文摘
多发性硬化(MS)是一种慢性炎症性自身免疫性疾病的中枢神经系统(CNS)。目前,还有缺乏治疗治疗间充质干细胞(MSC),女士的基础治疗是最近在自身免疫性疾病强烈兴趣的主题。在这里,我们调查的治疗效果和潜在机制人类羊膜间充质细胞在炎症和remyelination (hAMC)实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)老鼠。免疫C57BL / 6小鼠髓少突细胞糖蛋白(MOG) - 55肽。成功建立hAMC时腹腔内注射实验性自身免疫性脑脊髓炎。结果表明,应用hAMC显著改善疾病的严重程度和组织病理学改变老鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎。促炎细胞因子如干扰素——的生产γ肿瘤坏死因子-α,il - 1β急剧,IL-17A脾脏和中枢神经系统抑制。此外,CD4 + T细胞和CD8 + T细胞在中枢神经系统也被老鼠hAMC治疗后显著降低实验性自身免疫性脑脊髓炎。此外,hAMC治疗也促进了生产neuron-repair因素(神经生长因子、据和BDNF)小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎。总之,这些结果表明,hAMC可以减弱小鼠的炎症,促进remyelination实验性自身免疫性脑脊髓炎,这可能是一个有前途的治疗MS的细胞来源。
1。介绍
多发性硬化(MS)是最常见的慢性炎症性自身免疫性疾病的中枢神经系统(CNS)的年轻人。它的特点是单核细胞炎症,髓鞘脱失,广泛的轴突损伤,和轴突丧失1,2]。了多方面的证据表明,异常autoreactive T细胞反应,结合监管网络的免疫系统的功能障碍,女士的发病机制中发挥了核心作用[3,4]。到目前为止,仍然没有治愈女士目前批准的药物主要是发挥对炎性疾病进程的影响但并不减少神经退化或促进中枢神经系统修复5]。因此,寻找新的治疗不仅可以减弱炎症但也阻止神经退化以及支持remyelination和修复受损组织是急需的6]。
间充质干细胞(MSC)被认为是作为组织工程的现成的来源。他们有多能干细胞分化能力,可以分化成多种细胞类型。因此,他们主要用于器官移植和组织修复过去(7,8]。最近,由于他们的免疫调节特性,MSC被认为是有前途的候选人治疗自身免疫性疾病的治疗胰岛素依赖型糖尿病、类风湿性关节炎等(9]。
人羊膜间充质细胞(hAMC)是人类胎盘羊膜的孤立(10]。与MSC从其他来源相比,hAMC可以很容易地获得通过最少的伦理问题。超过107hAMC可以通过简单的从一个羊膜分离酶消化过程(11]。更重要的是,这些细胞不表达端粒酶,细胞移植后排除肿瘤形成的风险(12]。这些属性使hAMC新的临床应用的理想MSC资源。在先前的研究中,我们发现hAMC可以减少促炎细胞因子的产生,并进一步,他们不仅在体外抑制T淋巴细胞增殖,但也与胶原诱导关节炎大鼠,一个典型的人类风湿性关节炎动物模型(13- - - - - -15]。除了影响免疫细胞和炎性细胞因子,hAMC也被证明产生神经保护因子(16]。这些证据表明hAMC可能潜在的临床使用一些CNS-related炎症性疾病的治疗。实际上,使用hAMC治疗肌萎缩性脊髓侧索硬化症等中枢神经系统疾病模型动物和脊髓损伤与成功报道17,18]。然而,能否用于治疗仍未探索女士。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)是最常用的实验模式,许多研究已经成功地使用这一模型来探索免疫和神经机制和评估潜在的治疗干预的功效[女士19- - - - - -21]。因此,在这项研究中,我们调查的疗效及可能机制hAMC。在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎
2。材料和方法
2.1。隔离hAMC
胎盘是在选择性剖腹产获得知情同意。hAMC孤立从废弃的人类胎盘根据我们先前描述(11]。总之,羊膜层从绒毛膜机械剥落层和洗几次汉克斯平衡盐溶液(hbs)没有钙和镁去除血液。然后,羊膜与0.25%胰蛋白酶消化(美国Gibco BRL,马里兰州)30分钟的37°C。此外,羊膜是切成块,与0.1%胶原酶消化V (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在30分钟获得hAMC 37°C。最后,分离hAMC培养在DMEM / F12补充10%的边后卫(美国马里兰州盖瑟斯堡Gibco BRL,,)。hAMC不超过3通道被用于实验。此外,所有的相关伦理问题研究是中日友好医院的审查委员会批准。
2.2。动物
女性C57BL / 6小鼠购自北京重要河流实验动物技术有限公司(中国,北京)加权18 - 20 g 8 - 10周的年龄。老鼠住在一个房间的温度、湿度和光控环境。他们喂食物和水随意并允许适应自己一个星期前开始实验。这项研究是研究中日友好医院伦理委员会批准。
2.3。感应的运算单元
模型主要进步实验性自身免疫性脑脊髓炎C57BL / 6小鼠出版协议后成立(22]。获得免疫小鼠皮下注射0.2毫升的髓鞘背面少突细胞糖蛋白(MOG) - 55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK HPLC-purity: > 95%) (ChinaPeptides、上海、中国)乳化CFA(美国Chondrex,雷蒙德,佤邦)包含4毫克/毫升结核分枝杆菌H37Ra。这些注射是分布在以下三个网站:一个沿着中线的肩膀和两个中线两侧的后背。MOG - 55的最后一剂结核分枝杆菌H37Ra是200μg和400μg /鼠标。每个老鼠收到一个额外的400 ng百日咳毒素(研发系统、MN、美国)腹腔内注射的200μL每天0和2 postimmunization PBS。临床分数计算盲目由两位研究者每天根据0 - 5范围如下(23):1、柔软的尾巴或带尾鸭步态强壮;2、鸭步态与柔软的尾巴(共济失调);2.5,与部分肢体瘫痪共济失调;3、完全瘫痪的肢体;3.5,完全瘫痪的肢体与第二部分瘫痪肢体;4,完全两个肢体瘫痪,4.5,奄奄一息;,5日死亡。
2.4。治疗
治疗开始后第14天(在疾病发作)主要免疫和持续了21天。小鼠随机分为三组:正常组、模型组、hAMC组。hAMC组中的小鼠腹腔注射100μ包含1×10 L PBS6hAMC。在正常组和模型组小鼠腹腔注射同样体积的PBS。
2.5。免疫荧光染色鉴定
孤立hAMC被播种到24-well盘子。坚持后,细胞被洗与PBS和固定4%多聚甲醛在室温下20分钟。固定剂的解决方案被与PBS细胞冲洗三次。细胞在4°C处理各自的主要抗体一夜之间,包括anti-CD105抗体(鼠标单克隆,表达载体),anti-CD73抗体(兔单克隆,Abcam)和anti-vimentin抗体(鼠标单克隆,Santa Cruz)。然后细胞孵化与抗体反应的二次共轭荧光素(FITC,杰克逊)或Alexa萤石488(杰克逊)。负控制利用isotype-controlled抗体制备。与PBS洗涤三次后,数字图像与显微镜获得的。
2.6。ELISA
老鼠收集从轨道动脉的血液和血清被离心分离600 g×20分钟。il - 1的水平βIL-17A, TNF -α和干扰素-γ血清中检测到使用Luminex多因素检测技术(eBioscience ProcartaPlex)根据制造商建议的协议。
2.7。组织病理学
老鼠牺牲后,脊髓很快被删除,与中性10%福尔马林48 h后缀。石蜡包埋脊髓横断面图(5毫米厚)在二甲苯脱蜡、水化,然后用苏木精和伊红染色())和快速luxol蓝色(局部反馈)染色法检测组织炎症和髓鞘脱失,分别。盲法的方式进行组织病理学检查,取得了如下(24炎症::0,没有炎症细胞;1、几个分散的炎性细胞;2、血管周围组织炎性浸润;3,广泛的血管周的成套与扩展到相邻的实质,没有明显的成套或实质浸润。髓鞘脱失:0,没有;1、罕见的焦点;2,一些地区的髓鞘脱失;3,大(支流)脱髓鞘。5串行部分的脊髓的八个老鼠每组的得分。
2.8。免疫组织化学
截面(5毫米厚)是用二甲苯脱蜡和一系列分级醇脱水后孵化60°C 1 h。内源性过氧化物酶活动就熄了3%的H2O2,燥热引起抗原决定基检索在柠檬酸钠缓冲。部分是孵化anti-CD3抗体(Abcam,剑桥,英国),anti-CD4抗体(Abcam,剑桥,英国),和anti-CD8抗体(Abcam剑桥,英国)一夜之间在4°C,其次是孵化SignalStain®提高包含IHC检测试剂(合,兔子)(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)根据制造商的指示。最终颜色产品开发SignalStain民建联衬底工具包(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),然后部分与苏木精复染色(Leagene,北京)。图像捕捉到徕卡与徕卡DM6000B DFC300外汇(徕卡微系统有限公司,德国索姆)的放大200倍。六个字段进行评估每个幻灯片(25]。阳性细胞的数量每毫米2脊髓组织是由手工计数Image-Pro + 6.0软件(美国媒体控制论,罗克维尔市,MD) (26]。
2.9。定量实时聚合酶链反应
il - 1βIL-17A, TNF -α和干扰素-γ脊髓的mRNA水平被定量实时PCR分析。通过组织总RNA分离脊髓匀浆使用豆类MiniBEST普遍RNA提取工具包(豆类、Kusatsu、日本)根据制造商的指示。这个过程是RNase-free条件下完成的。总RNA (1μg)使用PrimeScript反向转录cDNA™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类、Kusatsu、日本)根据指导手册。具体记录被定量实时PCR量化使用SYBR®预混料交货Taq™II (TliRNaseH +),火箭+(豆类、Kusatsu、日本)和分析ABI 7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,福斯特,CA)。Gene-specific引物被Sangon合成生物技术(上海,中国),并使用以下引物序列:CTCTCCACCTCAATGGACAGA(向前)和TGCTTGGGATCCACACTCTC il - 1(反向)βCTCAACCGTTCCACGTCAC(向前)和ACACCCACCAGCATCTTCT IL-17A(反向),ATGAACGCTACACACTGCATC(向前)和CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC(反向)干扰素-γGCCACAAGCAGGAATGAGAAG(向前)和GCCACAAGCAGGAATGAGAAG TNF -(反向)α,TGGAGTCTACTGGCGTCTT(向前)和TGTCATATTTCTCGTGGTTCA GAPDH(反向)。mRNA水平正常化GAPDH mRNA水平。PCR作为30秒95°C,执行40周期在95°C 5秒和60°C,持续30秒。相对mRNA表达进行了计算与比较CT方法。
2.10。免疫印迹
神经生长因子的水平,据和BDNF小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎被免疫印迹检测。大脑收集并立即冻结在−80°C。组织匀浆溶解缓冲区,也准备了1 nM PMSF组成。蛋白质变性,等量的蛋白质在12% bis-Tris /聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到PVDF膜。2 h的膜被封锁屏蔽解决方案和孵化一夜之间在4°C主要抗体(Abcam,剑桥,英国)稀释在屏蔽解决方案。接下来,孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体进行室温2 h,并使用增强化学发光免疫反应性被发现。墨迹是乐队的扫描和分析测量强度与UN-SCAN-IT 5.1版本的软件。
2.11。统计分析
用SPSS 18.0软件进行统计分析。所有数据都表示为平均数±标准差。各种群体的平均值的差异由方差分析进行了分析。比较两组之间的数值数据的计算是通过学生t测试。不同之处在于值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。表征hAMC
免疫荧光染色鉴定表明,孤立hAMC表达干细胞特定标记CD105, CD73,波形蛋白(图1)。
3.2。hAMC改善症状和改善小鼠中枢神经系统病理的实验性自身免疫性脑脊髓炎
确定的影响hAMC女士,我们管理hAMC老鼠模型。在古典MOG-induced实验性自身免疫性脑脊髓炎在我们的初步研究中,我们发现1×106hAMC;优化了抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎因此,这对后续的剂量选择在活的有机体内实验。如图2(一个)老鼠,hAMC显著减毒的临床症状实验性自身免疫性脑脊髓炎。意味着临床评分明显低于hAMC组与模型组相比,从20天到实验的最后。此外,我们发现改善体重hAMC组在某种程度上,尽管模型组和hAMC组之间无显著差异(图2 (b))。为了研究小鼠的中枢神经系统病理hAMC实验性自身免疫性脑脊髓炎的影响,我们发现炎症和脊髓脱髓鞘变化)染色法和局部反馈染色,分别。如图2 (c)模型组显示重要血管cuff-like改变和炎性细胞浸润和扩散与正常组相比脱髓鞘。激动人心的是,hAMC治疗可以改善这些病变的严重程度。炎症评分和髓鞘脱失得分明显降低hAMC组相比,模型组(数字2 (d)和2 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。老鼠hAMC抑制促炎细胞因子的生产实验性自身免疫性脑脊髓炎
确定小鼠hAMC在实验性自身免疫性脑脊髓炎的消炎作用,我们研究了几个重要的促炎细胞因子的水平在血清和小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎。如图3(一个)- - - - - -3 (d)、生产TNF -α干扰素-γ,il - 1β小鼠的血清,IL-17A实验性自身免疫性脑脊髓炎显著增加与正常小鼠相比,而hAMC可以显著减少这些促炎细胞因子水平。另一方面,我们也发现这些细胞因子的水平在中枢神经系统实时PCR。结果表明,与模型组相比,hAMC治疗可以显著降低这些促炎细胞因子(数据的水平3 (e)- - - - - -3 (h))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.4。hAMC下降CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎
进一步研究hAMC的抗炎机制,我们发现CD4 + T细胞和CD8 + T细胞在小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎hAMC治疗。免疫组织化学分析显示数字的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞显著增加脊髓从模型组。hAMC治疗显著降低的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞相比,模型组(图4)。
(一)
(b)
3.5。老鼠生产实验性自身免疫性脑脊髓炎hAMC提升Neuron-Repair因素
以前的局部反馈染色显示hAMC治疗可以降低老鼠的髓鞘脱失分数实验性自身免疫性脑脊髓炎,隐含hAMC可能促进remyelination。进一步调查hAMC的作用机理,我们下了几个重要的水平neuron-repair因素(神经生长因子、据和BDNF) hAMC治疗后小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎。可以看到在图的结果5,这表明hAMC治疗可以显著增加神经生长因子的表达,据,老鼠和BDNF在实验性自身免疫性脑脊髓炎。
(一)
(b)
(c)
(d)
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(f)
4所示。讨论
最近,越来越多的证据表明,msc从不同的起源,包括脂肪、骨骨髓来源,和脐cord-derived减弱动物模型(疾病进展的实验性自身免疫性脑脊髓炎27- - - - - -29日]。此外,来源于msc的自体骨移植和同种异体脐cord-derived女士msc移植治疗在临床试验中被证实是安全有效的,这表明,治疗改善了病程,减少炎症反应,促进神经保护(30.- - - - - -32]。尽管msc提供一个独特的方法来治疗MS,如何获得丰富的细胞容易以及如何避免可能的不利影响在临床应用仍严格的挑战。
人类羊膜以前被视为postlabor医疗废物。然而,积累的证据表明这是一个有价值的生物材料,因为它具有两种截然不同的干细胞/祖细胞群:人类羊膜间充质细胞(hAMC)和人类羊膜上皮细胞(hAEC)。hAMC来源于胚胎中胚层,hAEC源于胚胎外胚层。这两种细胞干细胞标志包括CD73和CD105的表达。两种类型的细胞之间的差异是,hAMC表达波形蛋白而不是细胞角蛋白19日而hAEC表达细胞角蛋白19但不是波形蛋白(33]。尽管hAMC和hAEC显示一些类似的属性包括帮助再生和修复受损的组织和器官34),仍然存在一些区别这两种细胞类型,如免疫调节(35]。hAEC已经被报道在女士有免疫抑制和治疗效果,我们想知道hAMC女士也可以用于治疗我们的研究首先证明hAMC可以有效地减弱小鼠的疾病发展实验性自身免疫性脑脊髓炎。因为hAMC易于分离和体外扩张,与此同时,几乎没有肿瘤形成的风险,我们的研究将有助于提供一个替代来源的MSC女士治疗。
尽管女士的原因和发病机制在很大程度上是未知的,当前理论支持女士作为中枢神经系统的自身免疫性炎症性疾病,在T淋巴细胞发挥核心作用[36]。CD4 +和CD8 + T细胞在病变女士得到证实。一方面,各种刺激包括环境因素、感染、炎症和自身免疫反应诱发autoreactive CD4 + T细胞在外围被激活。这些活化的CD4 + T细胞坚持中枢神经系统血管内皮,transendothelial迁移进入中枢神经系统。进入中枢神经系统后,这些细胞被激活的地方和渗透激活抗原呈递细胞(APC),导致后续的炎症过程,最终在脱髓鞘和轴突损伤(37]。另一方面,越来越多的证据表明炎症浸润通常由CD8 + T细胞在绚丽的多发性硬化病变(38]。这些细胞可能是更好的适合调解中枢神经系统损害,因为神经细胞,胶质细胞和星形胶质细胞在中枢神经系统表达mhc i,因此优先被CD8 + T细胞(39]。在我们的研究中,我们发现CD4 + T细胞和CD8 + T细胞都增加了小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎。这些结果与之前的报道一致。hAMC治疗有效地降低了这些细胞的数量,表明其疗效的老鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎至少部分是通过这些细胞的数量减少。
细胞因子功能障碍的反应也在观察动物模型(MS患者和实验性自身免疫性脑脊髓炎40,41]。过度的促炎细胞因子包括il - 1βIL-17, TNF -α和干扰素-γ可以激活各种炎症过程(29日,30.]。以前的研究报道,这些血液中促炎细胞因子过表达,脑脊液,中枢神经系统病变患者(女士31日]。此外,il - 1β缺乏显著减弱小鼠临床症状的实验性自身免疫性脑脊髓炎(27]。因此,这些过表达促炎细胞因子调节生理水平可能有效治疗女士在我们的研究中,我们发现hAMC治疗有效地降低了促炎细胞因子不仅在外围还小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎。
在MS,促进remyelination仍然是一个至关重要的治疗的挑战[42,43]。干细胞在神经修复和神经保护功能被发现和证实,近年来,政府的这些细胞在中风和脊髓损伤实验模型获得成功(44,45]。研究表明,干细胞有神经活动,因为他们不仅可以抑制炎性因子的产量也增加神经营养因子(46,47]。然而,hAMC是否能促进小鼠神经营养因子生产实验性自身免疫性脑脊髓炎仍然是未知的。神经营养因子,包括神经生长因子,据和脑源性神经营养因子,是一个家庭的蛋白质引起的生存,发展,功能的神经元(48,49]。他们的行为通过阻止神经元启动程序性细胞死亡,从而使神经元生存。他们还诱导分化的祖细胞形成神经元(49]。越来越多的证据表明,这些神经营养因子的水平显著降低小鼠和MS患者的中枢神经系统和实验性自身免疫性脑脊髓炎与恶化神经元损伤,这暗示这些神经营养因子水平的增加和/或维护中枢神经系统的生理水平可能是有益的(女士42,50]。实际上,几个相关的准备工作,如神经生长因子滴眼剂注入神经生长因子,已获批准在诊所治疗视神经损伤、脑损伤等。51,52]。在我们的研究中,我们发现,神经生长因子的水平,据,和BDNF水平显著降低小鼠中枢神经系统的实验性自身免疫性脑脊髓炎,这与先前的报道是相一致的。治疗hAMC显示显著增加这些因素的水平。这些结果表明,除了抗炎效果,hAMC也可以促进小鼠神经修复实验性自身免疫性脑脊髓炎。
总的来说,本研究的结果表明,hAMC能有效地抑制炎症和促进小鼠remyelination在实验性自身免疫性脑脊髓炎,部分是通过减少数量的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞,抑制促炎细胞因子的生产以及增加neuron-repair因素的水平。当然,更多的研究仍需要做进一步解释hAMC机制,促进其临床应用。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
小君蜀设计研究,完成了实验,起草了手稿。小娟他设计研究和修订后的手稿。香港,刘薛Xuemei秋铜梁周勾勒,平王,和黄小姐进行实验工作。
确认
这项研究支持部分来自中日友好医院的资助(批准号2015 - 1 - qn - 4)。