文摘

客观的。本研究旨在探讨黄酮类化合物的免疫调节效应的蓝莓Vaccinium corymbosuml .)叶子(FBL)。方法。蓝莓叶的类黄酮是用70%乙醇和被ultraperformance液相色谱/ quadrupole-time-of-flight质谱(UPLC / Q-Tof-MS)。的免疫调节作用和可能的调节机制FBL调查在脂多糖(LPS)诱导264.7原始细胞。结果。结果显示UPLC / Q-Tof-MS, 9类黄酮的蓝莓叶子被确定。FBL显示显著减少生产TNF -α264.7在LPS-stimulated原始细胞。FBL显著降低NF -的表达κB p65 P-NF -κ264.7 B p65 LPS-induced原始细胞剂量依赖性的方式。结论。我们的研究显示,免疫调节效应的FBL通过抑制肿瘤坏死因子-α通过NF -κB信号通路。

1。介绍

免疫调节是指免疫系统的规定,如刺激、表达、放大或抑制免疫反应的任何部分或阶段(1]。炎症免疫调节的一部分。不仅在不同的几种细胞,巨噬细胞吞噬各种病原微生物,凋亡细胞,肿瘤细胞也扮演了一个重要的角色在先天和适应性免疫反应(2]。一旦感染因素,激活巨噬细胞释放多种炎性细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α(TNF -α),interleukin-1beta (il - 1β)和白细胞介素- 6 (il - 6) [3]。随后这些细胞因子促进巨噬细胞的激活和生产,然后导致巨噬细胞浸润,引起局部炎症反应(4]。许多炎症的分子机制的研究表明核factor-kappa (NF - BκB)信号通路(5- - - - - -8),这是密切相关的巨噬细胞的生长和增殖,发挥重要作用的分子机制的炎症。p65是NF -的单元之一κB转录因子蛋白家族(9]。p65的形成和NF - p50扮演了重要的角色κB信号通路。二聚,p65与DNA结合转录激活,和核易位(9,10]。我的磷酸化κb在刺激细胞的诱导物可能导致激活NF -κB信号通路。然后,NF-kB信号通路激活会导致信号从细胞表面转导到细胞核11]。

也叫蔓越莓,蓝莓是多年生落叶或常绿灌木Vaccinium corymbosuml . (12]。越来越多的研究发现,蓝莓具有多种生物活性如抗氧化、清除自由基、抗癌、降低血压,血脂,血糖(13- - - - - -16]。它已经被广泛地应用于医疗产品到世界各地。蓝莓叶主要含有phenylpropanoid和类黄酮(17),如芦丁、槲皮素、山柰酚和cyanidin-3-O-glu类似的水果18]。然而,很少有研究对蓝莓叶的生物活性(8,19]。

在目前的研究中,分析了化学成分的FBL UPLC / Q-Tof-MS进行了分析鉴定。此外,肿瘤坏死因子-α通过ELISA测定,NF -κB p65 P-NF -κ264.7 B p65 LPS-induced原始细胞被免疫印迹检测。这项研究表明,FBL药用植物的潜在immune-adjusting试剂。

2。材料和方法

2.1。化学品和材料

Indometacin平板电脑获得从临汾麒麟制药有限公司(山西、中国)。杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和胎牛血清(的边后卫)获得Gibco(美国CA)。5-dimethyl-2-thiazolyl有限合伙人和3 - (4)2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium溴化(MTT)从Sigma-Aldrich购买化学(圣路易斯,密苏里州,美国)。酶联免疫吸附试验(ELISA)转录酶包TNF -α中国从CUSABIO购买(武汉)。主要的抗体anti-NF -κB p65抗体和anti-P-NF -κB p65抗体买来Abcam(英国剑桥科技园)。Peroxidase-labeled兔子anti-mouse、羊anti-rabbit免疫球蛋白,增强化学发光(ECL)检测系统获得Amersham(美国阿灵顿高地,IL)。所有其他的化学物质从Sigma-Aldrich购买化学。蓝莓的干叶子从江苏、购买中国。

2.2。制备FBL

蓝莓的干叶子(20公斤)和95%乙醇提取三次。获得提取被D101大孔树脂分离。70%的乙醇产品制备成冻干FBL粉(17.0 g)。

2.3。UPLC / Q-Tof-MS FBL分析

冻干FBL粉(0.01 g)溶解在1毫升3% DMSO (v/v)。FBL的解决方案是可溶性的超声治疗5分钟。然后,在15000转离心10分钟。上层清液过滤是0.22μm注射器过滤器FBL的股票的解决方案。50μL股票的解决方案被转移到1.5毫升管,和950年μL的蒸馏水补充道。最终的解决方案是注入UPLC系统进行定性分析。

水域的FBL样本分析Xevo G2 Q-Tof / UPLC系统。色谱分离进行反相固定相(安捷伦ZORBAX SB-Aq C18柱:100毫米×2.1毫米,3.5μ米)的注射量3μl .流动相包括乙腈(A)和0.1%甲酸(B)和0.4毫升/分钟的流量在30°C。梯度程序设置如下:15%到25%在0.0 - -20.0分钟,25%到37%在20.0 - -22.0分钟。UPLC之间的接口和Q-Tof ESI源电喷射口操作的消极模式。列废水引入Q-Tof。检测的离子进行全扫描模式。数据采集范围(米/z)是150年到1000年。离子源参数如下:毛细管电压:3200 V,锥孔电压:30 V,离子源温度:100°C, desolvent温度:350°C,雾化气体的体积流率(N2):60 L / h, desolvent气体的体积流率(N2):600 L / h,碰撞能量(CE): 20 - 50 V。Masslynx分析数据处理的软件。

2.4。细胞系,细胞培养

小鼠巨噬细胞细胞系生264.7细胞从生物化学和细胞生物学研究所(上海,中国)。细胞在DMEM培养,10%的边后卫,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μ在湿润的气氛中g / mL)有限公司为5%2在37°C。

2.5。测定细胞生存能力

细胞MTT试验测定可行性。264.7原始细胞被播种密度的5×105细胞在96孔板/毫升。然后,不同浓度的测试样本治疗3 h,与1和细胞继续刺激μg / mL有限合伙人24 h。随后,MTT方法给出了最终浓度为0.5毫克/毫升与孵化4 h 37°C。甲瓒完全溶解在DMSO溶液后,吸收值以570海里(参考,630海里)标。对照组的细胞生存能力(细胞治疗由有限合伙人)设置为100%。

2.6。测定FBL治疗持续时间

264.7原始细胞被播种密度的5×105细胞在96孔板/毫升。然后,细胞被分成4组,分别接受62.50μg / mL FBL解决方案3 h、6 h, 12小时和24小时。与1细胞继续刺激μg / mL有限合伙人24 h。细胞生存能力MTT试验测量中提到的部分2。5。对照组(治疗没有FBL和有限合伙人),模型组(只接受有限合伙人)并行处理。

2.7。测定肿瘤坏死因子-α通过ELISA

264.7原始细胞分为积极的组织,大剂量FBL集团中FBL组和低剂量的FBL组,服用44.70毫克/毫升indometacin解决方案和62.50,15.62和3.91μg / mL FBL溶液溶解在DMEM 6 h,分别与1和继续刺激μg / mL有限合伙人24 h。264.7原始细胞模型组与1只是刺激μg / mL有限合伙人24 h没有预处理的6小时。264.7原始细胞与有限合伙人和FBL对照组治疗。浮在表面的收集,与同样体积的混合格里斯试剂在室温下15分钟在黑暗中。肿瘤坏死因子的水平α在培养媒体是由选择性ELISA包根据制造商的指示。标上的吸光度检测。

2.8。免疫印迹分析

巨噬细胞在上面的六组收集和resuspended里帕裂解缓冲在4°C为20分钟。蛋白质浓度的NF -κB p65 P-NF -κB p65细胞溶解产物测定使用直流蛋白质分析。等量的蛋白质从每个样本相隔十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)在80 V 30分钟然后在120 V 90分钟和转移到硝化纤维膜。膜被孵化一夜之间在4°C与相应的主要抗体,其次是孵化与适当的二次抗体结合辣根过氧化物酶在室温下2小时。ECL检测系统用于监控immune-reactive乐队。

2.9。统计分析

所有数据提出了平均数±标准差。未配对的数据进行了分析t以及。所有使用SPSS 16.0统计分析软件SPSS,芝加哥,美国),和一个值 被接受为显著。所有的数据反映了从至少三个独立实验中获得的数据。

3所示。结果

3.1。在FBL识别的主要成分

FBL的主要组件是完全由发达的色谱分析方法。FBL的总离子色谱检测UPLC / Q-Tof-MS在负模式如图1。发现了九个主要成分如表所示1。九峰被确定为杨梅酮(1),(2)芦丁,myricetin-3 toxicarolisoflavone -rhamnoside (3) (4), 3、3 ,4 ,(5,7-pentahydroxy-6) - 4-hydroxybenzyl黄烷酮(5),iridin(6)、槲皮素(7),cyanidin-3 (6 -malonylglucoside)(8)、山柰酚(9),分别。


图1
总离子色谱的FBL -模式。峰归因:杨梅酮(1),(2)芦丁,myricetin-3 toxicarolisoflavone -rhamnoside (3) (4), 3、3 ,4 ,(5,7-pentahydroxy-6) - 4-hydroxybenzyl黄烷酮(5),iridin(6)、槲皮素(7),cyanidin-3 (6 -malonylglucoside)(8)、山柰酚(9)。
表1
识别的九个成分的FBL UPLC / Q-TOF-MS。
3.2。FBL对细胞活力的影响

264.7原始细胞的生存能力处理FBL解决方案见表2。结果表明,细胞生存能力显著降低为125.00μg / mL和更高的FBL浓度( ),但是没有差别在62.50,31.25,15.63,7.81和3.91μg / mL组。因此,62.50μg / mL FBL被设置为高剂量组,然后15.63和3.91μg / mL FBL中、低剂量组,分别。

表2
FBL对264.7原始细胞的生存能力的影响。
3.3。FBL治疗持续时间264.7原始细胞

细胞生存能力是决定通过MTT测定(图2)。细胞的可行性模型组与对照组相比不同的FBL治疗持续时间显著增加( )。然而,细胞生存能力的FBL组与模型组相比显著降低在6、12、24小时FBL治疗组(持续时间 )。这些数据表明原始264.7细胞治疗FBL 6 h有效抑制细胞增殖。


图2
FBL治疗持续时间264.7原始细胞。对照组治疗没有有限合伙人和FBL,模型组治疗只有1μg / mL有限合伙人,FBL组治疗1μg / mL有限合伙人和62.50μ克/毫升FBL。 :FBL组与模型组在相同的处理时间。 :模型组与对照组在相同的处理时间。
3.4。FBL对肿瘤坏死因子的影响α水平

肿瘤坏死因子的水平α在文化媒体通过ELISA测定。提出了图3,TNF -的浓度α模型组与对照组相比显著增加( )。肿瘤坏死因子的水平α阳性组与模型组相比均有显著降低( )。肿瘤坏死因子的水平α中等剂量的FBL和高剂量FBL组与模型组相比均有显著降低( )。肿瘤坏死因子的水平α在高剂量FBL和低剂量的FBL组相比明显不同的中等剂量FBL集团( )。这些数据表明FBL消极监管TNF -的生产α在转录和翻译水平264.7 LPS-induced原始细胞浓度的方式。


图3
FBL对肿瘤坏死因子的影响α264.7水平LPS-stimulated原始细胞。对照组治疗没有有限合伙人和FBL;模型组治疗只有1μ24 h g / mL有限合伙人;积极组织处理44.70毫克/毫升indometacin 6 h和1μ24 h g / mL有限合伙人;和FBL团体接受62.50,15.62,和3.91μg / mL FBL 6 h,分别和1μg / mL有限合伙人24 h。 和 与模型组。 与中等剂量FBL组。
3.5。FBL NF的表达——的影响κB p65 P-NF -κB p65

确定是否FBL介导的抗炎活动调制NF -κNF - B激活,表达式κB p65 P-NF -κB p65 LPS-activated巨噬细胞治疗FBL被免疫印迹(图检查4)。NF -水平κB p65 P-NF -κB在模型中p65蛋白组与对照组相比显著增加( )。NF -水平κB p65 P-NF -κB p65蛋白阳性组相比显著降低,在模型组( )。NF -的浓度κB p65 P-NF -κB p65的中产阶级和高剂量组相比显著降低模型的组( )。这些发现表明,FBL的抗炎作用至少部分是由于抑制NF -κB-dependent基因转录。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
表达式的FBL NF -的影响κB p65 P-NF -κ264.7 B p65 LPS-stimulated原始细胞。对照组治疗没有有限合伙人和FBL;模型组治疗只有1μ24 h g / mL有限合伙人;积极组织处理44.70毫克/毫升indometacin 6 h和1μ24 h g / mL有限合伙人;和FBL团体接受62.50,15.62,和3.91μg / mL FBL 6 h,分别和1μg / mL有限合伙人24 h。(a)的照片NF -κB p65 P-NF -κB p65,β肌动蛋白;(b)的比率NF -κB p65β肌动蛋白;和(c)的比率P-NF -κB p65β肌动蛋白。 与模型组。

4所示。讨论

在这个实验中,不同的列和流动相条件测试和合适的色谱条件。此外,Q-Tof几次后和女士条件确定。消极的模式被选中是因为更好的图形和数据比较。毛细管电压的参数、碰撞能量和离子源温度测定经过多次试验。蓝莓叶(FBL)提取的黄酮类化合物被UPLC / Q-Tof-MS,主要包含杨梅酮(1),(2)芦丁,myricetin-3 toxicarolisoflavone -rhamnoside (3) (4), 3、3 ,4 ,(5,7-pentahydroxy-6) - 4-hydroxybenzyl黄烷酮(5),iridin(6)、槲皮素(7),cyanidin-3 (6 -malonylglucoside)(8)、山柰酚(9)。选民被确定的基础上,引用和质谱数据,和几个成分被确定基于参考标准。

macrophage-based先天免疫反应起着重要的作用在先天性免疫反应。LPS-stimulated生264.7小鼠巨噬细胞细胞通常被认为是一个合适的模型来研究药物的免疫调节和抗炎作用20.]。在这项研究中,264.7 LPS-stimulated原始细胞制备作为炎症模型。不仅TNF -的水平α还有那些il - 6的确定。264.7与LPS刺激后,原始细胞诱导和释放炎症因子il - 6和TNF -α迅速。il - 6的水平没有差异的三个FBL剂量组与模型组相比。这说明FBL没有对il - 6的影响,这是统计相关信号通路(21]。肿瘤坏死因子——的结果α表明FBL可以调节浓度的方式。引用的研究NF -κB信号通路、细胞因子的产生TNF -α可以激活NF -κB信号通路。因此,以下实验旨在关注NF -κB信号通路。

据报道,核转录因子NF -κB是参与转录调节多种细胞因子和炎症介质(22),具体绑定到一个特定的基因启动子和增强子序列促进转录和表达(23]。NF -κB p65位于细胞质中我将灭活后绑定到其抑制剂κB (24]。当它受到外部刺激(如有限合伙人),我κBα磷酸化、降解和NF -分离κB /我κBα复杂的(25,26]。激活NF -κB p65易位后进入细胞核结合目标基因启动子或增强子(27]。它继续迅速诱导目标基因的信使rna的合成和转录。在我们的研究中,水平的NF -κB通路蛋白p65及其磷酸化蛋白P-p65减少在高收入和中组与模型组相比。结果表明,FBL可以抑制NF -的转录κB-dependent基因。这也说明抗炎引起的FBL部分抑制NF -κB-dependent基因转录。

5。结论

总之,9类黄酮的蓝莓叶子被UPLC / Q-Tof-MS类似于蓝莓水果。FBL可以显著降低TNF的表达和释放α264.7在LPS-induced原始细胞剂量依赖性的方式。此外,结果p65 P-p65建议FBL抑制炎症相关因子的表达,抑制NF -κB信号通路。我们的研究结果提供了一些参考蓝莓植物的进一步开发和利用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突在这个手稿。

作者的贡献

Dazhi史和徐Mengyi同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金的资助中国没有。81202431),广东省自然科学基金(没有。2015 a030313282),澳门科学技术发展基金(FDCT) (006/2015 / A1)。