转基因的杀菌、免疫调节和伤口愈合特性高凉菜属pinnata与抗菌肽Cecropin P1的体内协同作用

摘要

制造程序k . pinnata从之前描述的转基因植物中建立了含有cecropin P1 (CecP1)的水提取物。它包括在+4°C下培养7天，用水作为提取溶剂对叶子进行机械均质，并在+70°C下加热灭活植物酶。经加热杀菌过滤后，CecP1得率为提取物总蛋白的0.3%。水提取物k . pinnata+ CecP1对感染的伤口有良好的愈合作用金黄色葡萄球菌(相当于头孢唑啉)并与之结合金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌(优于头孢唑啉)。野生型k . pinnata提取物具有明显的杀微生物活性金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌但它被大大加强了k . pinnata+ CecP1提取。k . pinnata提取物(野生型和转基因)没有表现出普遍的毒性和加速伤口恢复。由于免疫调节活性，野生型k . pinnata提取液对创面肉芽化和边缘上皮化的促进作用优于提取液k . pinnata+ CecP1提取。免疫调节和杀微生物活性k . pinnata与CecP1的杀微生物活性协同，加速细菌的消除。

1.介绍

由于抗生素的广泛使用，微生物病原体的耐药性成为现代医学的最大问题之一[1］．对于复杂的慢性疾病尤其重要，例如糖尿病患者的营养性溃疡，需要长期的抗菌治疗[2］．由于一种特殊的作用机制，抗菌肽(AMP)被认为是传统抗生素的一个有前途的替代品[3.］．与抗生素相比，微生物病原体对它们耐药性上升的速度的数据是矛盾的，因为AMP的实际应用比一种抗生素要窄得多[4］．高副毒和低蛋白水解稳定性常被认为是AMP在制药中的适用性差的一般原因(例如，鸡尾蛋白/蚕蛋白和防御蛋白)[5］．

首次在猪肠道中发现AMP cecropin P1 (CecP1) [6］．后来又被认为是一种猪寄生虫蛔虫是大量存在于猪的肠道中[7］．与大多数其他已知AMP相比，CecP1自然适应于由十二指肠酶表现出高蛋白水解活性的培养基。无处不在的丰富的答:是证明CecP1即使在高剂量积累时也不会损害哺乳动物宿主的生存能力[8］．因此，CecP1在药学领域的应用前景广阔。然而，长期以来，CecP1由于缺乏合适的生产方法而无法用于临床试验。固相化学合成过于昂贵，液相合成尚未建立，CecP1对潜在生产者(细菌、酵母和胶束真菌)的毒性妨碍了生物合成。在融合蛋白中通过降低毒性的重组菌株生产它的复杂方法昂贵且技术实施困难[9］．然而，CecP1对细菌和真菌植物病原体的杀微生物活性有广泛的数据[10]及人类/动物病原体[11］．杀菌剂和抗肿瘤活性也归因于CecP1 [12，13］．

近年来，转基因植物的工程高凉菜属pinnata有报道表达CecP1合成基因并在细胞质中积累重组AMP [10］．纯CecP1和野生型的杀菌效率k . pinnata描述了对模型细菌菌株的提取[14］．然而，重组CecP1在体内的抗菌效果及其可能的毒副作用尚无数据。在这里我们报道了药用活性的测试结果k . pinnata含有CecP1的提取物(与野生型提取物相比k . pinnata)的大鼠伤口感染模型金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌最近从化脓性感染患者中分离出来的菌株。评价CecP1的抗化脓性、创面愈合和抗菌作用，并将其作为比较抗菌和毒性作用的标准k . pinnata提取体内。

k . pinnata似乎是一个很有前途的生物反应器生产CecP1，因为它的提取物可以用于表皮应用，而无需特殊的纯化。k . pinnata(林)。珀耳斯。(syn。Bryophyllum pinnatum；景天科)是一种受欢迎的植物，在世界上许多温带地区，特别是在南美洲用于传统医药[15］．关于……的活动有许多报道k . pinnata抗菌提取物[16，17]，利什曼虫［18],昆虫[19，甚至病毒[20.，21］．

野生型k . pinnata提取物含有许多生物活性化合物，例如，蟾二烯内酯[22]、黄酮醇(注射器酸的多酚和苷)[23和凝集素[24，25］．它们提供了复杂的免疫调节[26，27),淋巴组织(18),抗氧化剂(28，29],杀微生物剂[30.和细胞毒性[22，31，32]的性质。有些影响看起来是相反的。例如，Da Silva等人[18报道了th1型应答(IL-2和IFN-)的激活γ抑制th2型反应(下调IL-4)高凉菜属取代巴西橡胶树Umbuzeiro-Valent等人[33和El Abdellaoui等人[22在同一制剂中发现了抗炎(抗组胺)作用。Shirobokov等人[20.研究了用一种来自高凉菜属blossfeldiana可能是由于刀豆蛋白A，而Costa等人[34报道了乙酰鼠李糖苷的抗增殖作用高凉菜属取代巴西橡胶树人类淋巴细胞。综上所述，这些数据不能全面预测CecP1和CecP1抗菌作用的协同或拮抗作用k . pinnata果汁天然成分对细菌病原体在体内(与动物先天免疫机制的参与)。

我们解决了生产高度稳定的k . pinnata提取含有CecP1的提取物，并检测其治疗活性金黄色葡萄球菌脓性单胞菌感染及其联合铜绿假单胞菌(作为典型的医院感染的例子)。实验采用大鼠感染性平面创面模型进行。实验的样本k . pinnata将含有CecP1的提取物与野生型进行比较k . pinnata提取并与常用抗生素头孢唑啉(对革兰氏阳性菌具有主要活性的第一代半合成头孢菌素)[35］．用感染相同细菌病原体的未治疗大鼠亚组作为阴性对照。通过伤口愈合活性(平面法)和杀微生物剂活性(伤口腔内组织样本的微生物学研究)来评估治疗效果。

2.方法

2．1．生产k . pinnata提取

k . pinnata本研究从黄叶中提取提取物k . pinnata带有二元载体的转基因植物根癌土壤杆菌随机整合到植物基因组的t元素载体。该载体不包含耐药标记物。通过免疫印迹、抗菌平板试验、高效液相色谱联合质谱检测证明，通过直接免疫检测选择的植物CecP1的产量至少在2年内保持高度稳定。以3 kg重组植物叶片为原料，以去离子水为提取溶剂，得到5.07 L的提取液。杀菌后通过0.22尼龙膜过滤μ提取液总蛋白1 mg/mL，总蛋白0.7 mg/mLμ克/毫升CecP1。野生型的提取物k . pinnata用相同的方法生产，并根据总蛋白的相同浓度进行调整。前面描述的合成CecP1肽[14]作为重组蛋白CecP1的定量标准k . pinnata提取物。

2．2.动物

这项活体实验研究是根据ETS N123的《关于保护用于实验或其他科学目的的脊椎动物的欧洲公约》(斯特拉斯堡，1986年3月18日)组织的。240只成年雄性Wistar大鼠称量g, 3-4月龄。检疫后，它们被放进单独的笼子里。所有的动物都以相同的标准饮食喂养:12小时的黑暗和12小时的光照可供选择。他们有现成的水和食物。

这些动物被随机分成组(每组60只)，采用野生型k . pinnata提取、重组k . pinnata含CecP1的提取物(k . pinnata+ CecP1)、头孢唑啉(阳性对照)和阴性对照组(生理盐水模拟治疗)。每组随机分为2个亚组，每组30只。金黄色葡萄球菌和(2)金黄色葡萄球菌+铜绿假单胞菌．每组分为3个梯队，分别于养护开始后第3天、第10天、第14天退出实验。

2．3.菌株

Erwinia carotovora无性系种群。胡萝卜ATCC 15713(型菌株)在25℃的LB培养基(蛋白胨bacto (Difco) 10 g/L，酵母提取物(Difco) 5 g/L, NaCl 10 g/L，琼脂15 g/L)培养皿中培养。

细菌病原体金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923)和铜绿假单胞菌(ATCC 27853)临床标本分离株购自Tarasevich医学生物制剂标准化与控制研究所型株。在添加0.1%葡萄糖的斜IPA(肉蛋白胨营养琼脂)培养基中培养18-20 h。新鲜培养物用无菌盐水冲洗，完全悬浮，调整至浓度~10⁹CFU / mL，采用光学浊度标准CCA 42-28-29-85，用于伤口接种。

2．4．手术操作，治疗和伤口的平面测量分析

用前面描述的方法在大鼠身上建立脓性感染模型[36］．动物用乙醚麻醉。将动物背部20 × 20 cm面积的方形皮肤刮净，用70%乙醇消毒;手术切除真皮和表皮。1 mL菌悬液含10⁹CFU /毫升金黄色葡萄球菌ATCC 25923或10⁹CFU /毫升金黄色葡萄球菌ATCC 25923和10⁹CFU /毫升铜绿假单胞菌ATCC 27853分布于伤口表面。为了使伤口愈合条件标准化，伤口腔用纱布和皮肤贴合。

感染后36小时，所有动物均表现出明显的化脓和炎症症状。就在这一刻，缝线和绷带都被拆除了，伤口腔里的脓液也被彻底冲洗掉了。伤口面积由无菌透明胶片上的线纹确定。然后用3%的过氧化氢处理伤口并进行特殊处理。治疗开始后，每天重复上述创面治疗14天。

对照组伤口用3%双氧水和无菌生理盐水处理。其他亚组用10%头孢唑林或未稀释的盐水代替k . pinnata提取液含总蛋白1 mg/mL(实验制剂含0.7μg / mL CecP1)。

每天对动物进行检查，并固定伤口愈合(炎症、肉芽和成熟(边缘上皮化))的阶段。

在开始治疗后第3、10、14天进行创面恢复百分率的平面分析。在此之后，从实验中撤出一个梯队(每个亚组10只动物)。用过量的乙醚麻醉将动物处死。

不同时间的伤口测量方法如先前所述[37用200片/英寸的分辨率扫描的透明薄片。图像以adobephotoshopcs5extended格式获取。选择对象并通过选择菜单命令“分析”自动计算其正方形。平均值和标准误差()计算。采用以下公式评价回收率:

回复率=(治疗第0天创面-治疗第1天创面)/创面在治疗第0天× 100，其中=创面测量天数。

2．5．创面组织微生物负荷的细菌学分析

0、1 - 0 5 g组织(纤维质量、渗透和底层真皮)从牺牲动物采样在无菌条件下,重分析年级余额(精度0.1毫克),放置在一个无菌陶瓷砂浆,与无菌生理盐水混合在一个比1:10,与无菌均质杵3分钟。匀浆用无菌生理盐水稀释1000倍(随后3步:1:10使用1 mL样品)和100μ将稀释后的所有稀释液接种到添加0.1%葡萄糖的IPA(肉蛋白胨营养琼脂)培养皿中。接种过的培养皿在培养皿中培养°С放置20 h，然后在室温下放置1 d。每1g组织计数菌落，重新计算CFU数量。如果菌落数量在30到300之间，这个计数是有效的。

2．6．统计分析

使用Microsoft Excel 2007和“Statistics”8.0 StatSoft程序对研究结果进行统计分析。计算定量指标的平均值和平均值的标准误差。比较系列和其他系列之间的平均差别的真实性由曼-惠特尼估计测试()．

3.结果与讨论

3．1.生产k . pinnata提取

三个独立k . pinnata转基因株系(~一年生株高2-2,5米)和野生型亲本k . pinnata在恒定的光照/黑暗和温度条件下，在温室中栽培的相同年龄的植物被用来生产提取物。以中层叶片进行CecP1产量的初步检测。取样200-300 mg样本，置于Eppendorf试管中，称重并与NEB缓冲液(10%甘油，4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100 mM nhh)混合₄氯，10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 mg/mL leupeptin, 0.2 mg/mL trypsin inhibitor)，比例20μ每100毫克叶组织中含L。叶片标本用Eppendorf管中的玻璃棒均质，并用Bradford法测量总蛋白(Sigma-Aldrich B6916 ready-to-use kit根据制造商的说明使用)。用NEB缓冲液将提取物调整至总蛋白浓度1 mg/mL，用琼脂扩散法测定其抑菌活性胡萝卜无性系种群。сarotovora．10⁸CFU/板采用上琼脂糖法在90 mm LB培养皿中分布。在琼脂上穿孔，直径5 mmμ将等量的植物提取物滴入每孔。合成CecP1 (1μg/mL)μ以每口井L为标准。测试结果如图所示1．

数据图1可以估计CecP1含量的产量k . pinnata转基因株系的可溶性总蛋白约为0.3 ~ 0.5。选择转基因株系(1)进行提取液的制备。野生型亲本的摘录k . pinnata是并行的。3.0 kg切下的叶片在+4°С黑暗下培养7天。叶子与冰水混合(每1公斤叶子用1.0 L水)，然后用手动电动搅拌器均质。匀浆呈深绿色。经离心澄清于30分钟。绿色的托盘被丢弃了。稻草黄提取物置于0.5 L玻璃烧瓶中，+70℃水浴中灭活酶。提取液经离心澄清静置30分钟，经0.22过滤杀菌μm滤筒(亲水性PNN膜过滤器，中国杭州科斯玛膜技术有限公司)。用橡胶塞和铝盖密封，在+4℃条件下保存于标称体积0.5 L的培养瓶中，直至用于生物试验。

如前所述，用免疫印迹法检测提取物中CecP1的存在[10)(图2)．简单地说,10.0μL的提取物和30.0μ对照合成CecP1 (1μg/mL)， 10%三氯乙酸成球，15%聚丙烯酰胺凝胶变性分离，硝化纤维素膜印迹，兔多克隆抗体染色。

免疫印迹显示CecP1表达上调k . pinnata叶片在冷胁迫条件下。在琼脂扩散试验中进一步证实了提取物的抗菌活性胡萝卜模型如上所述。制造业整体报告k . pinnata含有CecP1的提取物见表1．

３．２．测试感染的伤口愈合金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌是医院脓性感染最常见的病原体。它容易引起多重耐药性。在为期3个月的流行病学研究中发现金黄色葡萄球菌2012年，意大利52个中心的医院感染患病率金黄色葡萄球菌同期医院病原菌分离率为11.6% ()，同时流行甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)中金黄色葡萄球菌为35.8% ()[38］．然而,收集金黄色葡萄球菌菌株ATCC 25923在体外对头孢唑林表现出高度的敏感性，并被选为体内研究头孢唑林有效性的模型对象k . pinnata并与该抗生素进行比较。数据图3.证明伤口恢复率明显高于k . pinnata+ CecP1亚组比对照组(模拟治疗):差异以第三效度阈值()第10和14天。最后伤口的愈合活动k . pinnata+ CecP1与头孢唑林组没有区别:在第10天和第14天，两个亚组进行了比较。野生型k . pinnata提取物表现出一定的有效性(与阴性对照的差异表现为在腌制开始后第10天和第14天的第一个显著性阈值)。然而，创面的愈合活性k . pinnata+ CecP1的提取物明显高于野生型k . pinnata提取(第10天在第14天)。这为CecP1对自身的贡献提供了明确的证据k . pinnata提取的治疗效率。

当比较动物亚组之间的伤口恢复阶段时，得到了积极的结果。数据图4证明在没有特殊治疗的情况下，所有三个实验组的炎症期结束速度比对照组快2倍。然而，开始造粒阶段k . pinnata子组(但不在k . pinnata+ CecP1)比头孢唑林亚组早1天发现(亚组间第一阈值的差异以第一阈值显著为特征，)．边缘上皮化(成熟期)几乎快2天k . pinnata和k . pinnata+ CecP1亚组比头孢唑林亚组()．综上所述，这些数据证明……的良好效果k . pinnata提取抗生素不可替代的感染伤口愈合成分，增强抗菌活性。

3．3．试验伤口感染的愈合与组合金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌

混合脓性感染通常比单胞感染更重，治疗起来也更困难。Men 'shikov等人[39报道了复合感染金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌与烧伤患者最不利的预后有关。相比金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌通常对头孢唑林有耐药性[35];因此混合性感染的治疗结果金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌不可以预测的。

伤口感染等量的实验研究金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌证明他们的恢复在对照组亚组中(未经治疗)没有显著差异金黄色葡萄球菌单核细胞感染甚至发生得更快(图5)．然而,治疗金黄色葡萄球菌+铜绿假单胞菌使用头孢唑林的效果明显不如金黄色葡萄球菌mono感染()．混合感染组内对照组与头孢唑林亚组比较，差异无统计学意义()．因此，头孢唑林对混合性化脓性感染的治疗无效。

使用野生型k . pinnata对混合感染的治疗效果优于头孢唑林。之间的区别k . pinnata而对照组的特征是第14天(10天)。在此背景下，效率k . pinnata+ CecP1提取物的控制看起来非常有希望:第10天治疗开始后第14天。

当比较混合感染组动物的伤口愈合时间时，发现头孢唑啉比伤口愈合百分比更有效(图6)．头孢唑林与对照组的差异表现为所有三个参数(炎症结束，肉芽形成开始，边缘上皮形成开始)。

另一方面，比较k . pinnata和p . pinnata+ CecP1亚组在炎症结束时间上无差异()，而肉芽化和边缘上皮化则在早期开始k . pinnata子群。这个模棱两可的结果不能仅仅用CecP1的作用来解释。显然，免疫调节作用k . pinnata生物活性化合物(类黄酮或凝集素)的肉芽化和上皮作用比抗菌作用更明显;CecP1的作用和这些化合物的产量在对照中较高k . pinnata而在表达CecP1的转基因植株上的表达量较少。反过来，这一假设与头孢唑啉对创面愈合期的时间而非创面恢复率的明显影响并不一致。

3．4．杀微生物剂活性测试k . pinnata提取物在体内

伤口愈合的平面测量研究为抗菌手段的治疗效果提供了关键信息。然而，他们必须补充关于微生物制剂在伤口床上存活的直接数据。这些数据对优化处理方案很重要。

数据图7显示塌陷的细菌负荷金黄色葡萄球菌随着伤口的愈合。这一现象甚至在对照组(未治疗)中也很明显;然而，在实验亚组中，它要大得多。另一方面，即使在试验的第14天，所有亚组都有残留细菌。所有四个亚组在试验第3和第10天的细菌负荷之间存在显著的统计学差异()依次为:对照>头孢唑啉>k . pinnata>k . pinnata+ CecP1。相比之下，在开始治疗后的第14天，在细菌负荷方面，亚组之间没有发现有效的差异。这一观察证明了体内存在“难民”，病原体甚至可以对具有高杀微生物效力的药物进行掩盖。这一作用可能通过为病原菌提供适应治疗所需的时间而有助于提高细菌的耐药性。

的杀微生物活性图k . pinnata抗组合提取物金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌大致重复杀菌剂活性的图片金黄色葡萄球菌mono感染(图8)．各组间细菌负荷均有统计学意义()的第10天(不是第3天)。头孢唑林对混合感染的杀微生物效果较弱，但并非为零。野生型的萃取物k . pinnata效率不如k . pinnata+ CecP1 ()，试验第10、14天。然而，混合感染在试验第14天的残留细菌量远高于混合感染金黄色葡萄球菌mono感染。

4.结论

转基因的k . pinnataCecP1最高的在获得1年后选择。冷应力诱导切坯CecP1合成k . pinnata在+4℃下培养7天，CecP1的产量提高了1.5-2倍。建立了一种简便、高效的水提CecP1的方法k . pinnata叶子成立。与常用的乙醇萃取法相比[21，22，它可以保存中所描述的凝集素高凉菜属［25]，并显示淋巴增生活动[20.］．然而，在+70°C加热的过程中，这些蛋白质可能会由于变性而丢失。在+4℃下贮藏7天，必须加热提取物才能使降解CecP1的蛋白酶失活。

根据我们的数据，摘录k . pinnata(野生和转基因)在应用浓度(每剂量1 mL提取物，总蛋白浓度1 mg/mL)下，未表现出对伤口床的任何细胞毒活性或对动物的一般毒性，尽管这种毒性以前被归因于两者k . pinnata提取(19]及合成CecP1 [3.］．野生型水提取物k . pinnata表现出杀微生物活性和伤口愈合活性，尽管其本身的杀微生物活性低于头孢唑林。相比之下,k . pinnata+ CecP1提取物表现出相同的杀微生物活性金黄色葡萄球菌如头孢唑林。的活动k . pinnata+ CecP1提取物抗组合金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌明显优于头孢唑林。

值得注意的是，即使在实验的第14天，这些检查的制剂都不能完全消除创面上的细菌。在此期间，三种杀菌剂的残留细菌量都很接近。尽管残留的活菌数量很少，但这种作用可能导致病原菌耐药加剧，应加以控制。

总的来说，是k . pinnata含0.7的转基因植物μg/mL CecP1可用于外用。首先，应将其作为治疗糖尿病患者营养性溃疡的候选药物进行试验。

相互竞争的利益

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了俄罗斯联邦教育和科学部的资助。14.607.21.0016，唯一标识符RFMEFI60714X0016)。

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