文摘

在哮喘气道,重复发生上皮损伤和修复。目前没有治疗直接目标这一过程。我们旨在确定甘露聚糖来源于的影响酿酒酵母(SC-MN)气道上皮创伤修复,体外。甘露糖受体功能的存在表明支气管上皮细胞的内吞作用胶体gold-Man BSA通过clathrin-coated坑16 hbe细胞。在初级正常的人类支气管上皮细胞(NHBEC) SC-MN显著促进伤口关闭。显示治疗SC-MN刺激细胞传播的平均lamellipodial宽度显著增加伤口边缘16 hbe细胞。此外,NHBEC对待SC-MN表明Kruppel-like表达和激活增加的因素(KLFs) 4和5,在上皮细胞生存和转录因子重要epithelial-mesenchymal监管过渡。我们得出这样的结论:SC-MN人类支气管上皮细胞,促进伤口修复涉及甘露糖受体。

1。介绍

哮喘恶化的特点包括炎症、支气管上皮屏障的剥蚀,和焦气道损伤,明显在轻度哮喘患者支气管活检甚至[1,2]。重复上皮损伤和修复的后果不是完全理解,但破坏上皮屏障和上皮功能障碍的开发和维护是至关重要的哮喘症状(3]。这个过程中,引发了各种各样的因素,如臭氧(4),radical-containing粒子(5),病毒感染(6],香烟烟雾[7),和过敏原,最终可能导致气道重塑(3,7]。吸入糖皮质激素可以防止上皮损害在哮喘患者8]。然而,这可能是一个间接的抗炎作用的结果,而不是直接保护或修复功能。Dorscheid等人的一份报告表明,类固醇治疗受伤前体外导致损伤气道上皮细胞的上皮细胞炎症细胞的迁移和伤口关闭和诱导细胞凋亡和上皮细胞9]。的确,目前没有一个急性或控制治疗哮喘专门针对上皮完整性或修复。解决气道代(AHR)据报道,与修复的上皮细胞1,10后可能会持续气道高反应性),而解决人类哮喘炎症细胞(11]。

此外,抗炎治疗就没有显示停止在哮喘疾病进展12]。因此,治疗可以促进上皮修复应该提供辅助治疗对哮喘。

甘露聚糖,polymannose糖蛋白各种细菌和真菌细胞壁的物种,可能导致结构和脂质修饰调节树突细胞的程度甘露糖受体集群、微分细胞因子和后续效应函数(13]。甘露聚糖源自分枝杆菌已被证明在murine-allergic抑制过敏性呼吸道疾病哮喘模型(14]。另一方面,甘露聚糖是从致病真菌可能诱发Th17炎性细胞因子(15]。这与甘露聚糖来自共生的酵母的外墙酿酒酵母(SC-MN),不刺激Th17细胞因子(15]。然而,甘露聚糖的直接影响,从任何来源,在气道上皮细胞,是未知的。在这项研究中,我们表明,人类支气管上皮细胞(HBEC)表达功能的甘露糖受体。我们还提供证据,SC-MN促进伤口愈合的支气管上皮细胞体外,气道平滑肌细胞的抗增殖作用的补充我们先前描述的16,17]。在转录水平上,我们目前的证据表明SC-MN刺激Kruppel-like因素的表达和激活(KLFs) 4和5,上皮细胞分化的关键转录因子,生存和增殖(18]。

2。方法

2.1。细胞培养

基本正常的人类支气管上皮细胞(NHBEC、Lonza Walkersville, MD)或一个永生化人支气管上皮细胞,16 hbe(请提供Gruenert博士,加州太平洋研究所)是培养在6-well盘子,在24-well盘子Transwell插入0.45μm毛孔在液/液界面,或18毫米玻璃盖玻片12-well板块融合在37°C和5%的公司₂。NHBEC培养在基底上皮生长媒体(BEM)补充BulletKit™(Lonza) 37°C和5%的公司₂。

2.2。甘露糖吸收的研究

16 hbe细胞生长在尼龙护套上Transwell文化板块和孵化了gold-labeled mannose-bovine血清白蛋白(10 nm) (ManBSA)或gold-BSA(控制)(按照实验室Inc .,圣马特奥市CA) 30分钟和加工为我们先前描述的电子显微镜17]。

2.3。伤口修复试验

使用吸管提示(5 - 200μl容量),机械的伤势造成井的直径。受伤的细胞培养中含10%胎牛血清(HyClone,洛根,UT)和1%抗生素/抗真菌的解决方案(σ,圣路易斯,密苏里州)。细胞培养与车辆控制(生理盐水,最终浓度:0.005%),SC-MN(大约0.5 - -1.0毫克/毫升,14-28μ米)(σ,准备专利用于哮喘治疗),布地奈德(10⁻⁷- 10⁻⁶米),heat-inactivated (50°C, 3人力资源)beta-hexosaminidase (HI-Hex,甘露糖受体的内源性配体,50 nM, microdialyzed移除硫酸铵和存储在5% glycerin-containing磷酸盐缓冲剂,σ),或结合SC-MN HI-Hex A内毒素水平的这些代理是小于2欧盟/毫升。主要NHBEC是固定的,与结晶紫染色伤口闭合相位显微镜下的整体评估。分析周边区域的剩余的伤口在每张图片进行使用ImageJ软件(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。lamellipodial分析,细胞被固定为3.7%与0.1%甲醛和permeabilized Triton X,其次是与罗丹明染色phalloidin(分子探针,尤金或)根据制造商的协议,然后图像获得使用荧光显微镜(19]。大量的伤口边缘细胞表达板状伪足总额计算,测量和用MetaMorph成像软件(版本4.6;普遍的成像,西切斯特,PA)。

2.4。免疫印迹分析

NHBE细胞溶解产物分析Kruppel-like因素4和5 (KLF4和KLF5)和phospho-KLF4 phosphor-KLF5免疫印迹。蛋白质浓度由布拉德福德决定方法(热科学,罗克福德,IL)和10μg是加载/巷SDS-polyacrylamide凝胶电泳(8%)。墨迹的蛋白质乐队与主要探测(KLF4 (EMD微孔,rb, 1: 500稀释Billerica, MA);p-KLF4 (Ser245) (Abgent rb, 1: 500年,圣地亚哥,CA);KLF5 (rb, 1: 500年,英杰华系统生物学,圣地亚哥,CA);和p-KLF5 (Ser311) (bios Inc . rb, 1: 500年,沃本,马;beta-actin) (mo, 1: 1000年,圣克鲁斯,达拉斯,TX))和适当的二次抗体和乐队强度测量ImageJ1.42软件。

2.5。统计分析

数据值+ /−SD。数据分析使用非参数克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析测试(La Jolla Graphpad棱镜6日,CA)。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。在人类上皮细胞功能甘露糖受体的存在

评估支气管上皮细胞是否表达甘露糖受体,16 hbe细胞种植在24-well Transwell板插入被暴露于胶体gold-Man BSA(10纳米粒度)为30分钟37°C。在控制实验中,这些细胞被对待gold-BSA(图1(一))。电子显微镜检查内源性的细胞显示黄金粒子通过clathrin-coated坑16 hbe细胞的功能甘露糖受体(图1 (b))[17]。

3.2。便利的维修SC-MN在NHBEC机械造成的伤口

甘露聚糖从酿酒酵母增强的伤口在初级NHBEC关闭。SC-MN-treated细胞(1毫克/毫升)显示加速伤口闭合控制相比,文化和budesonide-treated细胞(10⁻⁷米)(图2、图像获得32小时时间点)。布地奈德是用于比较经常因为这个吸入皮质类固醇是用于治疗儿童哮喘。伤口边缘细胞的平均数量表达lamellipodial扩展分析了大功率放大倍数下的在24小时的时间点是5/14(36%)的治疗控制,11/11(100%)为mannan-treated文化,8/14(57%)的budesonide-treated文化。剩下的伤口面积的测量32小时时间点如图3。SC-MN(0.5和1.0毫克/毫升)相比显著促进伤口闭合控制文化与布地奈德治疗的缺乏有益的影响。

3.3。便利的维修SC-MN在16 hbec机械造成的伤口

类似的结果在一个快速增长(图16 hbe细胞3随着时间的推移)当伤口关闭检查。没有显著差异在8小时关闭,而是由13个小时,差异变得明显。在17个小时,SC-MN——或者HI-Hex经处理伤口伤口面积剩余的30%或更少,而剩下的50%或更大的控制文化,分别(数据没有显示)。结合SC-MN(1毫克/毫升)和HI-Hex (50 nM)似乎最大化伤口关闭(图4)。加速16 hbe细胞扩散和迁移是明显的在细胞水平上早在8小时在所有三个条件(甘露聚糖治疗,HI-Hex治疗,这些代理)的组合,控制细胞的相比。图5显示了rhodamine-phalloidin-stained肌动蛋白的图像。平均lamellipodial宽度受伤后伤口边缘细胞的13个小时在SC-MN-treated显著增加(4.47 + /−0.90微米,)与控制16 hbe细胞(1.57 + /−0.59微米,)(),表明增加传播和增强迁移。伤口边缘细胞的整体外观HI-Hex或SC-MN-treated组是符合一个活跃的愈合过程不仅由方向性lamellipodial扩展也向对方伤口边缘(图5)。

3.4。SC-MN效应在NHBE KLF4和KLF5表达和激活细胞

尽管甘露糖受体(MR)在气道平滑肌细胞被激活涉及信号转导途径包括瞬态海拔营(20.),PKC激活(21],ERK1/2激活(22),SC-MN影响上皮修复的机制尚不清楚。来洞察postreceptor机制在转录水平,我们评估是否SC-MN在气道上皮细胞的修复作用涉及转录因子KLF4或KLF5,已知的与细胞分化有关,生存和增殖(18]。甘露聚糖从酿酒酵母(1毫克/毫升)刺激的表达式和磷酸化KLF4和KLF5(图6)最近在NHBEC人力资源时间点。

4所示。讨论

我们目前的证据表明功能先生的家庭成员是人类支气管上皮细胞中表达;这是支持的内吞作用mannosylated neoglycoprotein clathrin-coated坑。这增加了列表的上皮先生:视网膜色素上皮细胞(23和鼻息肉病24]。寻找治疗可以直接影响上皮损伤发生在哮喘,我们发现SC-MN促进人类支气管上皮体外伤口的愈合。SC-MN的愈合主要NHBEC是重大而控制细胞和对比的布地奈德(糖皮质激素)治疗没有改善伤口愈合。哮喘研究beta-hexosaminidases(十六进制和十六进制B)、内源性酶和甘露糖受体已知的配体,一直受到高度纯化酶的缺乏(用于我们之前的准备工作是150 - 170倍的纯商用beta-hexosaminidases相比)(16]。然而,heat-inactivated十六进制,产生类似的对气道上皮愈合作用,进一步支持甘露糖受体的存在在人类支气管上皮细胞。

上皮修复机制包括细胞迁移和增殖,由多种生长因子,趋化因子(MCP-1),细胞因子(il - 1β2、il - 4和IL-13)和前列腺素(PGE2)工作协调与整合蛋白和其他基质材料(纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白)25]。治疗的支气管上皮细胞SC-MN不会产生上述细胞因子(初步未公开的数据)。许多细胞分子因素,如声波刺猬,ρgtpase, MAP激酶通路,STAT3和Wnt [25),导致上皮细胞迁移和增殖。除了促进伤口闭合,SC-MN似乎能够启动人类支气管上皮细胞的定向迁移。然而,的具体机制如何SC-MN指导上皮细胞迁移和增殖的下游先生是未知的。

为了确定气道上皮的潜在机制由SC-MN伤口愈合,KLF4和KLF5表达测定。这些转录因子与分化、存活和细胞增殖。2小时内细胞暴露于SC-MN KLF4表达和激活(磷酸化)是明显的。本协会KLF4表达和激活可能是一个因素在伤口关闭上皮细胞的定向迁移。SC-MN也诱导KLF5表达和激活在最近NHBEC小时(峰值在18小时),和已知KLF5抑制上皮间充质转变由微rna转录(20026]。

本研究存在的局限性对细胞类型和文化系统。主要人类支气管哮喘病人的细胞将进一步提供了洞察力在哮喘甘露聚糖的有益作用;然而,他们是极难获得。此外,文化的NHBEC气液界面模型阐明甘露聚糖对细胞分化的影响。关于SC-MN机制的行动,有可能是甘露聚糖可以通过选择机制在上皮细胞受体介导的现象。例如,它可以作为一个屏障保护与酵母。另一个可能性是内毒素SC-MN,即使是最小的浓度,在上皮细胞可能有一定的影响。

甘露糖受体和其他内生glycan-binding蛋白质,与先天和适应性免疫,调节免疫反应很大程度上代表了未知的机会。先生的糖蛋白内源性配体(β十六进制A和B,也就是娜迦(n -乙酰-βD-Glucosaminidase),唠叨和敌人)升高支气管肺泡灌洗液体豚鼠暴露于臭氧的4)和哮喘病人血清,更在严重的哮喘病患者(27]。此外,糖蛋白基因变异和产生的异常血清水平的各自的糖蛋白与哮喘相关联(28]。尽管特定的甘露糖受体亚型表达的气管支气管上皮细胞尚未确定,存在足够的证据表明存在家庭功能在甘露糖受体。SC-MN是一个吸引人的代理与修复受伤的治疗潜力支气管上皮除已知antimitogenic效应的影响在气道平滑肌细胞(16]。我们得出这样的结论:SC-MN介导直接对人类支气管上皮细胞的伤口愈合,在某种程度上,甘露糖受体的接触。涉及KLF4 SC-MN错综复杂的调节的转录水平和KLF5及其转译后的修改(磷酸化、乙酰化和甲基化)需要进一步调查。

缩写

EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
NHBEC:	正常的人类支气管上皮细胞
KLF:	Kruppel-like因素
ManBSA:	Mannosylated牛血清白蛋白
卵巢:	卵清蛋白
SC-MN:	酿酒酵母甘露聚糖
十六进制:	β己糖胺酶一
你好:	热灭活。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者希望感谢肯尼斯·查普曼博士的科学贡献和朱莉Chang和卡洛琳·斯图尔特的技术援助。这部分工作是支持由Le Bonheur基金会(克里斯托弗·m·水域),NIH-HL56812和NIH-HL090108(贝蒂卢博士),田纳西大学研究Foundation-Cumberland制药与新兴技术(贝蒂卢博士),田纳西大学临床转化科学研究所(贝蒂卢博士),NIH-HL123540和NIH-HL094366(克里斯托弗·m·水域),和NIH-HL079109 (Kafait, Malik)。