文摘
减毒疫苗牛结核分枝杆菌波士顿咨询公司(Bacille Calmette Guerin)对结核病有限的保护效果。更有效的结核病疫苗的开发集中在分枝杆菌引起强大的辅助T抗原1 (Th1)反应。Mtb蛋白质Rv3841 (bacterioferritin B;BfrB)是已知的结核分枝杆菌的增长起到至关重要的作用。然而,目前尚不清楚Rv3841结核分枝杆菌可以诱导保护性免疫。在这里,我们研究了行动的Rv3841成熟树突状细胞(dc)及其参与t细胞免疫的发展。我们发现Rv3841功能激活DCs通过上调costimulatory分子和促炎细胞因子的分泌增加。激活的DCs Rv3841由toll样受体4 (TLR4),其次是触发增殖作用的蛋白激酶和核因子-κB信号通路。此外,Rv3841-matured DCs有效扩散和极化Th1天真的CD4细胞的免疫反应+和CD8+t细胞。此外,Rv3841尤其是CD4的扩张引起的+CD44高CD62L低从Mtb-infected小鼠t细胞;此外,t细胞激活Rv3841-matured DCs抑制胞内分枝杆菌生长。我们的数据表明,Rv3841诱发DC成熟和保护性免疫反应,这一发现可能提供有效的结核病疫苗的候选。
1。介绍
肺结核(TB)要删除的全球健康问题的第一排在任何实际的时间框架,变革工具和项目需要开发(1]。当前许可抗结核疫苗牛结核分枝杆菌Bacille Calmette Guerin (BCG)授予保护不足在青少年和成人肺结核(2]。有效的疫苗在潜伏性感染个体和成人强烈需要。
行动有效的结核病疫苗的免疫模式涉及到immunodominant CD4驾驶+和CD8+t细胞的反应,可以消除入侵的细菌。启动和扩张的主要抗原t细胞结核分枝杆菌(Mtb)感染发生在区域淋巴结,肺,和这些反应是由Mtb-infected从肺部树突状细胞(dc)走私3,4]。另一方面,据报道,Mtb调节受感染的DCs抑制t细胞抗原表达,因此推迟招聘激活t细胞进入肺部淋巴结(5]。因此,有效的结核分枝杆菌DC活化和迁移是必要消除通过一个自适应免疫反应。
DCs是最强大的抗原递呈细胞幼稚t细胞的活化和发挥重要作用的起始中小学对病原体的免疫反应(6,7]。DCs表达不同的细胞表面标记和表型分析大致分类DCs为未成熟和成熟阶段(8]。成熟的DCs显示costimulatory分子的高表达,如CD40、CD80、CD86,以及MHC II级抗原(9]。这个成熟可以由刺激引起,如肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β传染性病原体的)和组件。相关的成熟,许多刺激诱导增殖的磷酸化蛋白激酶(MAPKs),如p38 MAPK、c-Jun n端激酶(物)和细胞外signal-regulated激酶(erk)。然后,MAPK信号通路有明显功能的DC成熟(9]。最近的研究表明,MAPK信号通路调节不同的表象表型成熟,细胞因子的生产,和DCs的功能分化10- - - - - -12]。因此,不同的成熟dc可能引起的调制MAPKs的磷酸化的平衡。
未成熟dc可以捕获和内化分枝杆菌抗原接触surface-expressed受体,如toll样受体(通常)[13]。参与先天免疫反应迅速的通常涉及招聘的细胞质适配器蛋白质和信号分子,导致吞噬体成熟和促炎细胞因子的生产13,14]。许多研究表明分枝杆菌抗原参与先天通过TLR信号识别和响应(15- - - - - -17]。toll样受体激活信号转导级联顺序启动适配器蛋白质骨髓分化因子88 (MyD88)和肿瘤坏死因子受体,最终促进NF -的易位κB和激活MAPKs [18]。
抗免疫反应的关键角色是T淋巴细胞和抗原递呈细胞包括巨噬细胞和DCs。分枝杆菌antigen-activated DCs可能优先CD4开车+辅助T细胞分化成两个辅助T 1 (Th1)或Th2细胞类型,从而控制1型或2型免疫反应的发展(19,20.]。感染结核分枝杆菌的免疫控制是基于1型t细胞反应(21]。il - 12后诱导Mtb通过巨噬细胞吞噬功能和DCs (22,23];这个过程驱动的开发与生产干扰素- Th1反应γ。Th1免疫反应相关控制和控制Mtb复制和包括干扰素γ第或多官能的(- 2、干扰素γ和TNF -α第)CD4+和CD8+T淋巴细胞(24]。尽管许多分枝杆菌蛋白质导致DCs分泌促炎细胞因子已确定(17),DC-activating抗原有良好保护作用对Mtb很少报道。我们假设的蛋白质诱导成熟DCs和Th1免疫反应可用于结核分枝杆菌疫苗潜在的候选人。
结核分枝杆菌蛋白质Rv3841(也称为BfrB,铁蛋白B)是参与铁储存。铁蛋白被认为是重要的参与者在铁储存和解毒过程与Mtb的增长和致病性(25- - - - - -27]。因此,我们认为Rv3841是一个很好的目标,开发抗结核的药物和候选疫苗。在这项研究中,我们报告,承认重组Rv3841 DCs导致这些细胞成熟和推广Th1免疫反应。我们的研究结果表明,由作用于抗原递呈细胞,如DCs、结核分枝杆菌重组Rv3841蛋白质可能调节免疫反应和相关的宿主防御机制。
2。材料和方法
2.1。动物
5 - 6周的年龄,女性C57BL / 6 TLR2基因敲除小鼠(KO), TLR4 KO小鼠C57BL / 6小鼠不能按,OT-II T细胞受体转基因老鼠从杰克逊实验室购买(美国我巴尔港)。所有动物都保持在特定无菌条件(SPF)障碍临床前研究中心(PCRC)忠南国立大学医院,韩国大田市。使用的所有老鼠按照指南护理和使用韩国食品与药品管理局(KFDA)。被许可使用的所有动物实验伦理委员会和机构的动物保健和使用委员会(许可证编号2014-0197-3)实验动物研究中心IACUC忠南国立大学的学校(制度- 00284)(大田、韩国)。
2.2。代的老鼠骨骨髓来源树突状细胞和巨噬细胞
骨骨髓来源树突状细胞(BMDCs)和骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)体外分化从孤立的骨髓细胞感染5-6-week-old C57BL / 6小鼠。生成的细胞和培养最近描述(28]。简单地说,使用BMDC分化方法,从小鼠股骨和胫骨骨髓细胞收集培养7 d RPMI媒体补充10%胎牛血清的边后卫,青霉素和链霉素(100单位/毫升),不必要的氨基酸(0.1毫米),β巯基乙醇(50μ米),丙酮酸钠(1毫米),gm - csf (20 ng / mL), il - 4 (10 ng / mL)。BMDMs分化的骨髓细胞在DMEM培养媒体包含10%的边后卫和20 ng / mL的csf 6 d。
2.3。有限合伙人去污净化Rv3841蛋白质和确认
Rv3841 (BfrB)结核分枝杆菌基因PCR扩大了使用H37Rv ATCC27294基因组DNA作为模板和引物如下:Rv3841向前,5-CATATGACAGAATACGAAGGGCCTAAG-3 ,和反向,5-AAGCTTGAGGCGGCCCCCGGCAGCGTG-3 。Rv3841 PCR产物的克隆与pET22b(+)(美国WI Novagen,麦迪逊)和他在糖基的标记。大肠杆菌BL21细菌携带Rv3841表达质粒与IPTG诱导(异丙基-β-D-thiogalactopyranoside)。His-tagged Rv3841重组蛋白质纯化与Ni-NTA列(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。如前所述(执行净化协议29日]。确认污染,类毒素或有限合伙人的蛋白质纯化与蛋白酶K消化(σ),预处理与多粘菌素B (PmB)(σ),并进行了热变性。
2.4。流式细胞术分析
调查的细胞毒性效应Rv3841 DCs, DCs (1×106细胞/毫升)与10孵化μg / mL Rv3841 24 h。经过24小时的治疗,细胞被沾FITC-conjugated膜联蛋白V从研发系统和π(明尼阿波利斯,美国)。细胞毒性检测根据制造商的指示。然后,样本被检测到FACSCanto二世与使用FlowJo FACSDiva和分析软件(美国或树明星,亚什兰)。调查表面分子,Rv3841蛋白质治疗24小时后,这些细胞被沾PE-conjugated anti-CD80, anti-CD86, anti-H-2Kb(类MHC I),和anti-I-Ab (MHC II级)FITC-conjugated anti-CD11c抗体从eBioscience(美国圣地亚哥,CA) 30分钟在4°C。流式细胞术的荧光测定。
2.5。免疫印迹分析
如前所述(执行免疫印迹(IB)29日]。简单地说,细胞播种10点6细胞/毫升6-well板块有或没有治疗有限合伙人或Rv3841蛋白质。在24小时孵化,细胞收获和细胞溶解细胞裂解缓冲(50毫米三羟甲基氨基甲烷盐酸,液pH值8.0;137毫米氯化钠;EDTA约1毫米;1%(卷/期)特里同x - 100;(卷/期)甘油10%;PMSF约1毫米;1μ克/毫升每个抑肽酶、亮抑酶肽和抑肽素;1毫米Na3VO4;氟化钠和1毫米)。每个样本的细胞溶解产物受到sds - page其次是蛋白质PVDF膜的转移。ECL试剂(微孔)申请免疫污点分析。
2.6。治疗DCs药理抑制剂的信号通路
所有的药理抑制剂都购自Calbiochem(美国圣地亚哥,CA)。二甲亚砜(σ)添加到文化在0.1%(卷/期)作为溶剂控制。抑制剂在下列使用浓度:U0126 (10μSB203580(20米)μSP600125(10米)μ(20米),bay11 - 7082μ米)。测试集中在确定使用DCs的可行性在滴定实验中使用MTT试验。与抑制剂实验,细胞治疗与给定抑制剂在治疗前1 h和蛋白质。
2.7。体外t细胞增殖试验
对t细胞增殖测定,OVA-specific CD4+和CD8+t细胞是孤立的使用mac列(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)不能和OT-II转基因小鼠的脾细胞。然后,这些t细胞是沾染了1μM CFSE(表达载体)。t细胞增殖试验进行最近描述(28]。简而言之,DCs治疗卵巢肽与Peptron(大田、韩国)和10μ克/毫升Rv3841 24 h。之后,Rv3841-activated DCs与CFSE-stained cocultured t细胞在DC: t细胞的比率1:10。coculture 3 d后,每批t细胞与anti-CD4染色+马伯或anti-CD8+从eBioscience马伯通过流式细胞术分析。浮在表面的收获,通过测量从eBioscience elisa。
2.8。结核分枝杆菌细菌,感染小鼠,细胞制备
结核分枝杆菌的毒性菌株H37Rv写明ATCC 27294和无毒株H37Ra写明ATCC 25177从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州)。分枝杆菌都提供国际结核病研究中心(Gyeongsangnam-do旗下期,昌原,韩国)。这些菌株被培养在麦德7 h9肉汤(Difco实验室、底特律、MI)补充0.02%甘油、10%油酸(卷/期)acid-albumin-dextrose-catalase(马里兰州,正欲OADC,火花)25 - 28天在37°C。年龄和sex-matched C57BL / 6小鼠结核分枝杆菌感染H37Ra,和分枝杆菌准备协议执行如前所述[29日]。短暂,每组6周大鼠静脉注射初始感染剂量107CFU Mtb H37Ra。受感染的老鼠安乐死在6周后感染分析免疫反应。CD4+脾脏t细胞分离的H37Ra-infected老鼠使用mac列。
2.9。分析效应/记忆t细胞的激活
记忆响应分析、C57BL / 6小鼠在6周的结核分枝杆菌感染H37Ra如上所述。DCs (2×105细胞/)隔绝WT C57BL / 6小鼠接受Rv3841 24 h紧随其后的是大量的洗涤和cocultured 2×106脾细胞从老鼠Mtb-infected DC: t细胞的比率1:10。coculture 4天,这些细胞被沾PerCP-Cy5.5-conjugated anti-CD4+马伯,FITC-conjugated anti-CD62L马伯,PE-conjugated anti-CD44马伯eBioscience和流式细胞术分析。
2.10。细胞因子的分析
细胞因子在文化量化上层清液使用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)如前所述28]。
2.11。细胞内染色分析
这些细胞被收获,CD4细胞表面抗原染色。洗后,细胞被固定和permeabilized,使用Cytofix / Cytoperm工具包(BD生物科学),然后为T-bet染色,从eBiosciences GATA-3, Foxp3 fluorescein-conjugated抗体。分析了细胞的流式细胞分析仪。
2.12。细菌计数
结核分枝杆菌细胞内生长进行了化验如前所述[28]。简单地说,BMDMs被播种在2×105细胞/在24-well盘子和进一步的结核分枝杆菌感染在莫伊为4 h = 1。与200年感染BMDMs被添加μg / mL阿米卡星2 h后去除细胞外分枝杆菌感染。之后,准备t细胞混合物被添加到每个和孵化3 d。的CD4 t细胞的混合物+3 d的t细胞cocultured antigen-activated DCs (DC: t细胞比例= 1:10)。内化分枝杆菌的数量在BMDM测定赖氨酸感染细胞。细菌计数检查了7日连续稀释h10琼脂(Difco实验室)补充0.05%甘油和10% OADC在37°C。最后3周,菌落(cfu)在板从殖民地的数量计算。
2.13。统计分析
所有实验进行至少三次。样品之间的统计学意义与单向方差分析评估图基紧随其后的多重比较测试使用统计软件(GraphPad棱镜软件,版本5.01;GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。数据代表均值±SEM。 , , 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。净化和Rv3841重组蛋白质的细胞毒性
Rv3841 His-tagged蛋白表达大肠杆菌并通过Ni-NTA亲和层析纯化。的sds - page及免疫印迹分析纯化重组Rv3841图所示S1A。纯化蛋白出现大约25 kDa的主要乐队,这是预期的大小,根据计算分子量对应完整的氨基酸序列。从蛋白质制剂,删除任何污染木糖醇纯化Rv3841是通过多粘菌素B琼脂糖柱的实验。的纯度Rv3841被量量化一个软件(Bio-Rad、大力神、钙、美国)和计算强度除以每平方毫米Rv3841-specific乐队的所有蛋白质的乐队在准备车道上。当20 Rv3841纯度95%μg蛋白的制备受到Coomassie染色的染色。确定Rv3841细胞毒性影响DC成熟,我们测试了Rv3841 protein-induced在DCs细胞毒性治疗细胞1、5、10μg / mL Rv3841 24 h,然后染色膜联蛋白V, propidium碘化评估细胞的可行性。Rv3841没有细胞毒性的浓度为10μg / mL,表明浓度低于10μg / mL不会歪斜后续实验(图印地)。因此,内毒素含量是衡量一个LAL试验和低于15 pg / mL(< 0.1问题(图/毫升)Rv3841准备S2A)。
3.2。Rv3841诱发DC成熟
我们首先测试是否重组Rv3841可以促进dc的成熟。不成熟骨骨髓来源树突状细胞被培养7天准备粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)和il - 4在标准条件下,然后由24小时孵化成熟的1、5或10μ克/毫升Rv3841或有限合伙人(作为一个积极的控制)。因为成熟的DCs和t细胞极化影响DCs的各种细胞因子的分泌,刺激后分泌的免疫调节细胞因子的水平不成熟dc Rv3841测定。我们发现确实Rv3841 DCs分泌免疫调节细胞因子引起的,包括TNF -α,il - 1β,IL-12p70剂量依赖性的方式(图1(一))。然而,il - 10水平在Rv3841-treated DCs没有增加生产。接下来我们分析了DCs的表型改变通过分析各种DC成熟细胞表面标记物的表达。重大upregulation一些表面标记,包括CD80、CD86, MHC类我和MHC II级刺激诱导的DCs与Rv3841浓度的方式(图1 (b))。这些结果表明,Rv3841-induced DC的成熟是一个强有力的Th1免疫反应的催化剂。
(一)
(b)
了多方面的证据表明Rv3841-induced DC成熟并不是由于污染类毒素或脂多糖(LPS)。在所有的实验中,我们使用纯化Rv3841蛋白制剂,通过多粘菌素B琼脂糖列。此外,我们评估了内毒素污染或有限合伙人通过热变性和蛋白酶K治疗或多粘菌素b热变性和蛋白酶K预处理废除Rv3841蛋白诱导DC成熟的能力。多粘菌素B治疗并不影响Rv3841蛋白质的功能,但改变有限合伙人(图的功能开通)。这些结果表明,dc的成熟完整Rv3841蛋白引起的而不是污染类毒素。
3.3。激活MAPK和NF -κB通路Rv3841-Mediated成熟的DCs是必要的
据报道,分枝杆菌antigen-mediated DC成熟是由激活的NF -κB和MAPK通路(10,12]。我们检查了NF -的激活κB和MAPKs Rv3841治疗的反应。MAPKs磷酸化,磷酸化和退化的我κB -α分析了在DCs刺激Rv3841表示时间点(图2)。如图2(一个),ERK1/2 Rv3841触发物的激活和p38。此外,Rv3841诱导我的磷酸化和退化κB -α。这些激酶的功能在DC成熟证实通过特定的药理抑制剂。Rv3841-induced表面分子的表达(CD80和CD86;图2 (b))和(TNF - proinflammatory-cytokine生产α,il - 1β,IL-12p70;图2 (c)显著抑制细胞用p38抑制剂预处理(SB203580) ERK1/2抑制剂U0126,物抑制剂(SP600125),或NF -κB抑制剂(湾11 - 0782)60分钟。这些结果清楚地表明,激活MAPK和KF -κB是生产所需的促炎细胞因子和表达costimulatory分子在Rv3841-mediated DC成熟。
(一)
(b)
(c)
3.4。Rv3841-Induced DC成熟由TLR4介导的
Mtb及其组件遇到先天免疫,通过各种germline-encoded模式识别受体包括toll样受体(通常)各种分子的分枝杆菌(模式识别13,17]。因此,我们测试了Rv3841能否被通过通常在DCs和行动。识别通常与Rv3841交互、DCs WT隔绝,TLR2−−/,或者TLR4−−/老鼠与Rv3841刺激蛋白质。CD86的表达和MHC II类分子(数字3(一个)和3 (b))和促炎细胞因子(图的生产3 (c)在TLR4)−−/DCs刺激与Rv3841 WT或TLR2相比明显较弱−−/DCs与Rv3841刺激。这些结果清楚地表明,Rv3841感应直流TLR4-dependent地成熟。
(一)
(b)
(c)
3.5。Rv3841-Stimulated DCs促进幼稚t细胞增殖和Th1极化
DCs目前被认为是最有效的诱导激活的幼稚t细胞(30.]。现在清楚的是,停止细菌生长与干扰素-的到来γ第Th1-polarized CD4+t细胞(31日,32在肺部,CD4的丧失+t细胞增加屈服于结核病的可能性(30.,33]。可以准确的描述与Rv3841-activated DCs交互t细胞的影响,我们研究了使用不能按鼠标TCR转基因CD8 t细胞增殖试验+转基因CD4 t细胞和OT-II老鼠细胞+t细胞。转基因CFSE-labeled OVA-specific CD4+和CD8+t细胞cocultured Rv3841-treated DCs脉冲肽卵子257 - 264或卵323 - 339扩散显著更大程度上比相同的t细胞cocultured DCs与卵子没有Rv3841治疗但脉冲257 - 264或卵323 - 339(图4)。另外,干扰素的分泌γ和天真的CD4 IL-2-as启动的结果+T和CD8+t细胞通过Rv3841-treated dcs还显著增加,而il - 4水平相当的分泌没有发现不管Rv3841刺激(图4)。流式细胞仪分析还表明,天真的CD4细胞+t细胞的Rv3841-treated DCs显示百分比的增加干扰素-γ阳性细胞相比与未经处理的DCs孵化,而没有IL-4-positive细胞(图中观察到变化S3)。
(一)
(b)
此外,我们发现Rv3841-stimulated DCs T-bet的表达升高,这是一个Th1-specific转录因子,而GATA3的表达,Th2发展至关重要,没有观察到(图5(一个))。我们分析了CD4细胞的分化+CD25+Foxp3+调控t细胞(Treg细胞)的影响下Rv3841-stimulated DCs。Rv3841-treated DCs并不影响调节t细胞的数量(图5 (b))。这些发现表明Rv3841-matured直流提升幼稚t细胞扩散,推动他们走向Th1表现型。
(一)
(b)
3.6。Rv3841-Stimulated DCs诱导效应/记忆t细胞的发展
验证的属性Rv3841 t细胞抗原,我们确定Rv3841-stimulated DCs能否诱导效应/内存CD4的扩张+在Mtb-infected小鼠t细胞数量。我们分析了表面CD62L和CD44 CD4的表达+t细胞用流式细胞术。CD4+从Mtb-infected小鼠的脾脏t细胞在6周postinfection cocultured Rv3841-treated DCs。Ag85B担任积极控制抗原主要因为它是表达结核分枝杆菌在早期感染和被t细胞(34]。如数据所示6(一)和6 (b),Rv3841-treated DCs专门诱导的扩张效应/记忆t细胞通过显著下调CD62L和移植在CD4细胞CD44+从Mtb-infected小鼠的脾脏t细胞与未经处理的DCs或Ag85B相比——或者LPS-treated DCs。另外,干扰素的生产γ由t细胞与Rv3841-treated cocultured DCs与t细胞相比明显高于cocultured与未经处理的DCs或LPS-stimulated DCs。生产- 2通过t细胞cocultured Rv3841-treated DCs明显高于t细胞与Ag85B cocultured——或LPS-treated DCs(图6 (c))。相比之下,通过t细胞il - 4生产cocultured Rv3841或Ag85B-stimulated DCs仍在基线水平。最近的研究表明,自适应免疫反应结核分枝杆菌延迟,包括延迟从肺部树突状细胞迁移到本地淋巴结和随后的互动调控t细胞(3,35- - - - - -37]。因此,我们决定Rv3841-stimulated DCs能否诱导效应/ CD4记忆+t细胞的淋巴结Mtb-infected老鼠(图S4)。有趣的是,我们的研究结果表明,Rv3841-stimulated DCs专门CD62L人口的扩大低CD44高CD4+效应/记忆t细胞的淋巴结Mtb-infected小鼠脾t细胞。虽然感染结核分枝杆菌的适应性免疫反应的发生大大推迟,我们的研究结果表明,Rv3841可以作为一个特定的回忆感染结核分枝杆菌抗原的过程中。这些数据表明,Rv3841-stimulated DCs诱导效应/记忆t细胞的发展和推动Th1记忆在分枝杆菌感染的反应。
(一)
(b)
(c)
3.7。t细胞激活Rv3841-Stimulated DCs抑制胞内分枝杆菌生长
根据上述结果,确认参与Rv3841-stimulated DCs控制的胞内分枝杆菌生长,我们检查了t细胞激活Rv3841-stimulated DCs在巨噬细胞可以抑制细菌生长。脾脏CD4+从Mtb-infected小鼠t细胞激活Rv3841-stimulated DCs对3 d,然后添加到BMDMs。平原的未激活的t细胞明显的抑制胞内分枝杆菌引起的增长。值得注意的是,t细胞激活Rv3841-stimulated DCs显著抑制BMDMs分枝杆菌增长相比,t细胞激活控制或LPS-stimulated DCs(图7(一))。干扰素——的重要性γ和一氧化氮(NO)在分枝杆菌增长良好的控制38,39]。此外,干扰素,γ没有生产,涉及抗细菌活动,增加t细胞激活后明显升高Rv3841-stimulated DCs相比,t细胞激活控制或LPS-stimulated DCs(图7 (b))。这些结果表明,Rv3841-stimulated DCs可以控制通过t细胞激活胞内分枝杆菌生长。
(一)
(b)
4所示。讨论
最重要的结核病亚单位疫苗的发展战略是确定可靠的抗原,可以包括在抗原组合。我们一直在报道,蛋白质激活DCs或巨噬细胞是有前途的候选人为开发有效的结核病亚单位疫苗(28,29日,40]。在目前的研究中,我们证明Rv3841蛋白诱导成熟的DCs和Th1 t细胞的极化。PE_PGRS蛋白质诱导成熟DCs通过TLR2通路和刺激CD4细胞+t细胞反应(16,17]。蛋白质Rv0315 Rv0577诱导成熟和激活的DCs从而增加促炎细胞因子的表达和表面分子参与抗原表达,导致Th1免疫反应(41,42]。此外,最近的一项研究表明,PE27诱发Th1-polarized免疫反应的记忆t细胞通过DCs的功能激活43]。我们之前的研究也表明,Rv2299c-maturated DCs促进Th1和杀菌活性和免疫应答,Rv2299c-fused蛋白疫苗潜在(28]。因此,分枝杆菌抗原诱导激活DCs结核分枝杆菌可能会导致增强的保护性免疫力。由于这些原因,使用多维分离结核分枝杆菌的培养滤液蛋白质,我们已经识别出的蛋白质对DCs或巨噬细胞的影响28,29日,40]。Rv3841是活跃的分枝杆菌蛋白质识别在这些实验。
Mtb Rv3841 B是一个铁蛋白参与铁储存。结核分枝杆菌的收购铁和铁的存储路径执行关键功能的增长,毒性,和延迟25- - - - - -27]。Rv3841和Rv1876 (BfrA)专门从事铁稳态和储存和调节在富含铁和表达下调iron-deprived条件下(44]。因此,Rv3841铁储存和解毒过程中具有重要的作用[25,26]。最近的一篇论文表明,过度Rv3841蛋白质可能是重要的生存和发病机理aminoglycoside-resistant Mtb菌株的调制的影响,阿米卡星、卡那霉素(45]。这些观察表明,Rv3841有关耐药结核病,正如广泛耐药结核可以可以预防。尽管Rv3841被认为是诱发抗原的结核病发病机理,对细胞Rv3841引发免疫反应的蛋白质。我们的数据显示,重组Rv3841蛋白质功能诱导成熟dc的增加细胞表面标记物的表达和促炎细胞因子的生产,这是TLR4-related信号通路的下游效应包括MAPK和NF -κB信号转导。此外,Rv3841-treated DCs(我)幼稚t细胞激活,有效地极化CD4 (ii)+和CD8+t细胞分泌干扰素-γ2、(3)诱导t细胞增殖(图4)。Rv3841-maturated DCs特别扩大人口CD44高CD62L低CD4+效应/记忆细胞在脾脏t细胞来自Mtb-infected老鼠,表明Rv3841充当回忆抗原在Th1反应(图6)。尽管Mtb著称的抗原与宿主细胞相互作用,我们所知,这是第一个报告显示功能和信号机制在DCs Rv3841激活t细胞免疫的作用。干扰素-γ介导抗菌作用通过激活吞噬细胞(46)所以他们快速摄取和降低致病微生物通过激活诱导一氧化氮合酶(间接宾语),促进杀菌剂的生产(38,47]。我们的研究表明,Rv3841-stimulated DCs能诱导干扰素-γ在t细胞生产。增强t细胞激活Rv3841-stimulated DCs在被感染的巨噬细胞没有生产。没有生产是结核分枝杆菌宿主防御的一部分,特别是在小鼠免疫系统(48]。这些结果表明,Rv3841-stimulated DCs保护性免疫反应对Mtb很重要。
总的来说,我们的数据显示,Rv3841提高DCs的免疫刺激性能力促进Th1-polarized TLR4-dependent通路t细胞反应。即使我们没有提供直接证据Rv3841重组蛋白疫苗效果,Rv3841可能是一个很好的目标设计合理有效的结核病疫苗。
这项研究提供了新的数据表明Rv3841可以通过DC成熟驱动Th1-polarized免疫反应。此外,Rv3841诱导Th1-polarized CD4记忆+感染结核分枝杆菌中t细胞反应,这表明Rv3841对结核病有可能作为一个成功的候选疫苗。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Seunga崔崔和Han-Gyu贡献同样这项工作。
确认
本研究支持的基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由科技部,ICT和未来规划(2013 r1a1a2063064和2016 r1e1a1a02921580)。
补充材料
补充1。图S1:重组Rv3841诱发DC成熟。(a)的分析了纯化重组Rv3841蛋白sds - page Coomassie蓝染色(a)和免疫印迹分析使用一个anti-His标记抗体(b)。DCs被表示的浓度激活Rv3841或有限合伙人(100 ng / mL) 24 h。骨骨髓来源树突状细胞(BMDCs)处理表示Rv3841 24 h浓度分析流式细胞术涉及anti-CD11c抗体染色,膜联蛋白V,π。Staurosporine治疗作为一个积极的控制。三个实验的结果是代表。
补充2。图S2:确认纯化Rv3841内毒素去污的。(A)中残留的有限合伙人的数量Rv3841准备估计使用鲎变形细胞溶解产物(LAL)测试根据制造商的指示。(B) dc刺激了Rv3841变性沸腾1 h在100°C或与蛋白酶K消化(PK, 10μg / mL) 1 h在37°C。另外,DCs是使用多粘菌素B (50μg / mL) 1 h之前DCs的刺激。有限合伙人治疗(100 ng / mL)作为控制。24小时后,大量的TNF -α,il - 1β,用elisa检测上清液中il - 6文化。所有的数据都表示为平均数±标准差( ),统计学意义( )是用于治疗与对照组相比,而治疗显示被显示为“没有显著影响n .。”
补充3。图S3: Rv3841-treated DCs刺激t细胞分化成Th1但不是Th2或Treg血统。转基因OVA-specific CD4+t细胞是孤立使用mac从OT-II小鼠脾细胞和cocultured与DCs使用Rv3841 (10 72 hμ克/毫升)或有限合伙人(100 ng / mL),然后与卵子脉冲323 - 339(1μ生产OVA-specific CD4 g / mL)+t细胞。独自一人t细胞和t细胞与未经处理的DCs cocultured担任控制。细胞因子生产然后使用细胞内染色流式细胞仪评估。的平均值±SD ( )所示; , ,或 :治疗组的显著差异(t细胞+卵子从适当的控制323 - 339脉冲DCs),由单向方差分析。治疗没有显著的影响表示“n .。”
补充4。图S4: Rv3841-treated DCs诱导的扩张效应/内存从淋巴结Mtb-infected小鼠t细胞数量。DCs与Rv3841 (10 WT小鼠治疗μg / mL)或有限合伙人(100 ng / mL)然后cocultured Mtb-infected 3天与淋巴结t细胞的小鼠在直流t细胞的比例1:10。t细胞是沾anti-CD4、anti-CD62L anti-CD44单克隆抗体。柱状图显示了闸门的标记t细胞。酒吧图表显示CD62L低CD44高t细胞或CD62L高CD44低t细胞数量。的平均值±SD ( )所示; , ,或 :治疗组的显著差异从适当的控制,由单向方差分析测试。治疗没有显著的影响表示“n。”