文摘
肠道微生物群是人类健康和疾病的一个主要因素。这种微生物群落包括原地(永久居民)和移置(临时居民)微生物,有助于维护肠道壁的完整性,调节反应致病性noxae和代表成熟的免疫系统的一个关键因素。如果这健康的微生物群是打乱了抗生素、化疗,或饮食结构的改变,可能发生肠道致病细菌或病毒的入侵,导致疾病。管理大量的微生物接触,肠道上皮表面产生不同的抗菌肽阿森纳(安培),包括相当大的重要性,β-defensins,直接杀死或抑制微生物的生长。基于文献数据,这项工作的目的是创建一个行肠上皮细胞能够稳定表达的基因编码人类β-defensin-2 (hBD-2)和人类β-defensin-3 (hBD-3),以测试他们的作用美国沙门氏菌感染与细菌感染和他们互动的肠道微生物群。
1。介绍
胃肠道是人体最重要的免疫器官。肠道表面具有战略地位的界面之间的抗原细胞腔的环境和内部环境的主机和经常接触到各种抗原从食物或从不同的病原体。
人类的肠道主机一个庞大而多样化的微生物群落和包含近似地400 - 1000不同种类的细菌,病毒和真菌。这些统称为微生物共生的微生物群。
体内平衡的重要性维护人类健康的肠道微生物群已成为一个话题的兴趣(1- - - - - -4]。共生的细菌调节基因的表达参与了几个主要的肠道和extraintestinal功能,包括异型生物质新陈代谢,产后肠成熟,营养吸收,强化粘膜的屏障,抑制病原物种的生长通过抗菌物质的生产。此外,人类微生物群参与合成的必需氨基酸和维生素(K, B2、B1、B6、B12、叶酸、生物素,和泛酸)吸收的钙,镁,铁,在提取能量从组件的饮食,和脂肪储存的规定(5,6]。
属肠球菌是一群乳酸菌(实验室)作为益生菌的微生物是有争议的7),因为他们有时会与人类感染(8- - - - - -11]。然而,它已被证明,一些肠球菌的菌株,可能在antibiotic-induced平衡肠道菌群失调(12),可以干预antitumoral保护性反应(13和可以有抗病毒活性14]。
感兴趣的是肠球菌都有效,欧洲食品安全局(EFSA)最近建立了新的指导方针,区分有益的或潜在的致病菌株对氨苄青霉素的敏感性和基于特定的遗传标记的存在毒性(esp, hylEfm IS16)。
它已经证明了文化的上层清液大肠都有效病毒在人类肠道上皮细胞在enteroaggregative有很强的杀菌作用大肠杆菌,包括感应膜损伤和细胞溶菌作用[15]。这些细菌的能力产生enterocins是非凡的,而这些可以应用食品biopreservatives [16,17]。事实上,大肠都有效rz C5、天然奶酪隔离有很强的活动李斯特菌monocytogene粘附和入侵Caco-2细胞(18]。
大肠都有效SF68®(NCIMB 10415)存在于制剂作为不同的动物的饲料添加剂(19,20.),因为它能够降低细菌的浓度大肠杆菌和刺激抗炎反应21]。
因此,人类的肠道微生物群有助于维护肠道壁的完整性和密封性,代表对病原体的第一道防线。在这其中,沙门氏菌血清t型yphimurium(美国沙门氏菌感染)是最常见的nontyphoidal之一沙门氏菌(nt)被认为是急性食物感染的主要原因(22]。这革兰氏阴性杆菌可引起严重腹泻、呕吐、发烧,严重病例和死亡,尤其是儿童,老人,和免疫功能不全的患者。
美国沙门氏菌感染可以在宿主巨噬细胞生存和复制和诱导激活NF-kB和促炎细胞因子的分泌,如白介素- 8 (IL) (23)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)[24]。这也有助于炎症与主人的微生物竞争微生物群(25]。
益生菌减弱NF-kB激活肠道上皮细胞和炎症细胞因子的生产在体外(26,27),在活的有机体内(28- - - - - -30.]。
除了作为一个保护屏障,肠道上皮细胞在肠道免疫反应中扮演一个积极的角色通过分泌炎性细胞因子,趋化因子,抗菌肽等β-defensins [31日]。
的家庭β-defensins由小阳离子肽由上皮细胞,Paneth细胞,中性粒细胞,巨噬细胞,本构或由微生物或细胞因子为广谱先天免疫。
人类β-defensin-2 (hBD-2)是一种诱导抗菌肽的分子质量4 - 6 kD和作为内源性抗生素对抗革兰氏阴性细菌,其中肠道的潜在致病微生物(32,33),可以通过内源性刺激诱导,感染,或伤口。
人类β-defensin-3 (hBD-3)在银屑病尺度(34)和表达在皮肤、胎盘和口腔组织(34,35),显示了对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌抗菌活性。对高盐浓度,其抗菌活性结果大于hBD-2 [36]。
hBD-2和hBD-3化学引诱物为中性粒细胞(37)和记忆t细胞,引起组胺释放肥大细胞和前列腺素的合成,也扮演一个角色在过敏反应。
根据使用抗菌肽的日益增长的兴趣自然对病原的防御分子和由于抗生素耐药性致病菌的数量增加,本研究旨在创建一个行肠上皮细胞表达抗菌肽的高浓度hBD-2 hBD-3和评估他们的角色在宿主体内炎症反应造成细菌感染。
2。材料和方法
2.1。克隆
使用高纯总RNA提取RNA隔离设备(罗氏诊断)的主要文化人类角质细胞刺激的有限合伙人铜绿假单胞菌和肿瘤坏死因子-α为了获得高的生产抗菌肽。它随后被转录成互补cDNA使用随机六聚物引物(随机五个一,罗氏)42°C 45分钟,根据制造商的指示。两对简并引物,设计特定的氨基酸序列(hBD-2 5-CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3 ,hBD-2 rev-5-GGAGCCCTTTCTGAATCCGCA-3254个基点;和hBD-3 5-CGGCAGCATTTTGCGCCA-3 ,hBD-3牧师5-CTAGCAGCTATGAGGATC-3),被用来放大,通过rt - pcr、基因编码hBD-2和hBD-3由于“快速上手”项目高保真(罗氏诊断)。扩增程序如下:35周期为1 94°C ,63°C(对于hBD-2)或58°C(用于hBD-3) 1 ,并为1 72°C ;PCR产品254和206个碱基对。
放大DNA片段受到限制和测序分析和克隆到pEF / V5-HIS威尼斯平底渔船(表达载体)向量使用T4的DNA连接酶(表达载体),按照制造商的协议,然后转换成大肠杆菌前10名(表达载体)。
克隆载体,pEF / V5-HIS TOPO-hBD-2和pEF / V5-HIS TOPO-hBD-3,提取细菌培养和扩大使用QIAprep旋转Midiprep工具包(试剂盒)。
2.2。转染
使用IBAfect Caco-2细胞转染试剂(IBA),根据制造商的手册。简单地说,3×105在6-well板细胞被播种,播种后,质粒转染试剂的共轭是补充道。混合物是孵化24和48小时。孵化后,实验的成功验证了通过信使rna的提取细胞治疗和hBD-2 hBD-3基因,PCR的扩增。
浮在表面的游离转染细胞恢复的离心和化验hBD-2和hBD-3浓度的酶联免疫吸附试验(凤凰Pharmaceuticals Inc .)。
杀稻瘟菌素选择、untransfected和转染细胞培养在37°C和5%的股份有限公司214天的杀稻瘟菌素浓度增加以下年代(Sigma-Aldrich): 5、10、20、50、100和200μ克/毫升。然后,MTT-labelling试剂添加最终浓度为0.5毫克/毫升。4小时后,溶解的解决方案是添加到每个好,一夜之间,盘子被孵化。光谱光度测量的吸光度测量使用微型板块(ELISA)读者在波长570纳米。
2.3。菌株
美国血清无性系种群。血清型沙门氏菌感染(写明ATCC®14028 gfp™)培养Luria-Bertani琼脂(英国贝辛斯托克Oxoid, Unipath)。大肠都有效(写明ATCC 27270™)是培养Bacto胰蛋白酶的大豆琼脂(TSA, Difco实验室)。这些菌株被种植在37°C 18 h。
2.4。细胞培养和感染
Caco-2细胞(人类高加索人结肠癌细胞腺癌)经常在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM Gibco)补充Penstrep 1%, 1%谷氨酰胺,10%胎牛血清(英杰公司)在37°C公司5%2。转染后细胞生长在无菌75厘米2浓度的3×10瓶5融合21天达到完整的分化和极化。培养基是改变每两天。
随后,完全分化的细胞被播种到six-well盘子,然后感染指数增长的细菌在感染复数(MOI) 100 6小时(用于基因表达分析)和24小时在37°C (ELISA测定)5%的股份有限公司2在DMEM抗生素。在合并感染的情况下,预培养的一个小时大肠都有效随后的吗美国沙门氏菌感染没有益生菌细菌的去除。
在实验结束时,上层清液的细菌感染和细胞数(cfu)合并感染扩散选择性培养基上连续稀释HiCrome™大肠都有效琼脂基(Sigma-Aldrich)和辉煌沙门氏菌琼脂(OXOID)和孵化在一夜之间37°C。
2.5。实时聚合酶链反应
为了评估职业和抗炎细胞因子的表达,细胞的治疗与无菌PBS洗了三次,并使用高纯总RNA提取RNA隔离设备(罗氏诊断)。
二百毫微克的细胞总RNA被反向转录(扩大逆转录酶,罗氏)互补DNA(互补)使用随机六聚物引物(随机五个一,罗氏)42°C 45分钟,根据制造商的指示38]。实时聚合酶链反应对il - 6、引发、TNF -α,il - 1α,il - 1β,TGF -β与LC由于“快速上手”项目进行了DNA大师SYBR绿色装备使用2μl (cDNA,对应于10 ng总RNA在20毫升的最终体积,3毫米MgCl2, 0.5毫米和反义引物(表1)。放大后,由加热融化曲线分析95°C 15 s温度过渡20°C / s的速度,冷却至60°C 15 s温度转变速率的20°C / s,然后加热样品在0.1°C / s到95°C。结果使用LightCycler软件进行分析(罗氏诊断)。每一对引物的标准曲线连续稀释的cDNA成立。PCR反应都是运行在一式三份。放大产品的特异性是由在2%琼脂糖凝胶电泳验证由溴化乙锭染色和可视化。
2.6。ELISA试验对赞成和抗炎细胞因子
Caco-2单层细胞被感染美国沙门氏菌感染和/或大肠都有效为24小时37°C,如上所述。在实验的最后,上层的收获和细胞因子il - 6,引发,il - 1β肿瘤坏死因子-α,TGF -β分析了酶联免疫吸附试验(ELISA, ThermoFischer科学Inc .)。
2.7。细菌内化化验
Untransfected Caco-2细胞培养被感染美国沙门氏菌感染单独或合并感染美国沙门氏菌感染和大肠都有效如前所述。在另一组实验中,大肠都有效热量被孵化60°C 45分钟和亚文化TSA板块(Difco实验室)一夜之间在37°C证明没有可行的生物存活。杀死细菌制剂在DMEM resuspended没有抗生素和添加到细胞单层的前一个小时美国沙门氏菌感染。2 h后的孵化37°C,单层感染广泛用无菌PBS和进一步孵化两个小时DMEM培养基,并与硫酸庆大霉素(250增补μg ml-1) (Sigma-Aldrich)以杀死细菌细胞外。的实验中,感染的单层膜被广泛在PBS洗细胞溶解的溶液0.1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich) PBS在室温下10分钟数内化细菌。整除的细胞溶解产物连续稀释和镀在华晨沙门氏菌琼脂(OXOID)和孵化37°C一夜之间量化可行的细胞内细菌(cfu /毫升)。效率计算的数量的比率cell-internalized细菌的细菌感染细胞单层膜。
2.8。统计分析
组间显著差异进行评估通过双向方差分析使用GraphPad Prism 6.0。数据表示为意味着±标准差(SD)的三个独立的实验。
3所示。结果
3.1。克隆和转染
rt - pcr的hBD-2和hBD-3基因被成功放大细胞总RNA。正如所料,PCR产品254和206个基点。这些产品在pEF插入效率高/ V5-HIS威尼斯平底渔船向量。
的成功转染克隆产品在结直肠的腺癌Caco-2细胞被rt - pcr验证24和48小时后,48小时后通过ELISA测定细胞上清液(图1)。
(一)
(b)
(c)
3.2。选择杀稻瘟菌素和细胞生存能力
毒性曲线进行转染和untransfected细胞显示的最佳抗生素浓度选择稳定的克隆是200年μ克/毫升。这些数据也支持细胞可行性分析的结果(见补充资料在网上https://doi.org/10.1155/2017/6976935)。选择克隆被培养为一个额外的21天来获取他们的分化,由极化特征和微绒毛的形成。
3.3。评估宿主炎性反应
感染后untransfected和hBD-2——或者hBD-3-transfected Caco-2细胞大肠都有效和/或美国沙门氏菌感染,我们检查主机响应通过评估促炎细胞因子il - 6的表达,引发il - 1α,il - 1β和抗炎细胞因子TGF -β通过实时PCR。
获得的数据表明,细胞转染和hBD-2 hBD-3基因和感染美国沙门氏菌感染显示一个较小的促炎细胞因子的表达而untransfected控制。相反,Caco-2细胞的感染大肠都有效结果只有在表达略有增加促炎细胞因子和抗炎细胞因子的增加TGF -β更明显的抗菌肽的存在;这些数据确认大肠都有效并没有作为一种病原体,没有诱导炎症反应的增加(图2)。
(一)
(b)
此外,在合并感染美国沙门氏菌感染和大肠都有效,已经显著减少促炎细胞因子的表达水平显示在转染细胞感染美国沙门氏菌感染就更为明显,这表明抗菌肽增强了益生菌抗菌活性(图3)。
(一)
(b)
这些数据也证实了ELISA测定蛋白质。
3.4。细菌生存能力评估
为了测试抗菌肽的毒性美国沙门氏菌感染和大肠都有效的上层清液合并感染细胞受到连续稀释和镀选择性的媒体。
我们的研究结果表明,hBD-2和hBD-3具有选择性毒性美国沙门氏菌感染,没有干扰的增长大肠都有效(表2)。
3.5。的影响大肠都有效和安培美国沙门氏菌感染侵袭性
预培养的untransfected Caco-2细胞生存大肠都有效显著的影响美国沙门氏菌感染内部化,减少45.8%。相反,与heat-killed预处理大肠都有效不会干扰病原体的入侵能力(图4)。
4所示。讨论
先天免疫,尤其是通过抗菌肽(安培),在维护中发挥着关键作用防止病原体之间的平衡和正常微生物宽容;安培是结构异构肽两亲的自然隔绝各种各样的生物,植物,昆虫,两栖动物,哺乳动物,能够杀死细菌,真菌,病毒迅速。其中,人类β-defensins已收到相当大的兴趣。这些多肽是由上皮细胞结构上,或由于某些刺激微生物或细胞因子等。Defensins能够吸引中性粒细胞等炎症细胞,T细胞,巨噬细胞,上皮细胞能释放炎症介质如白介素、引发和il - 1β,以及不稳定的微生物膜;此外,他们有能力改造的组织和绑定有限合伙人。
特别是,β-defensin-2 (hBD-2)和β-defensin-3 (hBD-3)存在于各种上皮细胞,如皮肤(39,口腔40),鼻旁窦、牙龈41),角膜(42),肠道、呼吸道和泌尿生殖上皮(31日),并显示对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌和真菌抗菌活性。
据估计,整个人体微生物的数量现在相当于约100万亿个细胞,十倍人类细胞的数量,建议他们比我们自己的独特的基因编码100倍基因(43]。他们中的大多数是肠道微生物群的组件,其中包含从1000年到1150年,普遍的细菌种类,发挥核心作用在人类健康43,44]。
这个社区定义为“代谢器官,”扮演了一个主要角色在维持体内平衡通过干预调节代谢和营养,生理和免疫功能。
在第一阶段的工作,我们致力于创造,通过克隆和基因转染技术,一行肠上皮细胞(Caco-2细胞)表达hBD-2和hBD-3基因。这允许我们评估这些肽在保护肠上皮细胞的作用美国沙门氏菌感染,单独或合作大肠都有效的主要组件之一,它是人类肠道微生物群(45,46]。
第一个数据从cfu /毫升数获得感染和合并感染后显示有一个标志着殖民地的数量减少美国沙门氏菌感染相比untransfected细胞转染细胞,而殖民地的数量大肠都有效保持不变,这表明抗菌肽有选择地对病原体进行杀菌剂的活动。
粘膜表面都内衬上皮细胞之间形成一个屏障潜在的病原微生物和宿主组织。这一层的渗透入侵细菌最初导致急性炎症反应,这是当地的一个特点积累多形核白细胞。感染病原菌后,在粘膜表面的上皮细胞可以分泌的化学介质,如促炎细胞因子和化学引诱物构成的监测和预警系统的底层粘膜免疫和炎症细胞(47]。然而,在网站哪里有生理上高细菌浓度由于居民的微生物菌群,也就是说,结肠,细胞因子的生产紧密依赖于细菌侵袭性,因为只有入侵细菌诱导细胞因子分泌(48- - - - - -50]。
在这其中,il - 6、il - 1、TNF -α高度表达在大多数炎症状态,通常被认为是治疗干预的目标。
引发趋化因子也被认为是急性炎症的早期信号,因为它是由肠上皮细胞分泌的细菌入侵后,和积累的粘膜上皮细胞层引发响应效应细胞所在。此外,它已被证明,引发血清的存在是新生儿细菌感染的诊断标记(51,52]。
获得的结果表明,炎症反应在hBD-2 -修改和hBD-3-transfected细胞对untransfected细胞,自促炎细胞因子il - 6的表达,引发,TNF -α,il - 1α,il - 1β是大大降低,而抗炎细胞因子的表达TGF -β是增加了。这些数据表明潜在的入侵和炎症美国沙门氏菌感染在抗菌肽的存在显著降低。
实验untransfected合并感染的细胞美国沙门氏菌感染和益生菌大肠都有效显示的大肠都有效,沙门氏菌感染引起更强烈的炎症反应,这证实了入侵检测数据的存在大肠都有效导致减少的内化美国沙门氏菌感染了45.8%。不过,更有趣的结果是,减少由于存在炎症反应的程度的大肠都有效进一步降低在转染细胞,也就是说,在高浓度的抗菌肽的存在,表明抗菌肽可提高有益的益生菌活动。
在我们的实验系统,安培的能力显著降低感染的炎症反应和细胞合并也是由于他们杀害活动沙门氏菌,也证明了计数cfu /毫升后合并感染,病原体的浓度大大减少的安培的存在对untransfected细胞。安培可以认为,在未来,作为一个新类的治疗,因为他们有能力产生较小的阻力和有选择性的抗菌活性保护主机不需要免疫系统内存(53]。拥有一个在体外系统将产生这些蛋白质将使我们更好地阐明了这些不同的行为机制。
的利益冲突
作者宣称他们没有关于这篇文章的出版的利益冲突。
确认
这项研究得到了MIUR, PON03PE_00060_3项目。
补充材料
转染的介绍过o。d。邓肯的表显示值和untransfected在存在blasticidine浓度增加。
