CD8表达CD80⁺T细胞参与pd - l1诱导的活化CD8细胞凋亡⁺T细胞

摘要

肿瘤细胞能够限制抗肿瘤CD8⁺T细胞的反应是通过细胞表面的PD-L1表达。CD8表达PD-1⁺T细胞，PD-L1也与CD8表达的CD80结合⁺T细胞。PD-L1/CD80相互作用对CD8的影响⁺由于T细胞功能尚未完全明确，因此我们试图研究PD-L1/CD80相互作用对PD-L1诱导活化的CD8细胞凋亡的影响⁺T细胞。我们发现CD8⁺缺乏CD80表达的T细胞被激活的程度与野生型CD8相同⁺T细胞，但与抗cd3和PD-L1/Fc蛋白培养时，可激活CD8⁺缺乏CD80表达的T细胞比激活的野生型CD8细胞存活得更好⁺T细胞。这些结果表明PD-L1诱导活化的CD8细胞凋亡⁺T细胞部分通过CD80信号传导。因此，在设计和实施以PD-L1为靶点的检查点阻断疗法时，必须考虑PD-L1、PD-1和CD80的结合伙伴。

1.介绍

检查点蛋白程序性死亡配体1 (PD-L1，也命名为B7-H1和CD274)的细胞表面表达是一种有效的免疫逃避机制，广泛应用于多种肿瘤类型，是多种癌症检查点封锁免疫疗法的靶点[1］.PD-L1通过其受体PD-1和CD80(也称为B7-1)的信号通路抑制抗肿瘤免疫反应，这些受体表达于活化的CD8细胞表面⁺T细胞。PD-L1/PD-1相互作用对CD8的影响⁺T细胞的功能已经被广泛地描述，并且已知可以限制CD8⁺通过抑制TCR信号，从而限制CD8⁺T细胞存活、增殖和细胞因子的产生[2，3.］.PD-L1/PD-1相互作用是检查点阻断疗法pembrolizumab和nivolumab的靶点。这两种药物都是与PD-1结合并阻止PD-L1与PD-1结合的人源抗体，从而消除传递到CD8的负信号⁺T细胞PD-L1 [4，5］.迄今为止，pembrolizumab已被批准用于转移性黑色素瘤、鳞状和非鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌和霍奇金淋巴瘤。Nivolumab被批准用于治疗转移性黑色素瘤、鳞状和非鳞状NSCLC以及肾细胞癌。在这两种药物的临床试验中，大量入组患者表现出持久的反应或肿瘤完全消除[6- - - - - -14］.还有其他检查点阻断疗法，durvalumab, atezolimuab和avelumab，它们结合PD-L1，阻断PD-L1与PD-1和CD80的相互作用。目前，durvalumab被批准用于尿路上皮癌的治疗，atezolimuab被批准用于NSCLC和尿路上皮癌的治疗，avelumab被批准用于默克尔细胞癌的治疗[15- - - - - -18］.随着durvalumab、atezolimuab、avelumab和其他针对PD-L1/CD80相互作用以及PD-L1/PD-1相互作用的药物的设计和实施，有必要更好地了解PD-L1/CD80相互作用如何参与限制抗肿瘤CD8⁺T细胞反应。

PD-L1与CD80的相互作用于2007年首次被发现[19但从那以后就没有被广泛研究过。这种相互作用发生在小鼠和人类，其亲和力比PD-L1/PD-1相互作用弱三倍，比CD28/CD80相互作用强三倍[19，20.］.当鼠标CD4⁺T细胞与平板结合的PD-L1和抗cd3培养，增殖和促炎细胞因子的产生被抑制，即使CD4⁺T细胞缺乏PD-1的表达[19］.这些结果首次表明PD-L1/CD80相互作用可以限制T细胞应答。在相关研究中，当PD-L1/CD80相互作用被抗体阻断，而PD-L1/PD-1相互作用保持完整时，CD8⁺T细胞表现出延长的扩张期和减弱的无能诱导在活的有机体内肽免疫模式[21］.在小鼠同种异体心脏移植模型中，特异性阻断PD-L1/CD80相互作用加速了移植物排斥反应，并导致促炎细胞因子的产生增加[22］.同样，使用非肥胖的糖尿病小鼠模型，PD-L1/CD80相互作用的阻断加速了老年小鼠的糖尿病[23］.综上所述，这些发现表明T细胞表达的CD80可以通过与抗炎和原过敏原PD-L1相互作用向T细胞传递“反向信号”。因此，肿瘤细胞可能具有抑制抗肿瘤CD8的能力⁺T细胞的反应通过PD-1和CD80信号传导。

在本研究中，我们专门研究了PD-L1/CD80信号通路在限制激活的CD8存活中的作用⁺T细胞。在免疫反应中，激活CD8⁺T细胞经历一段膨胀期;然后，在抗原清除后，有一个收缩阶段，在此期间，大部分活化的CD8⁺T细胞因凋亡而死亡。收缩阶段主要是由细胞凋亡的线粒体途径介导的[24- - - - - -26]，我们之前已经证实PD-L1信号通路参与诱导活化的CD8细胞凋亡⁺T细胞在收缩阶段。我们发现，当PD-L1/PD-1相互作用或PD-L1/CD80相互作用被阻断时，可以激活CD8⁺T细胞表达的促凋亡蛋白Bim水平下降[27，表明PD-L1/CD80信号通路在限制活化的CD8细胞存活方面发挥了新的作用⁺T细胞。在本研究中，我们使用CD80缺陷小鼠来证明PD-L1/CD80相互作用有助于PD-L1诱导活化的CD8细胞凋亡⁺T细胞。在设计和实施以PD-L1为靶点的检查点阻断疗法时，这一新的信息非常重要，因为靶向阻断PD-L1与PD-1和CD80相互作用的疗法可能比仅阻断PD-L1/PD-1相互作用的疗法更有效。

2.材料和方法

2．1．老鼠

C57BL/6J野生型(WT)和cd80敲除(KO)小鼠(B6.129S4-Cd80tm1Shr/J)购自Jackson实验室。杂合子CD80-KO小鼠为纯合子CD80-KO小鼠。小鼠在6-12周龄时被使用。研究是按照国家卫生研究院关于在研究中正确使用动物的指导方针进行的，并得到了当地动物护理和使用委员会的批准。

２．２．在体外CD8⁺T细胞的活化与融合蛋白的培养

WT和CD80-KO小鼠的脾脏和淋巴结在6-12周龄采集。用刀豆蛋白A (ConA, 5μg/mL, L7647, Sigma-Aldrich) 48小时。激活后,CD8⁺EasySep CD8从整个细胞群中纯化T细胞⁺T细胞-选择设备,干细胞技术)和孵化了plate-bound PD-L1 / Fc或重组人类IgG1 / Fc(控制/ Fc)融合蛋白(研发系统)48小时的anti-CD3(克隆2 c11, BD生物科学)ConA-conditioned媒体(RPMI 1640中谷酰胺和25毫米玫瑰(Lonza)与10%的边后卫(Gibco),1 U/mL青霉素(Gibco)μg / mL链霉素(Gibco))。活细胞计数采用台盼蓝(Millipore)排除血球计。

2．3.西方墨点法

用含有20 mM Tris、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5% Triton X-100和蛋白酶抑制剂(Millipore)的裂解缓冲液在冰上裂解细胞。0.5×10⁶在每种条件下，细胞被裂解，并在SDS-PAGE凝胶上运行，转移到硝基纤维素(Bio-Rad)，并使用标准程序进行印迹。大鼠抗鼠Bim mAb (3C5)购自Enzo Life Sciences。山羊抗大鼠HRP购自BioLegend。兔抗小鼠肌动蛋白单抗(D18C11)购自Cell Signaling。山羊抗兔HRP购自Bio-Rad。

２.４.流式细胞术分析

样品在BD Accuri™C6流式细胞仪上运行，并用BD Accuri C6软件进行分析。为了进行分析，从活的CD8中提取门限值⁺细胞。抗CD8、CD86和PD-1的荧光标记抗体购自BioLegend或eBiosciences。

2．5．统计分析

一个双面成对的学生t采用-检验评估实验组间的统计学差异。一个p值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

3．1.CD8的表征⁺PD-L1/CD80信号通路缺失时T细胞的活化

探讨PD-L1/CD80信号通路对CD8活性的影响⁺利用CD80-KO CD8存活T细胞⁺T细胞，我们首先需要确定是否CD80-KO和WT CD8⁺T细胞同样被激活。我们使用了一个在体外脾细胞取自naïve WT和CD80-KO小鼠，用ConA激活48小时。然后收集细胞进行分析。CD80-KO和WT CD8⁺如图所示，ConA活化后，T细胞在同等水平下存活1．我们还检测了细胞表面的激活标记物，包括CD86和PD-1的表达，发现CD80-KO和WT CD8⁺之后，T细胞表达了相同水平的这些标记物在体外激活(图2）.因为PD-1在CD80-KO和WT CD8之间的表达是相等的⁺T细胞中，似乎CD80在CD80- ko CD8中的表达有缺陷⁺T细胞不影响PD-1的表达。基于这些发现，我们得出结论:CD8⁺T细胞被激活在体外在没有PD-L1/CD80信号通路的情况下，培养系统也同样有效。

3．2．激活CD8⁺T细胞在没有PD-L1/CD80信号的情况下存活得更好

接下来我们继续研究PD-L1/CD80信号通路对活化CD8细胞存活的影响⁺T细胞。我们用的是同样的在体外用ConA激活如上所述;然后，在获得被激活的细胞后，我们分离出被激活的CD8⁺T细胞，在涂有抗cd3和PD-L1/Fc或对照/Fc蛋白的培养皿上再培养48小时。然后收集细胞进行分析。激活CD80-KO和WT CD8⁺抗cd3和对照/Fc蛋白培养的T细胞在培养后恢复到同等水平，但CD80-KO CD8活性更高⁺抗cd3和PD-L1/Fc蛋白培养的T细胞比激活的WT CD8细胞恢复⁺用抗cd3和PD-L1/Fc培养的T细胞(图3.）.这些数据表明PD-L1/CD80信号通路限制了活化的CD8细胞的存活⁺T细胞。

3．3.Bim的活化CD8降低⁺PD-L1/CD80信号通路缺失的T细胞

我们继续研究PD-L1/CD80信号通路限制活化CD8存活的机制⁺T细胞。CD80-KO和WT CD8⁺如上所述，用抗cd3和PD-L1/Fc蛋白激活和培养T细胞;然后采用Western blotting分析促凋亡蛋白Bim的表达水平。如图所示4(一)，激活CD80-KO CD8⁺与WT细胞相比，抗cd3和PD-L1/Fc蛋白培养的T细胞表达Bim水平降低。这一发现得到了两个独立实验的支持。Western blot中的Bim信号使用ImageJ进行量化，并归一化为肌动蛋白信号，如图所示4 (b)．这表明PD-L1/CD80信号通路有助于诱导活化的CD8细胞凋亡⁺T细胞诱导Bim表达增加。

4.讨论

激活CD8⁺T细胞是一种有效的杀伤细胞，但它本身对细胞凋亡非常敏感。众所周知，PD-L1/PD-1信号通路可诱导活化的CD8细胞凋亡⁺T细胞，但PD-L1/CD80信号通路对活化的CD8细胞凋亡的贡献⁺T细胞还没有得到广泛的研究。在本研究中，我们证明PD-L1/CD80信号通路有助于诱导活化的CD8细胞凋亡⁺T细胞诱导Bim表达增加。我们使用了一个在体外ConA激活系统为我们的研究，并首次证实了CD80-KO和WT CD8⁺T细胞被激活到同样的程度(图)1和2）.我们发现CD80-KO与WT CD8之间没有内在差异⁺激活的T细胞。然后我们继续培养cona激活的CD8⁺T细胞与PD-L1结合，发现CD80-KO CD8⁺T细胞的存活率高于WT CD8⁺T细胞(图3.）.增加了CD8的存活率⁺缺乏PD-L1/CD80信号的T细胞，至少部分原因是Bim表达水平下降(图)4）.

针对肿瘤细胞表达的PD-L1的检查点阻断疗法的目标是重新激活抗肿瘤CD8⁺T细胞反应;因此，充分了解PD-L1信号抑制抗肿瘤CD8的机制至关重要⁺T细胞反应。根据我们的研究结果，如果checkpoint blockade therapy仅抑制PD-L1/PD-1信号通路，而不破坏PD-L1/CD80信号通路，那么肿瘤细胞表达的PD-L1仍然能够诱导肿瘤浸润性CD8细胞凋亡⁺T细胞通过CD80信号传导。也有报道PD-L1限制CD8⁺T细胞应答部分通过抑制PD-1信号下游的糖酵解[28，29］.据报道，PD-L1/PD-1阻断可导致激活的CD8的代谢重编程⁺导致糖酵解速率增加的T细胞。这种代谢开关是由CD8中的PD-L1/PD-1阻断引起的⁺T细胞是由于在缺乏PD-1信号的情况下Akt活化增加。Bim的表达水平也受Akt信号通路在CD8中的调控⁺T细胞(30.]，所以PD-L1/CD80信号通路在影响Bim表达水平的同时，也可能影响CD8的代谢⁺T细胞。继续研究PD-L1/CD80通路对CD8的影响⁺T细胞的功能是必需的。

缩写

ConA:	伴刀豆球蛋白一
非小细胞肺癌:	非小细胞肺癌
PD-L1:	程序性死亡配体1
柯:	基因敲除
WT:	野生型。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

雷切尔·吉本斯·约翰逊构思了这个项目，并负责研究设计和数据分析。Meagan R. Rollins进行了实验，并对研究设计和数据分析做出了贡献。两位作者都起草了手稿。

致谢

这项工作得到了明尼苏达大学研究副校长办公室(研究、艺术和奖学金资助)、明尼苏达大学本科生研究机会计划、霍华德休斯医学研究所大学预科和本科生科学教育计划的支持。特别感谢Brad Mondloch, Ellie Hofer, Matthew Molenaar, Tracie Weber, Alex Stangel, Charlie Peters, Michael Maudal, Richard Bellefeuille, Tristane Paulson, Torri Jordan, Samuel Peters, Tarlynn Tone-Pah-Hote, Mariah Christopherson, Grace Pratt, McKenna Vininski, Mackenzie Schara，和王子Nwaonicha对这个项目的贡献。

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版权

版权所有©2017 Meagan R. Rollins和Rachel M. Gibbons Johnson。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。