文摘
整个群的基因多态性表皮屏障的形成,免疫反应,他们的监管在过敏性表型的形成是很重要的。这项研究的目的是确定的toll样受体基因多态性的关系TLR2和TLR4在特应性皮炎患者的临床和免疫参数在一个“病例对照研究。基因的多态性TLR2 (p.Arg753Gln)和TLR4 (Asp299Gly)被PCR检测。天然免疫与适应性免疫参数的状态评估sIgA当地生产的水平,细胞因子的血清il - 4、il - 10和干扰素-γ。生物样本与过敏病理学50人,4.5 - 35岁,100健康人(控制)进行了分析。观察失调的患者细胞因子(il - 4、il - 10)在生产杂合的多态基因型可能反映了不平衡的Th1 / Th2 / Th17监管这些个体的免疫系统反应。
1。介绍
今天人类变应性疾病被认为是一个具有全球意义的医疗问题导致相当大的减少生活质量和公共卫生。广泛的研究近二十年来在过敏性疾病的发病机理表明,他们与许多基因和环境因素以及这些因素之间的相互作用,所有这些导致一个相当复杂的发病机理和合理治疗相当困难。分子和遗传过去20年的研究表明,有几个数百个基因突变参与过敏性表型的发展(1]。过敏性皮肤炎的情况,例如,有确定重大关联基因多态性对这些基因参与表皮的发展障碍,免疫反应的出现,他们的监管1]。同样重要的是研究不同的基因多态形式之间的关联控制先天和适应性免疫反应在过敏性疾病的发病机理。皮肤屏障功能异常特应性皮炎发病的重要因素,被这问题被大多数研究者们1,2]。toll样受体(TLR)组成的一个团体受体免疫系统参与炎症反应的各种细胞类型微生物抗原(3]。它已经表明,TLR2和TLR4细胞受体参与先天和适应性免疫反应的发展lipoteichoic酸形成的细胞壁的革兰氏阳性细菌和病毒蛋白和LPS的革兰氏阴性细菌4]。大量的研究表明,临床意义的toll样受体2 rs5743708 (c.2258G >)突变(多态性)的特点是与腺嘌呤鸟嘌呤含氮碱基的替换TLR2基因从一开始就在核苷酸2258密码子(错义突变),导致主要氨基酸序列的改变在753位置替换的精氨酸(Arg)和谷氨酰胺(Gln)。rs4986790 (c.896A > G)突变是另一个临床显著的toll样受体4错义突变,产生替代的含氮碱基组成的腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(G)。因此,Asp取代了通用电气在299位置(Asp299Gly)的主要TLR4受体蛋白的氨基酸序列(5]。目前研究的目标(实际上,随机病例对照研究)是阐明如何TLR2和TLR4基因的多态性,编码TLR2和TLR4受体免疫反应系统,与特应性皮炎的临床和免疫学指标。
2。材料和方法
2.1。病人和样品
这项研究被认为是生物样品来自两组个体。第一组是由50个人,包括25人与过敏性皮炎和过敏性皮肤炎25结合过敏性支气管哮喘或过敏性鼻炎。这组患者的年龄范围从4、5到35年。按照现代过敏性皮肤炎的分类、分布研究的患者被诊断如下:(1)特应性皮炎、小儿常见,温和(SCORAD 50 - 89),具有高血清总IgE水平(> 350国际单位/毫升),和不断复发()(2)特应性皮炎、青少年常见的,温和的,(SCORAD 45 - 75),复发,适度高总IgE水平(200 - 350国际单位/毫升)()(3)过敏性皮肤炎,局部,温和(SCORAD 45 - 70),复发,加上持续过敏鼻炎,家庭敏感,总IgE水平> 250国际单位/毫升()(4)过敏性皮肤炎,局部,温和(SCORAD 50 - 65),结合过敏性支气管哮喘,持久的,温和的,没有呼吸衰竭的迹象,家庭敏感,总IgE水平> 280国际单位/毫升()。
性别比例是1:1.5(20男30女)。所有病人的研究属于欧洲组种族,种族,他们是鞑靼人(55%)、巴什基尔语(5%)和俄罗斯(40%)(基于问卷调查结果)。
第二组(对照组)由100人(医务人员)没有过敏性皮炎的症状和年龄在21岁到39年。性别比例是1:1.5包括40岁男性和60岁女性。通过比赛,控制属于欧洲组(100人),民族是鞑靼人(60%)、俄罗斯人(40%)。控制和学习小组选择被性别和民族可比。
2.2。基因分型
p.Arg753Gln的TLR2和TLR4 (Asp299Gly)受体多态性测定聚合酶链反应(PCR)使用“SNP-express”包和电泳检测(非营利组织“Lytech”,莫斯科,俄罗斯)后,制造商的指示。DNA片段的扩增是一个“Tertsik”放大器来完成(DNK-Tekhnologia、俄罗斯)。放大产品分析水平在琼脂凝胶电泳中,视觉效果和成像与图像处理系统一起使用透照器“Biotest-1”(俄罗斯)。从全血白细胞基因组DNA分离,收集口腔上皮细胞与患者知情同意在临床和过敏喀山科研研究所调查流行病学与微生物学(KSRIEM)。基因组DNA分离和净化是通过使用“DNA-express”和“DNK-ekspresskrov-plus”工具(NPO Lytech,俄罗斯)。
2.3。免疫学研究
免疫学研究KSRIEM临床诊断实验室中进行。为了确定先天和适应性免疫的情况下,我们研究了当地生产sIgA,发现血清细胞因子等细胞因子il - 4、il - 10和干扰素-γ。鼻腔分泌物收集用棉签中间介绍鼻外耳30秒,然后添加0、25毫升生理解决方案,离心10分钟1200 rpm沉淀细胞组件,随后收集上层清液和冻结在−20°C。sIgA的浓度和细胞因子的分泌和免疫分析法测定血清样本使用“IgАsekretornyi-IFA-BEST,”“Interleukin-4-IFA-BEST”,“Gamma-Interferon-IFA-BEST,”和“Interleukin-10-IFA-BEST”工具(澡Vektor-Best,新西伯利亚,俄罗斯)根据制造商的建议。
2.4。统计分析
数据的统计分析包括一个测试来估计基因型分布偏离Hardy-Weinberg-Castle法律使用χ2测试与橡胶树的修正。随后,我们构建了一个95%可信区间(CI)的平均值(M)和计算平均值的标准偏差的样本(SD)。不同的量化指标的重要性进行评估t以及对不平等的方差(6]。
3所示。结果
等位基因和基因型的分布TLR2和TLR4受体的多态性检测组符合Hardy-Weinberg-Castle法律和不偏离平衡状态。基因型的分布总体样本TLR2和TLR4受体多态性是如下:纯合子- 91,63%,heterozygous-8, 37%,纯合子突变等位基因- 0%。
等位基因和基因型频率分布的TLR2的多态变量(rs5743708)和TLR4 (rs5743708学习小组)受体基因是与先前的研究在俄罗斯联邦执行的结果在俄罗斯人口(车里雅宾斯克地区)7]。这也符合这些多态性的等位基因和基因型频率分布在其他地理种群(8]。
3.1。出现的频率分布的TLR2受体基因多态性rs5743708测试组
的频率G / G纯合基因型特异反应性皮炎患者是80,0%(40例),而在对照组的健康个体是94,0%(94人)。为特应性皮炎患者杂合的基因型频率在20岁的时候,0%(10例),而在对照组6,0%(6个人);因此,差异显著(χ24 = 7日,价值χ2< 0 01)。因此,我们发现G / G纯合基因型1,17次少的特应性皮炎患者群比健康人的集团,而(杂合的基因型)被发现3,3倍更频繁的在第一组比第二组。
当比较血清细胞因子水平INF-γ特应性皮炎患者对不同基因型,我们检测到细胞因子的显著减少INF-γ(更具体地说,它是1,低5倍的患者有多态(杂合的)基因型)和增加的水平il - 4和il - 10(相应地,1、4和1 8倍;见表1)。组患者的多态基因型,我们发现水平的显著减少sIgA在鼻腔分泌物,1,组中的4倍低于纯合基因型(GG-131年基因型:1μ克/毫升,遗传算法基因型:93 5μg / mL;< 0 05);参见图1。
的多态纯合基因型没有生病和健康个体的样本中找到。一般来说,TLR2基因G等位基因频率在90年,特应性皮炎患者组的0%和97年0%的对照组。此外,(rs5743708)多态性等位基因被发现在10特应性皮炎患者(10 0%)和3健康个体(3 0%)(价值χ2< 0 05)。
3.2。等位基因和基因型频率分布的TLR4受体基因多态性rs5743708测试组
在特应性皮炎患者群TLR4 /一个基因型频率等于87,0%(43人),而对照组91,0%(91人)。的多态的杂合的基因型在特应性皮炎患者7(12 0%)和9个人从对照组(9 0%)(价值χ2 )。我们没有检测到多态纯合基因型在两组。的TLR4基因Аrs4986790等位基因频率的92,94年生病的个人和组的4%,对照组的0%;的突变等位基因频率3,5%在第一组和4中,5%在第二,因此揭示无显著差异(价值χ2> 0 05)。
通过比较血清干扰素水平正-γ在特应性皮炎患者,我们检测到显著减少患者组中细胞因子水平的多态基因型(即。杂合的),1,6倍低于纯合子组水平(见表2)。同时,我们注意到的浓度显著增加血清白细胞介素il - 4和il - 10的杂合的群体,尤其是1、3和1、6倍纯合子组(表中相应的浓度2)。组患者的多态基因型(杂合的组),我们观察到的减少sIgA水平鼻腔分泌物,1,低于4倍的纯合子患者(АА基因型:129 1μg / mL和AG基因型:90 0μg / mL;< 0 05);参见图2。
随后,我们比较了血清细胞因子水平和分泌免疫球蛋白的鼻腔分泌物在特应性皮炎患者组不同基因型TLR2和TLR4基因多态性和对照组(群健康个体没有特异反应性的症状)。
我们发现血清干扰素(INF的水平γ)在健康个体高于特应性皮炎患者的情况(见表3)。此外,有显著差异水平的血清干扰素INF -γ在健康个体特应性皮炎患者比相应的水平有纯合或杂合的基因型(表3)。此外,我们证明,血清il - 4和il - 10水平1组的6倍,但只有生病的个体基因的杂合的基因型多态性认为这里(与健康个体中相应的水平相比)。未发现显著差异在健康人血清细胞因子水平取决于基因型。
当比较血清细胞因子正-γ浓度,显著降低过敏性组的细胞因子水平。它几乎是1.4倍相比,在对照组。这种模式也观察到在健康个体的群体的多态基因型TLT-2受体()和TLR4 ()。血清细胞因子的浓度通常比在这组患者高。当研究正-γ浓度,也发现这个细胞因子浓度更低的特应性皮炎患者群,有多态基因型Toll-receptors,比病人没有多态等位基因的基因型。
过敏性皮肤炎的复发率比较过去3年的子组患者多态杂合的基因型()和一个纯合子的“保护”(GG) TLR2受体证明皮炎的临床事件复发明显更多的记录(两倍,特应性皮炎患者)的子群和TLR2基因的突变等位基因。
4所示。讨论和结论
toll样受体激活导致转录因子在细胞细胞质的发展;随后,这些因素进入细胞核,绑定到基因的启动子元素参与炎症介质和细胞因子的表达,主要组织相容性复合体II类型丰富,costimulating细胞(9]。基因突变的基因编码这种类型的受体与增加的风险免疫介导性疾病,如过敏性皮肤炎、支气管哮喘、过敏性鼻炎,以及自身免疫和肿瘤过程(10]。
的TLR2受体基因位于染色体4。在这项研究中,我们发现了TLR - 2基因rs5743708多态性,它的特点是一个替换的鸟嘌呤(G)和腺嘌呤(一个从一开始)在核苷酸位置2257密码子,这导致更换参数与Gln在753位置的氨基酸序列受体。这种多态性的存在会导致功能障碍的细胞通过TLR2信号通路的激活流程11]。
的频率多态(杂合的基因型),相应的TLR2基因(R753Qrs5743708)多态性等位基因是研究群的高温和的特应性皮炎患者比健康个体的组中对应的频率。可能指定的多态等位基因的存在,据Ahmad-Nejad, P。,2004年的预测更为严重的过敏性皮肤炎(4]。当我们决定患者血清白细胞介素水平包含的杂合的基因型TLR2基因(R753Q,rs5743708)多态性等位基因,我们也发现相当高水平的il - 4和il - 10相比在健康个体和纯合基因型患者,发现没有突变的等位基因。
的TLR4受体基因位于染色体9 (9 q33.1)。作为的结果rs4986790(c.896A > G)错义突变TLR4受体基因,更换Asp与通用电气在299位置(p.Asp299Gly)发生在主要的受体蛋白质的序列,导致中断的配体结合的coreceptor功能TLR4受体,因此诱导细胞应对疲软微生物抗原(12,13]。我们没有找到多态纯合基因型在特应性皮炎患者测试组和健康人的集团。在的情况下TLR4多态的等位基因Аrs4986790,我们没有检测的生病的个人和集团之间的显著差异,健康的人。
过敏性患者遗传多态性(p。参数753Gln, rs5743708) of TLR2 and (Asp299Gly, TLR4, and rs4986790) TLR4, as our study has demonstrated, have higher levels of Th2 cell activation cytokines (IL-4 and IL-10). Cytokine IL-10 is produced by Th2-cells and at present can be considered as an antagonist to several cytokines. In particular, it suppresses IFN-γ生产。此外,它可以抑制T细胞增殖反应的过敏原和有丝分裂原,也抑制了monocyte-activated分泌il - 1β、il - 6和TNF。同时,il - 10刺激IgE分泌和合成。
血清细胞因子水平的研究在我们的调查显示,包含多态性等位基因杂合的基因型患者目前干扰素(INF -浓度较低γ)患者比没有多态等位基因的基因型。有可能是正无穷,较低浓度的干扰素γ在这些患者在中性粒细胞减少细胞因子的刺激效应(即明显)系统,这可能会增加在这些病人易受病毒和细菌感染。减少的激活干扰素的效果INF-γ加上较低的sIgA上呼吸道的水平可能占粘膜的殖民低电阻对条件致病性微生物群和低容量的分泌物中和抗原和微生物的过敏原。
减少皮肤屏障功能和其免疫活性的抗菌特应性皮炎患者中观察到的因素是由许多基因突变影响基因控制细胞因子的合成和toll样受体(2]。
皮肤微生物的稳定性下降,特应性皮炎患者中观察到的,是由突变所产生的免疫调节功能失调的toll样受体,特点是严重的皮炎和难治性形式的发展;同时,它会导致增加的流动过敏原表皮中包含组件,蜱虫(螨)和微生物,这种疾病与当地感染并发症(2,3]。
细胞因子正,γNK细胞产生的积极;它增加的表达主要组织相容性复合体(MHC)二类细胞表面分子,增强先天免疫的吞噬作用和机制。的基线浓度降低细胞因子检测过敏性患者可能在某种程度上由于Th1 / Th2-cell系统的失衡,流行的Th2-activated特异反应性淋巴细胞。考虑这Th1细胞产生的细胞因子,其抑制过敏性的表型可能导致减少基线INF -γ的水平。遗传多态性(p。参数753Gln, rs5743708) of TLR2 and (Asp299Gly, TLR4, and rs4986790) TLR4 genes are probably to contribute to a decrease of cell activation that further modulates a suppressor effect on Th1 cell activation and enables decreased levels of proinflammatory Th1 cytokines. Cells of the Th1 differentiation serve as suppressors of IgE response and IL-4 secretion. This activity of Th1 is mainly associated with IFN-γ。因此,任何因素本身Th1分化抑制Th2和过敏的发展过程。这些因素还包括白介素、干扰素-γ。
最后,高度的调节异常检测到我们的研究生产的细胞因子(il - 4、il - 10)多态杂合的基因型可能反映了患者Th1 / Th2 / Th17失衡调节这些人免疫系统的反应。
因此,我们建立了TLR2基因多态性(p.Arg753Gln,rs5743708)和TLR4基因多态性(p。Asp299Gly, rs4986790) are significant for the pathogenesis of dysregulations in the expression of cytokines by cells (immune system, skin, dendritic cells, and keratinocytes) expressing the TLR2 and TLR4 receptors, which control, differentiate, and regulate the balance of Th1/Th2/Th17 subpopulations of lymphocytes involved in immune responses in cases of atopy. Given that the TLR2 and TLR4 receptors are in a certain way cellular “sensors” able to act when exposed to exogenous stress signals and microbial antigens (pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)), including significant allergens, we claim that the genetic variations of Toll-like receptors can notably influence the susceptibility, severity, and outcome of allergic diseases in humans.
伦理批准
本研究进行了符合赫尔辛基宣言。研究协议是经当地伦理委员会批准在喀山科学研究所流行病学和微生物学(2015)、匿名和所有数据管理。
同意
从所有参与者获得知情同意。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究受到了美国联邦监督服务消费者权益保护和人类福利的研究项目。01201154371”因素,投机取巧的细菌的毒力和各种微生物人类生态系统感染和过敏性疾病的发病机制在儿童和成人。“安东·f·Shamsutdinov支持喀山联邦大学的竞争力增长的计划。