一个探索Anticentromere抗体对早期胚胎的影响

文摘

背景。以前,我们发现女性积极anticentromere抗体显示潜在的卵母细胞的成熟和胚胎卵裂受损;这一现象背后的可能机制仍然未知。目标。因此,本研究旨在初步探讨ACA能否深入生活胚胎和损害他们的发展潜力在体外coculture小鼠胚胎。方法。小鼠胚胎收集和使用在体外文化与多克隆anticentromere蛋白质(CENP-A)抗体;然后,抗体的免疫荧光试验来确定执行渗透进入胚胎,胚胎发展潜在的观察。结果。所有胚胎培养anti-CENP-A抗体免疫荧光展出在细胞核,而没有从对照组胚胎免疫荧光。此外,胚胎培养与anti-CENP-A抗体经历了显著的发展障碍与控制。结论。小鼠胚胎可能ACA的直接目标在体外植入前。然而,精确的机制需要进一步澄清。

1。介绍

最近的一项研究发现,卵母细胞成熟和早期胚胎发育障碍的女性积极anticentromere抗体(ACA)外周血(1]。最近,我们发现女性ACA阳性的比例明显降低成熟卵母细胞和胚胎卵裂率相比,女性- ACA (2),进一步揭示ACA对女性生育能力的潜在影响。ACA是阿拉斯的成员之一。它在1980年首次被发现是一个特定的抗体的患者血清中着丝粒钙质沉着,雷诺氏现象,食管蠕动障碍指硬皮病,毛细管扩张(峰值)综合症[3,4]。现在,ACA已经被认为是一种有效的辅助诊断标记系统性硬化症(SSc)。报道,女患者SSc容易有几个不同的不良妊娠结局,包括增加自然流产率、早产,小婴儿,不孕5,6]。此外,不孕症患者的患病率SSc很高,和不孕治疗的成功率相对较低,需要进一步的调查(7]。

早在1990年代,研究人员试图microinject ACA鼠标鸡蛋,导致染色体运动的障碍和隔离8]。众所周知,着丝粒是附件的纺锤体微管在染色体的着丝粒区域9,10]。它是有丝分裂的动态结构,细胞的减数分裂和其他重要活动(11- - - - - -15]。因此,它是合理的推断,ACA在活细胞可能干扰减数分裂或有丝分裂。

着丝粒是一个dna蛋白质复杂,其组装是通过着丝粒染色质coregulated及其相关蛋白复合物(16,17]。着丝粒蛋白(CENP-A)是一个相对清晰的本构着丝粒蛋白的生物功能,主要研究;其重要作用组装和功能的实现着丝粒一再验证(18,19]。此外,类似于CENP-B CENP-A被认为是一个主要目标抗原的ACA (20.- - - - - -23]。

这是猜测,ACA可能的轶事之一与卵母细胞成熟和胚胎卵裂异常密切相关。因此,本研究的目的是探讨ACA的潜在影响在早期胚胎通过在体外coculture小鼠胚胎。

2。材料和方法

2.1。小鼠胚胎

远ICR小鼠超数排卵诱导是通过刺激与怀孕的母马血清促性腺激素(10 IU腹腔内(i.p))和人类绒毛膜促性腺激素(48 h后10 IU ip)和ICR的雄性交配。雌性老鼠交配后24 h中丧生。早期胚胎被锋利的输卵管的解剖和收集用于实验。第一附属医院的伦理委员会批准了中山大学的这项研究。

2.2。在体外胚胎培养

奎因的胚胎培养的连续介质(美国Sage)。兔多克隆抗体,抗体组老鼠CENP-A(叠氮化牛血清白蛋白和免费的,从Abcam定制产品,联合王国)被添加到培养基中。抗体浓度的介质是35μ基于文献[g / mL(修改24])。磷酸盐(PBS)集团(担任控制),PBS溶液(PBS平板电脑,微孔、默克公司、德国)与抗体同样体积的解决方案是添加到培养基中。空白对照组组成中没有任何添加剂。

2.3。免疫荧光分析

在第二和第三天的文化,三到五个胚胎被挑选每道菜的三组免疫荧光试验,检测的信号是否anti-CENP-A抗体存在coculture后的胚胎。免疫荧光分析的过程如下:聚甲醛固定在4%的胚胎,然后洋溢着0.5% Triton x - 100(美国σ),其次是密封在5%正常驴血清(美国杰克逊Immunoresearch)。之后,胚胎孵化与488 - 1 h标记驴antirabbit免疫球蛋白(英国表达载体1:1000稀释),冲洗,孵化1μg / mL DAPI (4 ,美国6-diamidino-2-phenylindole、盐酸盐、细胞信号技术)15分钟,再冲洗,随后的显微观察和固定在培养皿中。为了排除假阳性的实验组,从抗体组胚胎孵化了PBS代替488 -标记驴antirabbit免疫球蛋白(抗体组控制)。

2.4。开发Cocultured胚胎(胚胎毒性试验)

收集和培养的胚胎的胚胎毒性试验是相同的如前所述除了胚胎留在碗整个为期3天的时间。每组的胚胎是检查以确定其发展阶段的第三和第五天(第一天称卵母细胞收集的日子)。记录以下发展阶段:6 - 8阶段第三天,胚泡,桑椹胚,2 - 8,在第五天不通的阶段。

2.5。统计分析

使用SPSS统计分析了13 (IL SPSS,美国)。卡方检验和分区卡方测试是用来比较定性数据。一个值小于0.05被认为是统计学意义通过卡方检验在三组,和一个值小于0.0167被用来显示统计学意义之间的分区卡方测试组。

3所示。结果

3.1。免疫荧光

所有胚胎培养anti-CENP-A抗体在细胞核中表现出强烈的免疫荧光,而没有一个胚胎PBS和空白对照组,以及抗体组控制,显示免疫荧光(图1)。

3.2。胚胎毒性试验

PBS和空白对照组相比,比例6 - 8阶段胚胎的第三天,以及桑椹胚和囊胚期胚胎的第五天,在抗体组显著降低。胚胎的发育潜能之间的可比性PBS和空白对照组(表1)。

4所示。讨论

1999年,研究人员发现,小鼠胚胎培养和纯化抗核免疫球蛋白在胚胎细胞表现出强烈的免疫荧光和经验丰富的显著增长障碍或死亡与培养与控制免疫球蛋白(25]。这表明,阿拉斯可以直接绑定到胚胎在体外。然而,精确的抗原表位不知道因为没带核抗原或磷脂被发现。在老鼠胚胎都有阶段,一组核蛋白质是暂时性的合成和胚胎染色质组成改变,表明早期胚胎可能具有抗原表位安娜(26]。此外,绑定相对具体,如抗甲状腺抗体和抗体绑定到胚胎的健康个体没有证据。显微镜下注射血清ACA小鼠卵母细胞的染色体可能阻碍congression逮捕并导致减数分裂间期或有丝分裂在前中期[被捕8]。

在目前的研究中,所有与多克隆胚胎培养anti-CENP-A抗体显示强大的抗体免疫荧光核组件(推测是anti-CENP-A抗体)和经历了明显的胚胎的发展障碍,表明小鼠胚胎可能一些留住的直接目标在体外植入前。此外,对于大多数cocultured胚胎,总是只有一个或一些卵裂球显示出荧光。也许,在着丝粒的密度结构防止anti-CENP-A抗体可访问性,或可检测荧光的分裂球是倾向于细胞凋亡并显示相对松散的结构,使anti-CENP-A抗体可访问性。然而,精确的机制需要进一步澄清。

尽管没有明确的概念存在抗体进入活细胞,和所涉及的机制尚不清楚,这些研究为抗体进入活细胞提供了证据。例如,anti-ribonucleoprotein-IgG可以选择性地进入t淋巴球,而相对较少的Fc受体表面的t淋巴球在座。它建议一些其他机制相关non-Fc监管可能会参与其中,这可能与antigen-like淋巴细胞表面结构,这意味着核糖核蛋白抗体与核糖核蛋白抗原在细胞表面调节他们进入活细胞(27]。

这项研究还发现,胚胎发育潜力明显受损与anti-CENP-A抗体文化后,表现出显著降低百分比的6 - 8期胚胎第三天,囊胚期胚胎的第五天。事实上,一项研究发现,小鼠胚胎培养和纯化ANA-positive血清免疫球蛋白g显示明显受损的胚胎发育潜力(25]。安娜可以渗透到亚细胞结构包含相应的抗原,它可以识别和结合抗原表位的重要功能区域。这些自身抗体可以显著抑制抗原和体内的功能在体外(28]。

总之,胚胎培养与anti-CENP-A抗体经历大幅增长损伤或死亡。因此,胚胎anti-CENP-A抗体可以直接目标。

伦理批准

第一附属医院医学伦理委员会批准了中山大学的研究(没有。[2014]75)。

的利益冲突

郭盈盈,ξ,钟呀,Canquan周宣布他们没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。81701518)、广州科技和信息局(没有。2014 j4100161),广东省科技项目(没有。2013 b021800271),广东省人口和计划生育委员会(没有。20132048)。本研究支持的生殖医学重点实验室广东省中山大学第一附属医院。研究也支持了两个重点实验室从广州医科大学第三附属医院;他们的主要产科疾病重点实验室和广东省重点实验室繁殖和遗传的广东高等教育机构。

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