基因敲除
PRRs: 模式识别受体
PMA: 佛波醇12-myristate 13-acetate。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

所有动物使用适当被批准协议和人道机构广州医科大学动物保健和使用委员会(2012 - 11)。是尽一切努力来减少痛苦。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

黄的设计研究是由小君诺盾;执行由瞿佳乐实验被执行死刑,李陆和红岩谢;数据解释和分析了Xiaona张全杨Huaina秋Yuanfa冯,至岑溪金;起草或修订手稿至关重要的知识内容是由黄董诺和小君。所有作者阅读和批准最终的手稿。佳乐曲)、李陆和红岩谢了同样要这项工作。

确认

这项工作是支持由中国自然科学基金(81771696)、广东省教育部门(2016 kzdxm033),和国家的基金发展地方高校(no.B16056001)。