文摘

铜绿假单胞菌肺部感染是一项主要挑战全球卫生保健系统,因为它们通常与高发病率和死亡率相关。在这里,我们证明a和b型鞭毛蛋白的保护效果(二价鞭毛蛋白)对小鼠急性致命的肺炎。小鼠免疫鼻内二价鞭毛蛋白疫苗被鞭笞株不同的挑战铜绿假单胞菌在一个急性肺炎模型。除了疫苗的保护作用,我们进一步测量主机先天和细胞免疫反应。免疫小鼠对菌株在我们的研究中受到保护。值得注意的是,活跃的免疫a或b型鞭毛蛋白显著提高小鼠的生存与异种的应变比鞭毛蛋白抗血清a或b。我们还表明,在鼻内的挑战铜绿假单胞菌应变,中性粒细胞被雇来接种小鼠的航空公司,而二价鞭毛蛋白疫苗被证明是保护性的CD4细胞生成⁺IL-17⁺Th17细胞。总之,二价鞭毛蛋白疫苗可以提供保护对不同菌株的铜绿假单胞菌引起的急性肺炎小鼠模型有效的细胞和体液免疫反应,包括增加IL-17生产和改善opsonophagocytic杀死。

1。介绍

铜绿假单胞菌肺部感染是一种危及生命的并发症常常引起菌血症和败血症和免疫功能低下的患者住院1,2]。此外,广谱抗生素的广泛和经验用在重症监护单位导致连续出现耐多药(MDR)铜绿假单胞菌菌株对临床治疗和现在的一个重大挑战贡献显著增加发病率和死亡率(3]。感染耐多药的高死亡率和患病率铜绿假单胞菌压力伴随着新的有效的抗生素类存在的缺乏独特的挑战,临床医生和突出设计新的治疗方法的必要性,免疫疗法等目标pathogen-specific毒性因素诱导多药耐药性的情况下降低发病机理(4,5]。此外,复杂的铜绿假单胞菌基因组编码大量抗原,表明免疫疗法使用单一抗原并不能提供足够的保护。

到目前为止,大多数铜绿假单胞菌疫苗集中免疫和治疗目标pseudomonal毒性因素,如有限合伙人O抗原(6),外膜蛋白F和我7),或III型分泌系统组件PcrV [8),已经在文献中描述传统的保护机制,即抗体介入opsonophagocytic杀戮和/或抗体介入毒素抑制。最近,研究表明,Th17细胞提供保护至关重要铜绿假单胞菌通过快速招募中性粒细胞肺炎的航空公司没有opsonophagocytic抗体(9,10]。这些研究表明,一个有效的疫苗对各种提供全面的保护铜绿假单胞菌感染在不同的组织可以诱导多种细胞和体液效应器。

大多数的临床分离株铜绿假单胞菌是运动型的帮助下一个极性鞭毛,这是必不可少的系统性传遍殖民的器官从最初的网站11]。鞭毛的鞭毛蛋白是蛋白质的主要组成部分,它是分为两个截然不同的血清型a和b (12]。此外,鞭毛蛋白的保守域强烈抗原和作为其分子模式(PAMP时),产生一个强大的NFκB-mediated炎症反应通过toll样受体5 (TLR5)信号转导13]。几项研究已经显示出强烈的鞭毛蛋白免疫原性启动一般招聘的T细胞和B细胞次级淋巴站点,诱发TLR5⁺,CD11c⁺,T细胞样的相似的抗原识别(14,15]。由于TLR5兴奋剂鞭毛蛋白的活性,他们发挥了重要作用,有效的佐剂来增强保护体液反应(15,16]。几个在活的有机体内研究不仅展示了鞭毛蛋白的重要性作为一个至关重要的毒力因子导致肺部感染的发病机制也验证了它们作为目标抗原免疫(17- - - - - -22]。免疫接种a或b型鞭毛蛋白能预防肺部感染(23],角膜炎[24)、泌尿道和烧伤伤口感染(25]。这些研究已经证实,鞭毛蛋白提供的保护是非常特定类型和两种类型的鞭毛蛋白的存在是至关重要的。我们最近研究的结果(20.,26]演示鞭毛蛋白所提供的保护铜绿假单胞菌烧伤感染通过感应IL-17鼓励我们学习的主动和被动免疫策略使用双价鞭毛蛋白为了对各种提供全面的保护铜绿假单胞菌临床分离株急性致命的肺炎模型。

2。材料和方法

2.1。菌株

铜绿假单胞菌菌株PAK和PAO1用于a和b型鞭毛蛋白的纯化蛋白质,分别。

2.2。动物

女性6-8-week-old BALB / C小鼠购自巴斯德研究所(德黑兰,伊朗)。动物实验都遵守制度动物保护委员会(IACC)的关于动物研究的使用指南。

2.3。重组蛋白的制备

a和b型鞭毛蛋白重组蛋白纯化的大肠杆菌BL21 (DE3)携带pET-28a向量如前所述27,28]。

2.4。免疫接种的老鼠

小鼠免疫鼻内(i.n)如前所述。短暂,老鼠被混合氯胺酮麻醉(6.7毫克/毫升)和甲苯噻嗪(1.3毫克/毫升),然后接种将10μl混合鞭毛蛋白(1μ每个鞭毛蛋白g)或鞭毛蛋白(2μ(2 g)或鞭毛蛋白bμg),或者在每个鼻孔PBS每周间隔。在几个发表铜绿假单胞菌疫苗研究,PBS被用作控制(9,29日- - - - - -31日]。在42天,老鼠挑战i.n. 2×10⁷CFU的铜绿假单胞菌菌株直接进入每个鼻孔,如前所述23]。此外,从每组五个老鼠都牺牲在感染后24小时。然后肺、肝、血,脾是收获细菌负荷枚举。支气管肺泡灌洗液(BALF)收集6和18 h感染后CFU的定量,中性粒细胞,IL-17细胞因子。被动免疫小白鼠注射intraperitonealy (i.p)。200μl二价鞭毛蛋白的抗体,或鞭毛蛋白,或鞭毛蛋白b 12 h之前和之后的挑战。所有的老鼠都密切关注一周。

2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)

确定特定抗体的水平(总免疫球蛋白、IgG1和IgG2a)在小鼠血清,ELISA与板涂上执行一个活细胞铜绿假单胞菌菌株PAK PAO1或混合鞭毛蛋白(如前所述20.]。简单地说,100年μl的铜绿假单胞菌菌株PAK PAO1或混合鞭毛蛋白孵化一夜之间在4°C,用0.5% Tween-PBS (T-PBS),和阻塞PBS + 3%牛血清白蛋白(Sigma-Aldrich)。表示从免疫小鼠血清的稀释孵化一夜之间在4°C和T-PBS洗3 x,和100年μl(1: 7000稀释辣根peroxidase-conjugated山羊anti-mouse(合;Sigma-Aldrich)孵化(1 h, RT)。与T-PBS盘子然后洗五次,三甲的衬底(Sigma-Aldrich添加(100)μ信用证;30分钟。在RT)。血清浓度IgG1和IgG2a亚型对混合鞭毛蛋白测定如上所述,除非我们使用100年μ信用证的免疫球蛋白g subtype-specific HRP-conjugated二级anti-mouse IgG1,或IgG2a抗体(Sigma-Aldrich)稀释1:8000年0.5%的脱脂牛奶/ T-PBS。

2.6。细胞增殖和细胞因子的测量

淋巴细胞增殖试验、ELISA板与1×10被播种⁵T细胞,1×10⁵辐照(1500 rad)从天真的小鼠脾细胞分离抗原呈递细胞(apc),和1μg的鞭毛蛋白,或鞭毛蛋白b抗原,而其他组包含1μ每口井的g anti-CD4 anti-CD8,老鼠免疫球蛋白同形像(所有来自BD生物科学)抗体。RPMI 1640包含10%的细胞都培养heat-inactivated的边后卫。在孵化后24 h和72 h, T淋巴细胞增殖试验进行了使用5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU;罗氏公司、德国)根据制造商的协议。同时,IL-17水平测量通过检查脱细胞培养上清液使用特定ELISA测定(研发系统)。

2.7。免疫效应器的损耗

免疫细胞子集被耗尽(描述32]。为在活的有机体内CD4和CD8 T细胞,T细胞耗竭,CD4-specific马伯(GK1.5;BD PharMingen)或CD8-specific马伯(53 - 6.7;BD PharMingen)鼻内和腹腔内接种(100μg /剂量和500年μg /剂量,resp)。72年,前24小时细菌挑战。损耗的目标细胞类型被随后的流式细胞仪分析证实,各自显示> 98%损耗的细胞类型。多克隆抗体对小鼠IL-17是由免疫兔子在多个皮内站点鼠标重组IL-17(研发系统)与CFA混合,如前所述[33]。亲和色谱法(使用蛋白G)用于分离anti-IL-17从整个血清免疫球蛋白,根据制造商的说明(美国热费希尔科学)。IL-17这个抗体是特定的,由ELISA,但没有交叉作用2、干扰素-γ、il - 4、il - 10、IL-5或IL-13。这些实验中使用的控制抗体是免疫球蛋白比例从正常兔血清G亲和色谱法纯化的蛋白,如上所述。IL-17损耗研究使用anti-IL-17免疫球蛋白g(1毫克i.p。)或控制免疫球蛋白前连续3天老鼠挑战铜绿假单胞菌菌株所描述的李et al。34]。

2.8。Opsonophagocytic活动分析

(描述的进行分析20.,25]。简单地说,在100年无菌微型离心机管进行化验μl每个组件的多形核白细胞(中性粒细胞;2×10⁹细胞),铜绿假单胞菌菌株(5×10⁷cfu)、婴儿兔血清和稀释的抗体。一般来说,≥50%的免疫血清调理素的屠杀活动被认为是生物重要的(10]。

2.9。运动性抑制试验

分析进行描述(20.,25]。短暂,抗体被添加到运动性琼脂(磅为0.3% (w / v)琼脂)24-well板块(他一一Bio-One,德国)。铜绿假单胞菌菌株(OD_600年= 0.2)被添加到每个盘子的中央井和孵化37°C。少意味着细菌菌落的直径与夏普和扭曲的戒指在孵化后测量18 h。

2.10。统计分析

所有统计分析使用GraphPad棱镜6 (GraphPad软件公司,美国)。非参数分析的数据克鲁斯卡尔-沃利斯随后邓恩的多重比较测试。参数方差分析进行评估的数据图基的多重比较测试。所有的结果都表示为平均值±标准偏差(SD)。生存率较被用来比较不同治疗之间kaplan meier老鼠组。< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。

3所示。结果

3.1。二价鞭毛蛋白的免疫保护效果

确定二价鞭毛蛋白疫苗的保护效果铜绿假单胞菌菌株,免疫小鼠挑战i.n.鞭毛的不同铜绿假单胞菌。如数据所示1(一)和1 (b)、鼻腔免疫与二价鞭毛蛋白免受致命的肺炎由于PAK生存(100%)和PAO1生存(91.66%)和生存率均显著地高于老鼠与PBS管理( )。鞭毛蛋白a-immunized老鼠明显保护( )从杀伤力与同源菌株PAK挑战后的存活率为91.66%,而58.33%不等的应变PAO1(数字1 (c)和1 (d))。鼻腔免疫与鞭毛蛋白b导致83.33%的保护作用同源菌株PAO1不等的PAK挑战比例为41.66% ( ;数据1 (e)和1 (f))。然而,提供不同的保护通过鞭毛蛋白或鞭毛蛋白b免疫显著高于对照组。

此外,我们评估被动免疫的功效与二价鞭毛蛋白抗血清,或鞭毛蛋白,鞭毛蛋白b -或PBS-immunized老鼠铜绿假单胞菌菌株。二价鞭毛蛋白抗血清完全保护小鼠免受挑战PAK生存(75%)和PAO1(83.33%的生存;数据1(一)和1 (b))。转移的鞭毛蛋白抗血清对同源菌株表现出显著的保护作用作用PAK(83.33%的生存, ),但只有部分保护作用对不同的应变PAO1(25%,生存数据1 (c)和1 (d))。被动免疫与鞭毛蛋白b显著保护免疫小鼠对同源菌株PAO1(75%的生存, )与异种的应变PAK相比(16.66%生存,数字2 (e)和2 (f))。然而,提供不同的保护通过抗血清鞭毛蛋白或鞭毛蛋白b显著高于对照组( ;数据1 (c),1 (d),1 (e),1 (f))。

3.2。调理素的屠杀活动二价鞭毛蛋白免疫血清

检测血清抗体的功能活动所提供的保护,二价鞭毛蛋白疫苗,我们评估了在体外调理素的屠杀活动获得的混合血清免疫小鼠3周后第三(最后)鼻腔免疫。如图3,二价鞭毛蛋白抗血清的稀释1:10显著提升的吞噬作用铜绿假单胞菌菌株PAK(82.70%)和PAO1(86.23%)与对照组小鼠的血清分离( )。鞭毛蛋白的抗血清免疫血清显示明显高于对同源菌株PAK杀死能力(78.61%, )与PAO1应变相比(33.56%,图3)。鞭毛蛋白的血清b-immunized小鼠显著杀活动对同源菌株PAO1 (80.59%, ),针对不同的应变与PAK(24.27%,图3)。然而,鞭毛蛋白的调理素的屠杀活动a或b鞭毛蛋白抗血清对异种的应变明显高于血清从控制老鼠( )。

3.3。Antimotility活动二价鞭毛蛋白免疫血清

我们评估的功能活动二价鞭毛蛋白免疫血清抑制不同鞭毛的能动性铜绿假单胞菌菌株。如数据所示4(一)和4 (b),二价鞭毛蛋白的免疫血清的稀释1:300或更少完全抑制的能动性铜绿假单胞菌菌株与控制( )。对鞭毛蛋白抗血清的稀释1:300或更少的完全抑制同源菌株的活性( ),但有一些大不同的应变( ;数据4(一)和4 (b))。鞭毛蛋白b抗体的稀释1:300或更少的运动性抑制同源菌株PAO1显著多于不同的应变PAK ( ;数据4(一)和4 (b))。

3.4。二价鞭毛蛋白引起的特异性抗体

评估的体液反应诱发二价鞭毛蛋白疫苗,我们比较血清免疫球蛋白水平免疫小鼠挑战PAK或PAO1压力。虽然prechallenge免疫球蛋白水平的老鼠注射二价鞭毛蛋白对整个活细胞铜绿假单胞菌菌株或混合鞭毛蛋白相似,感染后血清免疫球蛋白水平显著增加PAK或PAO1菌株感染( ;数据5(一个),5 (b),5 (c))。免疫球蛋白浓度测定接种小鼠的血清a或b型鞭毛蛋白显著增加挑战后的同源菌株相比,在不同的应变铜绿假单胞菌感染( ;数据5(一个),5 (b),5 (c))。类似的结果当IgG1亚型检查(图5 (d))。中二价flagellin-immunized老鼠,效价提高没有显著差异对混合鞭毛蛋白被观察到在特定IgG2a亚型和postchallenge PAK或PAO1,分别为( ;图5 (e))。小鼠免疫IgG2a水平a或b型鞭毛蛋白显著减少后的挑战与异种的老鼠相比,挑战不同的应变( ;图5 (e))。二价鞭毛蛋白诱导抗原抗体的效价与鞭毛蛋白引起的a或b,这表明没有干扰每个疫苗组件中诱导保护性抗体(数据没有显示)。

3.5。双价鞭毛蛋白疫苗引起的T细胞反应

测试是否候选疫苗可以诱导淋巴细胞增殖,我们分析了刺激指数从免疫小鼠脾T细胞。如数据所示6(一)和6 (b),有一个更高的二价鞭毛蛋白的免疫T细胞增殖水平鞭毛蛋白一个或鞭毛蛋白b 24和72 h与T淋巴细胞与对照组相比( ),这意味着接种疫苗可以刺激T淋巴细胞两种类型的鞭毛蛋白没有干扰。(数据6(一)和6 (b); )。的增殖率鞭毛蛋白a或b免疫T细胞培养与相应的抗原刺激24和72 h是明显高于文化与异种抗原刺激(数字6 (c)和6 (d)和数字6 (e)和6 (f); )。此外,扩散的鞭毛蛋白a或b免疫T细胞培养与异种抗原刺激明显高于从控制小鼠T细胞(数字6 (c)和6 (d)和数字6 (e)和6 (f); )。

为了进一步区分是否CD4细胞⁺T淋巴细胞是免疫细胞参与双价鞭毛蛋白疫苗的抗感染作用在活的有机体内,CD4⁺或CD8⁺T淋巴细胞是由相应的抗体如上所述独立耗尽。我们表明,抗感染活性二价鞭毛蛋白免疫相对废除在活的有机体内CD4枯竭⁺T淋巴细胞。CD4耗尽后⁺二价flagellin-immunized组T淋巴细胞的存活率下降到50%和41.66%感染菌株PAK PAO1,分别为(数字2(一个)和2 (b))。同时,存活率并不比对照组下降时受到PAK(图2(一个))和PAO1(图2 (b)),因为免疫血清的杀戮能力铜绿假单胞菌压力是有效的。CD4枯竭⁺T淋巴细胞在鞭毛蛋白a-immunized组存活率下降到50%和16.16%应变PAK和PAO1挑战时,分别为(数字2 (c)和2 (d))。老鼠的存活率鞭毛蛋白b-immunized组CD4耗尽后⁺T淋巴细胞下降到41.66%和0%和应变PAO1 PAK挑战时,分别为(数字2 (e)和2 (f))。CD8枯竭⁺T淋巴细胞免疫小鼠的存活率没有影响。同时,与正常鼠免疫球蛋白治疗没有显示出对生存率的影响。

3.6。Th17细胞和IL-17被双价疫苗鞭毛蛋白激活

测试二价鞭毛蛋白疫苗是否会诱发IL-17,我们评估IL-17 CD4的生产⁺免疫小鼠的T细胞恢复辐照脾细胞的存在和鞭毛蛋白或鞭毛蛋白b。的水平IL-17上层清液的免疫T细胞明显高于控制T细胞( ,数据7(一)和7 (b))。anti-CD4单克隆抗体的存在期间coculture返回IL-17水平的控制T细胞,进一步表明CD4细胞⁺T细胞是IL-17在这个系统(数据的主要来源7(一)和7 (b))。IL-17水平在anti-CD8单克隆抗体的存在coculture每组之间没有显著差异(数字7(一)和7 (b); )。IL-17生产通过鞭毛蛋白——或鞭毛蛋白b-immunized T细胞与相应的抗原刺激时明显高于T细胞刺激与异种抗原( ;数据7 (c)和7 (d)和数字7 (e)和7 (f))。IL-17生产通过鞭毛蛋白——或鞭毛蛋白b-immunized T细胞与异种抗原刺激时显著高于控制T细胞( ;数据7 (c)和7 (d)和数字7 (e)和7 (f))。鞭毛蛋白——或鞭毛蛋白b-immunized T细胞与同源或异源抗原刺激时anti-CD4单克隆抗体的存在在coculture返回IL-17水平的控制T细胞。IL-17水平没有显著差异的鞭毛蛋白或鞭毛蛋白b文化通过T细胞免疫治疗,anti-CD8单克隆抗体,或控制免疫球蛋白( ;数据7 (c)和7 (d)和数字7 (e)和7 (f))。T细胞增殖和IL-17分泌反应化验确认数据显示不同的T细胞反应的证据在鞭毛蛋白a或b免疫小鼠指示一个活跃的克隆扩张和中性粒细胞反应,导致免疫小鼠的生存(保护)率高于控制老鼠。

3.7。二价鞭毛蛋白疫苗减少铜绿假单胞菌应变的负担

为了评估双价鞭毛蛋白疫苗的保护效果,我们决定了细菌数量在肺,肝、血、感染免疫小鼠的脾脏。免疫和二价鞭毛蛋白减少了PAK PAO1应变负担在肺,肝脏,血,脾与小鼠注射PBS ( ;数据8(一个),8 (b),8 (c),8 (d))。免疫与鞭毛蛋白显著减少同源菌株PAK负担的主要器官和血液与异种的应变PAO1负担( ;数据8(一个),8 (b),8 (c),8 (d))。免疫与鞭毛蛋白显著减少同源菌株PAO1负担的主要器官和血液与异种的应变PAK负担( ;数据8(一个),8 (b),8 (c),8 (d))。

3.8。二价鞭毛蛋白的嗜中性粒细胞招募到肺部- - - - - -免疫小鼠

作为中性粒细胞IL-17是一个关键的中介招聘到肺,我们评估的中性粒细胞数量招募免疫小鼠的航空公司。如数据所示9(一个),9 (e),9 (f)在二价flagellin-immunized老鼠,BALF中性粒细胞的数量和IL-17水平后6 h的挑战远远超过这些控件( )。在这个时间点上,细菌数量的BALF中二价flagellin-immunized均明显低于对照组( ,图9 (c))。IL-17水平和嗜中性粒细胞数量BALF的鞭毛蛋白——或者b-immunized小鼠获得6 h后小鼠同源挑战明显高于挑战不同的应变( ;数据9(一个),9 (e),9 (f))。在鞭毛蛋白——或者b-immunized老鼠,IL-17 BALF和嗜中性粒细胞数量水平获得挑战后6 h与异种的应变明显高于那些没有免疫小鼠( ;数据9(一个),9 (e),9 (f))。在这个时间点上,不同的菌株数量BALF的鞭毛蛋白——或b-immunized老鼠明显低于那些老鼠挑战不同的应变。( ,图9 (c))。在18 h后细菌挑战,BALF中性粒细胞和细菌的数量在二价flagellin-immunized小鼠CFU显著低于对照组( ;数据9 (b)和9 (d))。IL-17水平和嗜中性粒细胞BALF的鞭毛蛋白或b-immunized老鼠获得18 h后小鼠同源挑战明显高于挑战不同的应变( ;数据9 (b),9 (e),9 (f))。在这个时间点上,不同的菌株数量BALF的鞭毛蛋白——或b-immunized老鼠明显低于那些老鼠挑战不同的应变。( ,图9 (d))。

3.9。影响中和IL-17二价鞭毛蛋白疫苗的保护效果

进一步评估IL-17的保护作用的二价鞭毛蛋白疫苗功效,我们研究了中和之前IL-17肺的影响与挑战铜绿假单胞菌菌株。如数据所示10 ()和10 (b),死亡率的二价flagellin-immunized老鼠收到anti-IL-17免疫球蛋白明显高于给定控制免疫球蛋白( )。在鞭毛蛋白a-immunized集团存活率下降到50%和8.33%在收到anti-IL-17免疫球蛋白与菌株PAK PAO1挑战时,分别为(数字10 (c)和10 (d))。在鞭毛蛋白b-immunized集团存活率下降到41.66%和0%在收到anti-IL-17免疫球蛋白与菌株PAO1 PAK挑战时,分别为(数字10 (e)和10 (f))。

4所示。讨论

由于肺感染铜绿假单胞菌对药物治疗已成为一个严重的挑战,主要是由于缺乏新的有效的抗生素类和高发病率和死亡率(35]。这种可怕的情况积极关注的疫苗,可能的作战方法铜绿假单胞菌。此外,复杂的致病性铜绿假单胞菌和毒力因素的多元功能代表主要障碍有效的通用疫苗的发展(36]。对各种成熟的保护铜绿假单胞菌感染、整合先天和适应性免疫系统是至关重要的。在肺组织,调理的抗体和先天免疫细胞介导的炎症反应全面保护铜绿假单胞菌(34]。因此,在一个有效的疫苗抗原铜绿假单胞菌感染诱导体液免疫和细胞免疫反应。尽管几铜绿假单胞菌迄今为止,抗原被评为铜绿假单胞菌候选疫苗,鞭毛蛋白蛋白质最大的承诺,因为这些铜绿假单胞菌组件唤起在活的有机体内免疫反应进而促进opsonophagocytic活动(25]。他们也至关重要铜绿假单胞菌生存在多数临床感染和表达铜绿假单胞菌压力(26]。此外,鞭毛蛋白促进T和B淋巴细胞显著增加招聘二级淋巴网站,增加的可能性这些细胞遇到他们的特异性抗原,也可以直接刺激CD4细胞⁺和CD8⁺T细胞(14,15]。

在这里,我们表明,二价鞭毛蛋白疫苗提供重要的同源和异源防护致命的铜绿假单胞菌肺炎和它与antiopsonophagocytic杀戮和antimotility活动以及效应IL-17细胞因子反应。事实上,antiopsonophagocytic杀戮和antimotility活动提供的二价鞭毛蛋白抗血清的发病机理和侵入性感染恶化加上Th17细胞的效应细胞因子增强更广谱的保护活动铜绿假单胞菌全身的致命的肺炎。评价小鼠免疫反应的各个方面和保护效果的疫苗在小鼠急性肺炎模型显示强劲的防范潜在的致命铜绿假单胞菌感染。

脾T细胞的细胞因子分泌表示,二价鞭毛蛋白可以诱导高效Th17细胞因子类型的抗原刺激结合发现IgG1和IgG2a亚型的血清免疫小鼠进一步确认鞭毛蛋白引起体液和细胞介导的免疫反应的发展,获得更大的功效比单价鞭毛蛋白提供保护,以防止不同的鞭毛的菌株铜绿假单胞菌。这些数据表明,CD4的协作⁺T细胞与生产能力IL-17需要和调理素的抗体对急性保护性免疫力铜绿假单胞菌肺炎(37,38]。后的保护性免疫反应铜绿假单胞菌免疫接种的老鼠与CD4相关联⁺T cell-dependent免疫(39]。铜绿假单胞菌免疫接种的老鼠脉冲DCs保护小鼠肺部感染,根据CD4的存在⁺T细胞(38]。

它所以必须提到IL-17最近被证明是一个关键因素在疫苗诱导保护铜绿假单胞菌(10]。IL-17主要介导免疫调控功能通过促进生产抗菌肽从肺上皮细胞或促炎细胞因子和趋化因子,导致肺中性粒细胞和巨噬细胞的吸引力,随后增加吞噬的细菌感染和增强的间隙(9,10,40]。早期二价flagellin-immunized小鼠肺组织中性粒细胞数量增加与肺组织迅速减少细菌负荷以及同源和不同的保护。我们的数据表明,CD4细胞⁺T细胞可能在急性肺IL-17的来源之一铜绿假单胞菌感染,可能是一个关键组成部分完全免疫肺部感染的病原体(41,42]。最近的一项研究表明γδT细胞产生肺部IL-17早在2 h后百日咳博德特氏菌感染(43]。感染后6 h IL-17水平增加,表明急性肺部感染铜绿假单胞菌快速诱导IL-17生产在肺部;这种IL-17可能参与先天免疫反应的感染(44,45]。

同时,从鼻和减毒活疫苗免疫小鼠T细胞铜绿假单胞菌疫苗抗原刺激后显示IL-17高水平和高CD4的数量⁺IL-17⁺Th17细胞在脾脏后6 h挑战和介导的保护性免疫反应(34]。虽然研究的焦点CD4 IL-17产量很大程度上⁺αβT细胞,γδT细胞也被证明是一个强有力的IL-17来源,在某些情况下,生产IL-17比αβT细胞(46- - - - - -49]。有趣的是,它已经表明,Th17细胞增加8 h后感染铜绿假单胞菌,在急性肺IL-23也增加铜绿假单胞菌感染(44]。最近的研究表明,IL-23促进Th17细胞发展效应CD4记忆⁺细胞。的主要细胞类型肺负责清关铜绿假单胞菌是嗜中性粒细胞(9,50]。保护的死亡铜绿假单胞菌与CD4免疫动物⁺IL-17⁺Th17中性粒细胞在肺的和快速的要求(51]。降低细菌负担在肝脏,脾脏,和血液表明,二价鞭毛蛋白抗体可以系统干扰的传播铜绿假单胞菌污渍在肝脏和脾脏通过抑制细菌运动性的血液感染,现场的主要机制保护后的血液感染铜绿假单胞菌急性肺炎模型(17,18,52]。尽管抗体a或b型鞭毛蛋白完全抑制同源菌株的能动性,他们也有轻微的影响不同的压力。运动性抑制和opsonophagocytic活动的结果表明,保护作用的抗体a或b型鞭毛蛋白是特定应变。被动转移二价鞭毛蛋白抗血清保护小鼠免受感染鞭毛的菌株铜绿假单胞菌。实现结果也符合几个调查,采用烧伤创面模型表明,被动免疫抗体提高a或b型鞭毛蛋白保护受感染的小鼠同源菌株(53,54]。抗体所提供的保护提出对鞭毛蛋白是高度特定类型,和两个鞭毛蛋白抗体的存在类型是至关重要的。因此,二价鞭毛蛋白抗体显示一个伟大的对两个不同的活动铜绿假单胞菌菌株,没有干扰的单个组件提高opsonophagocytic杀戮和固定不同的鞭毛的菌株铜绿假单胞菌。因此,与二价鞭毛蛋白抗体免疫疗法成功地提供同源和不同的保护比治疗用抗体提高到每个单价类型a或b鞭毛蛋白。同时,与我们的新型双价鞭毛蛋白疫苗免疫不干扰单个组件在改善生存或诱导的保护性抗体。我们承认我们的保护效果数据相反Campodonico et al。23)暴露,抗体a或b型鞭毛蛋白有一个低保护活动对同源菌株,没有活动针对不同的压力。似乎可行,明显的数据差异可能是由于我们的方法使用完整的a和b型鞭毛蛋白作为抗原研究的目标。此外,Campodonico等人分别研究了a和b型鞭毛蛋白的影响,但没有评估二价鞭毛蛋白(23]。我们发现抗体a或b型鞭毛蛋白展示活动对同源株高和低活动针对不同的菌株与最近的一份报告(23),这表明,原型是鞭毛蛋白抗体同源铜绿假单胞菌应变低调理素的杀害活动,没有杀害活动。他们还报告说,b型鞭毛蛋白抗体对同源或异源没有调理素的屠杀活动应变(23]。明显的差异可能部分解释了利用全身类型a和b的混合物鞭毛蛋白(包含N′和C′终端域)作为免疫原,而不是鞭毛蛋白亚基,可能占保护性抗体反应在我们的研究中观察到。也值得一提,一些报告表明,N′-和C′末端的鞭毛蛋白蛋白有促炎的图案55,56)和两个触发激活先天免疫应答的通过提高防护TLR5炎症反应,提高招募中性粒细胞和促进假单胞菌间隙postinfection [57]。另外,之前的研究表明,细菌鞭毛蛋白突变引起严重的粘膜损伤的机制似乎也涉及细胞凋亡的诱导上皮细胞通过抑制NF -κB激活(58,59]。TLR5激活通过鞭毛蛋白可以防止细菌逃避宿主先天免疫反应和改变组织损伤的程度与晚期细菌感染(60]。殖民后,铜绿假单胞菌会使表达水平的鞭毛逃避TLR5-mediated宿主先天免疫激活(61年]。幽门螺旋杆菌可能表达不活跃的鞭毛蛋白防止TLR5-mediated主机的粘膜免疫的激活,使持续感染在胃上皮细胞(62年]。也,Campodonico et al . 2011年的报告表明,共轭polymannuronic酸(PMA)通过TLR5类型鞭毛蛋白增强其免疫原性,表明可取的保护性抗体引起和守恒的先天免疫抵抗机制铜绿假单胞菌(63年]。这些观测具有重要意义对鞭毛鞭毛蛋白疫苗的使用而不是鞭毛病原体。似乎激活TLR5可能诱发保护性免疫铜绿假单胞菌和降低风险获得感染其它鞭毛细菌激活TLR5 [23,63年]。最后,我们承认,我们的研究结果与2010年的报告(23),得出的结论是,鞭毛是一个更好的候选人提供保护,以防止感染,因为他们发现原型鞭毛蛋白和原型b鞭毛蛋白抗体保护差活动对同源或异源铜绿假单胞菌菌株。一些报道,然而,表明flagellin-induced抗体针对a或b型鞭毛蛋白有保护活动在各种小鼠感染模型53,64年,65年]。的确,我们的方法是针对这两个域的一个小说的功能完整的a和b型鞭毛蛋白,作为目标抗原,保护anti-flagellin抗体,以及诱导CD4细胞⁺IL-17⁺Th17细胞免疫小鼠之间响应指示一个活跃的克隆扩张和嗜中性粒细胞反应导致免疫小鼠的生存(保护)率高于控制老鼠。

值得说明的主动免疫a或b型鞭毛蛋白提供了显著的保护老鼠对异种的应变比被动治疗用抗体提高a或b型鞭毛蛋白。这一现象表明,CD4细胞⁺IL-17⁺Th17细胞介导免疫反应可能是负责提供的抗感染活性二价鞭毛蛋白当antiopsonophagocytic杀戮和antimotility抗体水平较低。同时,在活的有机体内CD4⁺T细胞耗竭在二价鞭毛蛋白免疫减弱或类型a或b鞭毛蛋白疫苗预防铜绿假单胞菌感染。然而,CD8淋巴细胞的损耗没有废除的抗感染与活动铜绿假单胞菌菌株。本研究的结果表明自适应(CD4的事实⁺T细胞和抗体)和先天(巨噬细胞和中性粒细胞)效应器所需保护性免疫力铜绿假单胞菌菌株。T细胞增殖和IL-17分泌反应化验确认数据显示不同的T细胞反应的证据在鞭毛蛋白a或b免疫小鼠指示一个活跃的克隆扩张和嗜中性粒细胞反应导致免疫小鼠的生存(保护)率高于控制老鼠。最近的一项研究表明,保护由PopB免疫攻击铜绿假单胞菌肺炎是增加IL-17细胞因子而抗血清PopB既没有opsonophagocytic也没有anticytotoxic活动(9]。一个理想的疫苗的一个重要特征铜绿假单胞菌是能够诱导IL-17快速招募中性粒细胞感染的网站,在那里他们可以调解opsonophagocytic细菌杀死。在一个最近的研究(25),我们证明了二价鞭毛蛋白疫苗可以提供保护对烧伤创面感染不同的鞭毛的菌株铜绿假单胞菌引发一个有效的体液免疫反应,包括改善opsonophagocytic杀戮和病原体的一个固定伤口部位。烧伤后,当地的失败和系统性的细胞免疫反应使病原菌传播系统的血液感染,容易升级为脓毒症。因此,似乎保护性免疫反应铜绿假单胞菌烧伤伤口感染是由调理素的抗体。因此,鞭毛蛋白是一个独特的特性,因为它的诱导细胞和体液免疫反应的能力,进而提供了抵御不同铜绿假单胞菌感染。

综上所述,这些研究结果提供的证据表明,双价鞭毛蛋白疫苗可以提供保护反对不同的鞭毛的菌株铜绿假单胞菌在烧伤创面感染模型,诱发有效的细胞和体液免疫反应,包括IL-17感应和改善opsonophagocytic杀死。因此,减少系统性病原体传播引起的增加小鼠感染的生存铜绿假单胞菌。此外,这些数据进一步证实,针对这两种类型的鞭毛蛋白抗体导致显著提高疗效相比,每个单价抗原的潜力扩大覆盖面铜绿假单胞菌菌株可能不会表达的两个目标。我们保持乐观地认为一个有效的铜绿假单胞菌二价鞭毛蛋白疫苗最终可能是开发和测试在人类对减少发病率和死亡率与肺部感染引起的铜绿假单胞菌。

的利益冲突

没有利益冲突。